一、Dispase在成年鼠骨骼肌干细胞纯化中的价值（论文文献综述）
庄燕[1]（2020）在《神经遗传疾病及认知障碍相关基因的RNA选择性剪接调控机制研究》文中指出RNA选择性剪接（AS）是基因产生转录组、蛋白质组复杂性和多样性的关键机制,并在神经系统发育与正常功能维持中广泛存在。既有大量研究显示,AS的错误调控与人类神经退行性和认知疾病如阿尔茨海默症（Alzheimers disease,AD）、肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）、强直性肌营养不良（Myotonic dystrophy,DM）以及神经发育疾病自闭症（Autism spectrum disorder,ASD）等相关。但是,在众多已经检测到的AS事件中,究竟哪些事件提供了重要的生物学功能并未完全探明。因此,系统探索和定义AS在疾病背景下的作用,对了解人类遗传性神经疾病的发生、发展的分子基础具有重要意义。针对RNA选择性剪接与神经精神疾病发生相关联的机制,本项研究工作分为以下两部分:一、探究RNA剪接因子HNRNPA1在神经退行性疾病中的新作用。我们的研究揭示了RNA剪接因子HNRNPA1是1型强直性肌营养不良（Myotonic dystrophy type 1,DM1）的一个新致病因子。它在DM1中的作用与CELF1（已经被证明的DM1致病明星分子）相类似。HNRNPA1蛋白水平在正常发育过程中会逐渐下调,但在DM1患者中却表现出明显的上调,同时也可以促进DM1相关基因剪接形式由成年向胚胎形式的转变。但是HNRNPA1与CELF1作用的DM1靶位点池并不完全重叠。我们的研究结果证明DM1疾病特别是选择性剪接异常的发生是MBNLs功能丧失,CELF1和HNRNPA1异常上调所致的综合作用结果;二、探索认知障碍基因即ASD相关基因Neurexins（Nrxns）选择性剪接调控的机制及生理意义。我们的研究结果表明,Nrxns小外显子AS3、AS6的AS可受神经特异性RNA剪接因子SRRM3、SRRM4调控,其选择性剪接依赖于神经活性的变化。并且,我们的实验结果还表明,Nrxns小外显子AS3、AS6的AS会影响Nrxns对突触后标记分子PSD95和Gephyrin的募集,提示AS3、AS6的选择性剪接可能也参与调控兴奋性与抑制性突触的平衡。但是对于Nrxns小外显子AS与高级神经活动更为相关的潜在生理学意义,目前还缺乏研究证据,仍需要进一步探索。
邓天健[2]（2020）在《双峰驼骨骼肌卫星细胞形态学观察与体外培养》文中研究说明双峰驼是体格最大、寿命最长、生活环境较为特殊的草食家畜之一,骨骼肌又是机体重要动力器官。经国内外长期科研探索骨卫星细胞已在多种动物以及人类群体中成功建立模型,双峰驼为我国特有的经济生产牲畜,至今仍未有对其骨骼肌卫星细胞进行系统研究。深入了解双峰驼骨骼肌卫星细胞、骨骼肌调控机制对增肉、增产方面具有潜在意义。本实验以阿拉善双峰驼骨骼肌组织为样本材料,对肌肉样本进行超薄切片处理使用场发射透射电子显微镜对肌肉样本进行拍摄,并寻找肌膜与基底膜之间的骨骼肌卫星细胞;采取组织块培养法培养原代,结合差速贴壁法纯化原代骨骼肌卫星细胞,通过生长曲线分析确定卫星细胞的增殖模式;对骨骼肌卫星细胞中特异性基因PAX7用免疫荧光标记法经过激光共聚焦成像鉴定;使用PCR扩增方法对样本进行PAX7,MYF5,Desmin基因检测;对卫星细胞进行诱导培养后使卫星细胞进行成肌分化诱导骨骼肌卫星细胞发育为肌管结构。通过上述方法旨在获得较纯的阿拉善双峰驼骨骼肌卫星细胞,并对卫星细胞机理形态进行相关研究。实验结果如下:（1）对三至六月龄双峰驼股二头肌肌肉样本进行透射电子显微镜拍照研究,于肌肉组织的肌膜与基底膜之间分别找到激活态与未激活态的骨骼肌卫星细胞。观测到卫星细胞形态呈椭圆形,截面长约5-10um,宽度约为4-7 um。激活态的卫星细胞形状不固定,胞体被不完整包被有部分细胞胞体突破肌膜,其截面以及体积略大于未激活态卫星细胞。激活态的卫星细胞内有大量电子戎积物贴于骨骼肌卫星细胞细胞膜内部,较之未激活态卫星细胞细胞膜形状固定内部线粒体明显少于激活态卫星细胞细胞且内部电子戎机物分散较少,两者卫星细胞胞体内部具无线粒体外明显细胞器;（2）针对三至六月龄双峰驼进行肌肉采样,通过两种培养方法进行原代骨骼肌卫星细胞培养并进行比较。结果显示组织块培养法较两步酶细胞培养法更加适合远距离采样后的无菌原代细胞分离,最终产出细胞活性较强,不易污染,培养周期较长,更适用于双峰驼卫星细胞的体外培养;（3）通过免疫荧光染色与PCR扩增方法对传代细胞进行鉴定。结果经抗体PAX7孵育后的样本在激光共聚焦显微镜下观察呈阳性,染色过后的亮斑集中而密集占有当前培养平板大部,证明细胞纯度达到80%,PCR扩增后显示PAX7,MYF5,Desmin基因均有相应条带,最终证明体外培养细胞为纯度较高的骨骼肌卫星细胞;（4）对前期培养的骨骼肌卫星细胞进行诱导分化,使用分化培养基进行骨骼肌卫星细胞进行成肌诱导。在更换诱导培养基后48小时后卫星细胞开始初步分化卫星细胞胞体明显拉长由短梭型转变为长条状,在更换培养基后一周时长后卫星细胞呈现明显分化状态长条状的卫星细胞明显聚集成束,可以观测到明显的肌管雏形构造。
代阳[3]（2016）在《microRNA-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制研究》文中研究指明已有研究证明microRNA（miRNAs）在肌肉细胞增殖和分化过程中发挥了重要作用,目前有关miRNAs对牛肌肉生长发育影响的相关研究还比较少,本研究通过建立牛骨骼肌卫星细胞体外成肌诱导分化模型,结合前期研究结果,对miR-128在牛骨骼肌卫星细胞增殖及成肌分化过程中所起到的调控作用进行了深入研究。1.本研究采用胶原酶联合胰酶的酶消化法,从牛胎儿中分离肌卫星细胞,利用差速贴壁法进行纯化,对纯化后的卫星细胞进行了诱导分化,并对标志性基因进行了RT-PCR及免疫荧光染色检测。结果表明,纯化后的肌卫星细胞标志性基因Pax7呈阳性表达,且通过阳性细胞所占比例计算分离出来的卫星细胞纯度在93%以上;肌管标志性基因肌球蛋白重链（MHC）呈阳性表达,表明分离出来的肌卫星细胞具有良好的体外分化能力。本研究建立了牛骨骼肌卫星细胞分离鉴定和体外成肌诱导的方法,可以为肌肉发育分化和后续研究提供良好的细胞模型。2.前期研究中,我们发现miR-128在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化中表达水平显着上调,本研究中我们深入探讨了miR-128在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化过程中的生物学作用。通过双荧光素酶实验确定了miR-128可以直接调控Sp1基因。miR-128的过表达可降低Sp1蛋白水平,并且抑制肌肉细胞的增殖与分化。抑制miR-128表达不仅可以提高Sp1蛋白水平,而且可以促进肌卫星细胞的分化,同时对其增殖也具有抑制作用。改变miR-128和Sp1基因的表达水平也可以影响MyoD和CDKN1A的蛋白表达水平。研究结果也表明,Sp1作为MyoD活化剂和CDKN1A抑制剂,在牛骨骼肌细胞的增殖分化中起重要的调控作用,我们的研究结果显示miR-128可通过靶向Sp1进而调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化过程。3.由于在牛身上进行体内实验难以操作,本研究进一步研究了miR-128在小鼠失神经肌萎缩模型中对肌纤维的影响。结果表明miR-128可以影响肌纤维的发育,抑制miR-128表达后显着增加了肌纤维的直径,说明miR-128在体内对肌肉发育也具有一定的调控作用。本研究系统的阐明了miR-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的调控机制,可以为miRNAs调控成肌分化的机制研究提供参考,并为肉牛新品种培育提供新的思路和有益的线索。
刘通[4]（2016）在《电针“委中”穴对腰多裂肌卫星细胞增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响》文中研究表明多裂肌位于脊柱最内侧,是附着面积最大的椎旁肌,由多束组成,从颈部到骶部均有分布。其中腰多裂肌以腰椎的棘突为中心向两侧斜下方辐射,其作用主要是向斜下方牵拉棘突,从而保证腰椎的稳定性。腰多裂肌的损伤、萎缩以及功能紊乱与各种急慢性腰痛的发生密切相关。因此,促进损伤多裂肌的修复和功能重建有非常重要的临床意义。肌卫星细胞（Muscle Satellite Cell, MSCs）属于骨骼肌干细胞,肌肉损伤后,MSCs的激活、增殖和成肌分化与融合是肌肉修复过程中必不可少的环节。生理情况下,MSCs通常处于静止状态,一旦细胞的基膜遭到破坏,便开始激活、增殖、分化、融合成为新生的肌纤维。因此,MSCs的研究对于进一步理解肌肉的损伤修复和发病机制均有重要的价值。近年来,大量关于针刺治疗骨骼肌急慢性损伤的研究已经证实,针刺能促进MSCs增殖高峰期提前,促进肌肉修复,加速损伤愈合进程。“委中”穴属于足太阳膀胱经穴,对腰背部疾病有特异性的疗效,“腰背委中求”是委中穴对腰背部疾病特异性疗效的经验总结。我们前期实验已经证明电针“委中穴”能促进肌肉修复期MSCs的增殖、分化以及组织再生修复的成熟度,加快大鼠损伤多裂肌的再生修复。在前期研究中,我们发现电针“委中”穴在治疗第4天时,对生肌调节因子表达的影响最为显着,在治疗第7天时其表达即出现了下降,说明电针“委中”穴在肌肉恢复初期的作用更为活跃。因此,本研究拟从在体和离体两方面结合观察电针“委中”穴在肌肉恢复初期（4天时）对多裂肌组织的再生修复作用,以及对Pax7、Myod蛋白与PI3K/Akt/mTOR信号通路相关信号分子表达的影响,进一步探求电针“委中”穴对腰部多裂肌损伤后再生修复的作用机制。实验一：电针“委中”穴对腰多裂肌损伤模型大鼠Pax7、Myod表达的影响目的：在体观察电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤模型肌肉再生修复的影响。方法：雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、模型对照组、电针“委中”组、电针“肾俞”组,通过布比卡因局部肌肉注射的方法复制大鼠多裂肌损伤模型,电针“委中”组和电针“肾俞”组分别于模型建立后24h开始治疗,1次/日。于治疗第4天取材,HE染色观察各组大鼠腰多裂肌纤维损伤及修复情况,采用Western-blot方法观察各组肌肉组织中Pax7、Myod蛋白的表达。结果：（1）HE染色结果显示：正常组和模型对照组肌纤维细长均匀,排列整齐,纤维与纤维之间间隙匀称,细胞核均匀排列在肌细胞周围,模型对照组偶见细胞间质轻微水肿。模型组可见肌纤维广泛变性样坏死,巨噬细胞浸润明显,偶见未受损纤维束。电针“委中”组和电针“肾俞”组已经出现肌纤维的再生,纤维直径较大,已有部分细胞核向细胞周围迁移。（2） Western-blot结果显示,模型组Myod蛋白表达与正常组和模型对照组之间无显着性差异（P>0.05）,电针“委中”组和电针“肾俞”组Myod蛋白表达优于其余三组（P<0.05）,而电针“委中”组略优于电针“肾俞”组（P<0.05）。各组之间Pax7蛋白表达均无显着性差异（P>0.05）。结论：（1）电针“委中”穴和电针“肾俞”穴均能明显提高损伤局部Myod的表达,促进MSCs的成肌与分化；而对Pax7的表达无明显促进作用,可能与电针在促进成肌分化初期,细胞持续高表达Myod,却下调了Pax7蛋白的表达有关。（2）电针“委中”穴在损伤早期促进肌肉修复的作用略优于电针“肾俞”穴。实验二：单根肌纤维法分离培养大鼠多裂肌MSCs及鉴定目的：应用单根肌纤维法分离培养大鼠多裂肌MSCs并进行鉴定。方法：取大鼠1只,麻醉致死后,分离多裂肌,应用单根肌纤维法分离出单个MSC,并进行诱导分化,分别通过MSCs增殖与分化期不同的肌肉相关特异性标志蛋白进行鉴定。结果：（1）形态学观察：原代细胞经消化后,显微镜下观察,细胞呈圆形,高折光性。重新接种后12h,细胞大部分已经贴壁,伸展为长梭形或纺锤形,接种后3天,细胞明显增殖,接种后5天,MSCs开始出现方向性排列,接种后8天,MSCs方向性更加明显,并且有多核肌管形成。（2）免疫荧光鉴定：Pax7、Myod在MSCs增殖过程中核表达均为阳性。以含10μMIGF-1和2%马血清的分化培养基成肌诱导后,可出现肌管,Desmin在分化初期细胞质中表达为阳性。细胞贴壁7天后,不经诱导也可有肌管形成。结论：应用单根肌纤维法可以成功分离大鼠腰多裂肌MSCs, MSCs相关特异性标志物表达为阳性,经过成肌诱导,分离出的MSCs有分化为肌管的能力。实验三：电针血清对MSCs增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响目的：体外观察电针血清对MSCs增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。方法：实验一中正常组、模型组、电针“委中”组、电针“肾俞”组在取材后分别获取各组血清,将不同处理组的血清分别加到实验二分离并鉴定过的多裂肌MSCs中共同培养,电针“委中”血清组和电针“肾俞”血清组分别于加血清前2h加入P13K抑制剂LY294002,干预24h后,分别采取CCK-8、Edu检测电针血清对MSCs增殖能力的影响,同时采取Western-blot和RT-PCR的方法检测Pax7、Myod以及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关信号分子蛋白和mRNA的表达。结果：（1）CCK-8结果显示,与空白组相比,正常血清组、模型血清组、电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组OD值明显增加（P<0.01）,模型血清组OD值优于正常血清组（P<0.01）,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组OD值优于模型组（P<0.01）,加用LY294002后,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组OD值明显下降（P<0.01）,电针“委中”血清组OD值与电针“肾俞”血清组之间无显着性差异（P>0.05）。（2）Edu结果显示,模型血清组、电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组中Edu阳性细胞比例明显优于正常血清组（P<0.05,P<0.01,P<0.01）,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组优于模型血清组（P<0.01,P<0.05）,加用LY294002后,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组Edu阳性细胞比例明显下降（P<0.01,P<0.05）,电针“委中”血清组与电针“肾俞”血清组之间无显着性差异（P>0.05）。（3） Western-blot结果显示,各组之间Pax7蛋白表达无显着差异；Myod蛋白表达模型血清组高于正常血清组（P<0.05）,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组优于模型血清组（P<0.05,P<0.01）,电针“委中”与电针“肾俞”血清组之间无显着性差异（P>0.05）,LY294002明显下调电针“委中”与电针“肾俞”血清组Myod的表达（P<0.05,P<0.01）；p-Akt表达模型血清组优于正常血清组（P<0.05）,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组优于模型血清组（P<0.01,P<0.05）,电针“委中”与电针“肾俞”血清组之间无显着性差异（P>0.05）, LY294002明显下调电针“委中”与电针“肾俞”血清组p-Akt的表达（P<0.01, P<0.01）。p-mTO R表达模型血清组高于正常血清组,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组与模型血清组之间无显着性差异（P>0.05）。（4）RT-PCR结果显示,各组之间Pax7及Myod基因的mRNA表达均无显着差异,与Western-blot结果相反,模型血清、电针“委中”血清、电针“肾俞”血清Pax7、Myod的基因表达均有低于正常血清的趋势,与抑制剂组相比,电针“委中”血清、电针“肾俞”血清Pax7、Myod的基因表达也出现了降低的趋势。结论：（1）电针“委中”血清和电针“肾俞”血清均可促进MSCs的增殖,且有促进成肌分化的趋势,与PI3K/Akt通路有关,但电针血清对Pax7、Myod基因表达的规律仍需进一步的研究。（2）电针“委中”与电针“肾俞”穴的效应机制除血清途径外,可能还存在其他的作用途径。
宋艳玲[5]（2012）在《重组质粒载体pEGFP-N2-SMDF体外转染小鼠肌源性干细胞及其鉴定》文中提出【研究背景】肌源性干细胞（muscle-derived stem cells, MDSCs）是一类新近发现的成体干细胞，可以从动物的骨骼肌中分离获得，具有干细胞的自我更新和多向分化的潜能。MDSCs在体内/外分化成肌肉细胞时不需要特定的刺激，但让MDSCs分化成骨骼肌细胞以外的其它谱系细胞时，可能需要特殊的生长因子刺激或将其置于适宜的环境中。越来越多的研究表明，MDSCs在特定组织的发育、组织再生及修复和基因治疗方面的巨大潜能。有证据显示，MDSCs能够促进肌纤维的再生，增强再生肌组织的功能，并具有分化为神经外膜组织细胞和具有雪旺细胞（Schwann cells,SCs）表型细胞的潜能，为神经组织工程研究中寻找雪旺细胞替代物带来了希望。Neu基因调节素-1（neuregulin-1,NRG1）是一种由膜携带或分泌的多肽，属于表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）家族，主要是由神经元产生，能与ErbB酪氨酸激酶受体相结合，引起广泛的生物学效应。根据其N端结构域的不同可将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3种亚型。最近的研究表明轴突中NRG1Ⅲ型（sensory and motor neuron-derivedfactor,SMDF）的水平是髓鞘形成的一个关键指标。它不仅能促进雪旺细胞的增殖、分化，而且还调节轴突的髓鞘化及髓鞘的厚度。SMDF的分泌在胚胎期和新生期达到高峰，而成年后的表达明显减少。在周围神经损伤后，雪旺细胞及神经支配的靶器官—肌组织中均可见其表达，然而其表达量不足以支持成年轴突完成再髓鞘化过程，仅能形成包绕轴突的薄髓鞘和变短的节间长度。也有研究显示，雪旺细胞自身可以产生NRG1（Ⅲ型α2同源体），以自分泌或旁分泌的形式促进雪旺细胞增殖，并参与到清除病变轴突和髓鞘的过程中。周围神经损伤后，雪旺细胞分化和增殖是轴突再生的必备条件，而SMDF是髓鞘厚度的关键调节因子。因此，提高周围神经损伤处SMDF蛋白水平为雪旺细胞的髓鞘化过程提供了一个潜在的治疗策略。【研究目的】（1）采用新生小鼠坐骨神经培养纯化后的雪旺细胞条件培液，诱导小鼠MDSCs向雪旺细胞方向分化，为组织工程研究寻找新的雪旺细胞替代物；（2）克隆SMDF基因和构建SMDF真核表达载体，为进一步的功能研究提供有力的工具；（3）鉴定转染pEGFP-N2-SMDF的MDSCs，研究SMDF基因在mRNA和蛋白水平的表达，进一步证实构建的载体能有效的转导目的基因；（4）证实SMDF基因可促进类雪旺细胞的增殖、分化的，进一步验证SMDF蛋白的功能，为研究周围神经损伤后SCs髓鞘化过程及分子机制奠定了实验基础。【研究方法】（1）应用改良的Preplate技术，从新生小鼠骨骼肌中分离MDSCs，利用抗体Desmin和Sca-1对分离得到的MDSCs进行免疫细胞化学鉴定；（2）从新生小鼠坐骨神经分离纯化雪旺细胞，利用抗体P75NTR、S-100β进行鉴定并收集雪旺细胞的条件培液用以诱导MDSCs分化为类雪旺细胞；（3）利用Western Blot对不同组织中SMDF蛋白的表达情况进行分析，利用免疫组织化学的方法鉴定SMDF在DRG中的表达；（4）针对小鼠SMDF基因mRNA全序列设计引物，Trizol法提取新生小鼠DRG总RNA，通过RT-PCR得到SMDF基因编码区全序列，利用DNA重组技术将该基因片段重组到pEGFP-N2真核表达质粒上，构建重组真核表达载体pEGFP-N2-SMDF，并通过PCR、酶切及测序的方法进行鉴定；（5）应用脂质体介导的方法将真核表达载体pEGFP-N2-SMDF和空质粒pEGFP-N2转染体外培养的MDSCs，通过PCR、Western-blot方法检测转染前后SMDF基因和蛋白的表达情况。（6）采用雪旺细胞条件培液诱导转染SMDF基因的MDSCs分化为类雪旺细胞，并采用免疫细胞化学的方法进行鉴定。【结果】（1）应用改良的Preplate技术，从小鼠骨骼肌中分离得到MDSCs，能在体外稳定增殖传代，Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性；（2）从新生小鼠坐骨神经中分离纯化得到雪旺细胞，将收集的雪旺细胞条件培液加入MDSCs中，成功诱导出能表达雪旺细胞特异性标记物P75NTR、S-100β的细胞；（3）将小鼠DRG中的SMDF基因克隆至真核表达载体pEGFP-N2上，双酶切、PCR和DNA测序鉴定结果表明，插入的序列与GenBank上小鼠SMDF基因CDS序列完全符合；（4）pEGFP-N2-SMDF真核表达载体转染MDSCs后，荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达；PCR和Western-blot结果显示，重组载体pEGFP-N2-SMDF转染后的细胞中SMDF mRNA水平和蛋白水平的表达明显高于空质粒组及未转染组细胞，而后两者间比较无统计学差异；转染SMDF基因的MDSCs，经雪旺条件培液诱导后可分化为类雪旺细胞，且S-100β的阳性率明显高于直接诱导的类雪旺细胞。【结论】（1）采用雪旺细胞条件培液，能够将新生小鼠骨骼肌中分离得到的MDSCs诱导分化为类雪旺细胞，为组织工程神经研究找到了新的种子细胞替代物；（2）成功将重组的真核表达载体pEGFP-N2-SMDF转染至MDSCs中，转染后的细胞中SMDF的mRNA水平和蛋白水平都显着增高，同时证实SMDF基因可促进类雪旺细胞的增殖、分化，为进一步研究周围神经损伤后雪旺细胞髓鞘化过程及分子机制奠定了实验基础
陈立[6]（2012）在《大鼠肌卫星细胞体外培养及移植延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：探索大鼠肌卫星细胞体外培养的技术方法,并观察其体外增殖、分化的特征。将体外培养的肌卫星细胞移植至失神经支配的骨骼肌,观察其体内存活,分化,及形成肌管的过程,并评判肌卫星细胞移植对于延缓失神经骨骼肌萎缩的作用。方法：第一部分：大鼠肌卫星细胞的体外培养与鉴定以成年Wistar大鼠后肢肌为取材组织,采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶,以“两步法”消化分离肌卫星细胞,并采用差速贴壁法纯化。培养肌卫星细胞的增殖培养基采用Ham’s F10+20%FBS+5ng/ml bFGF,分化培养基采用Ham sF10+2%FBS+2%HS。观察体外培养的肌卫星细胞增殖、分化及融合形成肌管的状态。采用免疫荧光技术,对静止和激活的肌卫星细胞分别选择其特征性标志物PAX7和MyoD为标志,对分化肌细胞选择肌细胞骨架蛋白Desmin和a-SCA为标志,分别进行细胞鉴定。第二部分：肌卫星细胞移植与体内分化的观察体外培养的肌卫星细胞经纯度鉴定之后,以带e-GFP基因的腺病毒转染示踪,并移植至失去胫神经支配之腓肠肌。分别在移植之后1周、2周、4周取材腓肠肌组织,制作连续冰冻切片。荧光显微镜下观察,带GFP绿色荧光的移植细胞存活、分化及形成肌管的状态。第三部分：肌卫星细胞移植延缓失神经肌萎的疗效观察选取成年Wistar大鼠24只,于右后肢切断胫神经,建立失神经肌萎模型。将其随机分为两组,其中12只Wistar大鼠于右侧腓肠肌注射肌卫星细胞悬液（移植组）,另外12只仅注射细胞培养液（对照组）。移植4周后,选取移植组与对照组各6只大鼠,取材双侧腓肠肌,称肌湿重后,制作石蜡切片,行HE染色与Masson染色,比较肌纤维平均截面积与胶原纤维增生状态。剩余大鼠取材右侧腓肠肌,制作冰冻切片,行ATP酶组织化学染色,比较移植组和对照组肌组织中ATP酶的含量。结果：采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶联合消化,并用差速贴壁法纯化的方法,可在体外获得高纯度的大鼠肌卫星细胞。体外培养的大鼠肌卫星细胞可在合适条件下分化,并相互融合形成肌管。培养所得细胞在分化前表达静止期肌卫星细胞特征性标志物Pax7,在激活后表达MyoD,在分化后表达肌细胞特有骨架蛋白Desmin（结蛋白）和α-SCA（α横纹肌肌动蛋白）。外源性肌卫星细胞移植后,可在肌组织内存活、分化、相互融合形成肌管。肌卫星细胞移植组的腓肠肌,在肌湿重、肌纤维平均截面积、胶原纤维增生及ATP酶改变各方面,均较对照组有改善,其差异具有统计学意义。结论：通过分离消化大鼠肌组织,可在体外获得高纯度的具有成肌能力的肌卫星细胞。将肌卫星细胞移植于失神经支配的骨骼肌,能够发挥延缓肌肉萎缩的作用。
朱铠[7]（2012）在《超支化纳米载体转基因修饰骨骼肌成肌细胞治疗缺血性心脏病的研究》文中研究指明第一部分小鼠成体骨骼肌成肌细胞提取及纯化方法的改进研究背景作为成体种子细胞及基因治疗工程细胞,高纯度骨骼肌成肌细胞（skeletal myoblasts, SkMs）在缺血性心脏病的治疗中展示了良好的临床应用前景。如何快速、高效、经济地获取足量的高纯度SkMs一直在不断地进行摸索、改进。研究目的建立一种快速、高效的小鼠成体SkMs提取、纯化的实验方法。研究方法通过布比卡因预处理激活肌骨骼肌中的SkMs,48h后,配制优化混合酶,通过一步消化分离法及改良纯化法,从成年骨骼肌中分离高纯度SkMs,并与普通差速贴壁法、反复差速贴壁法及Percoll非连续密度梯度离心法等传统纯化方法分离的SkMs的纯度相比较。研究结果通过改良提取、纯化法所得到的SkMs纯度可达到92.59±1.29%,明显高于普通差速贴壁法、反复差速贴壁法及Percoll非连续密度梯度离心法（P<0.05）,并具有很好的增殖及分化能力。研究结论通过采用改良成体SkMs提取及纯化法,能快速高效地获取高纯度SkMs。研究背景基因治疗正逐步被应用于多种疾病的防治,前景十分广阔。而在基因转染的过程中,最关键的核心问题是如何选择理想的基因载体。研究目的探讨一种新型的非病毒基因载体——超支化聚酰胺胺（hyperbranched polyamidoamine, h-PAMAM）纳米颗粒在基因转染中的效率、毒性及转染后的基因表达情况。研究方法以“改良一锅法”合成h-PAMAM纳米颗粒,将核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）及h-PAMAM以不同的质量比复合构建h-PAMAM-DNA复合物,观察其粒径大小及Zeta电位情况；在核酸内切酶的作用下,观察纳米颗粒对质粒的保护作用；以h-PAMAM-DNA复合物转染COS7及HEK293细胞系,测定在不同质量比情况下的转染效率及细胞存活率,得出最优化的转染方案：h-PAMAM介导的人血管内皮生长因子165（human vascular endothelial growth factor165, hVEG165）基因转染后,测定hVEG165基因在转染后的表达情况。研究结果h-PAMAM-DNA复合物的粒径及zeta电位随着h-PAMAM/DNA质量比的增加而提高,h-PAMAM能保护质粒不受核酸内切酶的消化,保持其完整性和稳定性长达2小时。h-PAMAM介导质粒转染时,最佳转染条件下,转染效率可达47A7±1.42%（COS7细胞）及40.8±0.98%（HEK293细胞）,此时细胞毒性较轻微,细胞存活率较高（COS7:91.38±0.46%；HEk293:92.38±O.61％）；h-PAMAM介导的hVEG165基因转染后,hVEG165能表达14天之久,峰值出现在第2天。研究结论作为一种新型非病毒基因载体,h-PAMAM介导了一种经济、高效、安全的基因治疗方法。研究背景骨骼肌成肌细胞（skeletal myoblasts, SkMs）移植协同血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）基因治疗是一种有潜力的治疗缺血性心脏病的方案。然而,有待优化的基因载体及不可调控的血管内皮生长因子的表达阻碍了基因治疗的应用。因此,寻求一种经济、高效、可控的基因转染平台非常是有必要的。研究目的本实验中,我们探讨了超支化聚酰胺胺（hyperbranched polyamidoamine, h-PAMAM）纳米颗粒介导的低氧可调控性人血管内皮生长因子165（hypoxia regulated human vascular endothelial growth factor, HRE-hVEGF165）基因转染协同SkMs移植治疗缺血性心脏病的可行性及有效性。研究方法将核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）及h-PAMAM纳米颗粒以不同的质量比复合构建h-PAMAM-DNA复合物,以复合物转染SkMs,测定在不同质量比情况下的转染效率及细胞存活率,得出最优化的转染方案；免疫染色、Realtime-PCR及Elisa法测定其基因转染后的表达情况。将h-PAMAM-HRE-hVEGF165复合物修饰的SkMs移植至C57/BL6小鼠的缺血心肌中,探讨心肌细胞凋亡情况,移植干细胞存活率,心梗面积及胶原沉积,血管密度及心功能。研究结果h-PAMAM介导质粒转染SkMs时,最佳转染条件下,转染效率可达43.47士2.22%,此时细胞毒性较轻微,细胞存活率较高（91.38±0.48%）。在低氧情况下,h-PAMAM介导的HRE-hVEG165基因转染时能表达hVEGF165基因18天之久。h-PAMAM-pHRE-hVEG165修饰的SkMs移植至缺血心肌后,过表达的VEGF可导致心肌凋亡的减少,移植成肌细胞存活率的增加,梗死面积及胶原沉积的减少,血管密度的增加,从而抑制左室的重构,提高了心功能。研究结论h-PAMAM介导的HRE-hVEGF165基因转染SkMs是可行、有效的,并且是一种新型的有前景的缺血性心脏病的基因治疗策略。
岳明宗[8]（2012）在《大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：应用大鼠阴茎海绵体分离、培养肌源性干细胞（muscle derived stem cellsMDSCs），检测干细胞标志物的表达；将大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞进行传代培养，观察其自我更新及持续增殖能力；检测分离细胞在特定条件下向平滑肌细胞分化的潜能。方法：取2月龄SD雄性大鼠为实验对象，用percoll密度梯度离心法结合改良的preplate差速贴壁分离、纯化大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞，利用免疫荧光细胞化学法、流式细胞技术检测PP6细胞肌源性干细胞标记物Sca-1、Desmin的表达情况，分离细胞进行传代培养利用细胞计数法测定第3、6、8代细胞的生长曲线，免疫荧光法实时检测传代细胞Sca-1、Desmin的表达，采用与分离所得的大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞共培养的方法诱导分离而得的细胞分化为平滑肌细胞，并运用免疫荧光细胞化学的方法检测特异性平滑肌肌动蛋白（a-sma）的表达。结果：用percoll密度梯度离心法结合改良的preplate差速贴壁分离培养所获PP6细胞中大部分体积较小，贴壁很慢，遮光性好，多成球形、纺锤形、梭形，培养72h后，显微镜下可见细胞数量明显增多并均匀散在分布，以纺锤形及梭状为主，少数形态不规则，5-7d可见悬浮细胞基本消失，贴壁细胞分裂增殖明显，细胞密度明显增加，细胞体积增大，细胞形态出现较大变化，可见长梭形、长棱形的细胞贴壁生长，培养12～14d,贴壁细胞继续繁殖，细胞密度增大，并逐渐融合，培养至14-16d，原代细胞可达到80-90％汇合。传代培养中细胞呈贴壁均匀生长状态，细胞增殖迅速。倒置显微镜观察细胞形态无明显变化，取第3、6、8代细胞绘制生长曲线，结果显示：细胞群体倍增周期约48小时，体外培养7天左右可进入生长的平台期；传代培养至第8代，细胞的增殖能力无明显改变；将生长状态良好的第三代分离所得细胞与大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞共培养2天后，免疫荧光细胞化学法可检测到核标记的肌源性干细胞有平滑肌肌动蛋白（a-sma）的表达。结论：大鼠阴茎海绵体中分离获得的具有肌源性干细胞表型的细胞具有较稳定的自我更新及增殖能力，并且在特定条件下可分化为平滑肌细胞，进一步提示了阴茎海绵体中存在肌源性干细胞。
郭刚,赵海燕,宋吉锐[9]（2009）在《白藜芦醇对离心运动后骨骼肌微损伤的修复》文中认为背景:白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂和自由基廓清剂,具有清除自由基、减轻脂质过氧化等重要药理作用,目前有关白藜芦醇在减轻骨骼肌损伤、促进损伤修复方面的研究尚不多见。目的:观察白藜芦醇对离心运动后骨骼肌超微结构损伤、血清丙二醛和肌细胞浆Ca2+浓度的影响。设计、时间及地点:对照观察动物实验,于2007-08/2008-06在南方医科大学完成。材料:成年雄性SD大鼠72只,实验室适应性喂养3d后随机分为蒸馏水组（n=40）、白藜芦醇组（n=32）。白藜芦醇制剂购自湖南省洪江华光生物有限公司。方法:白藜芦醇组大鼠每日腹腔注射1次白藜芦醇制剂60mg/kg,蒸馏水组大鼠腹腔注射等量蒸馏水,连续2周。2周后,将大鼠在动物跑台上进行一次性下坡跑运动,速度为16m/min,下坡坡度为16°,5min运动,2min休息,总运动时间为120min。运动过程中采用人工驱赶和声刺激,不使用电刺激。主要观察指标:于运动前、运动后即刻、运动后24,48,72h电镜下观察比目鱼肌纤维Z线,TAB法测定血清丙二醛和流式细胞仪检测肌细胞浆Ca2+浓度。结果:与蒸馏水组比较,白藜芦醇组镜下肌纤维损伤程度减轻,骨骼肌细胞Z线异常百分率在运动后即刻、运动后24,48,72h比蒸馏水组分别降低了50.34%,52.67%,52.65%和53.26%（P<0.05）,离心运动引起的血清丙二醛升高程度分别下降了27.7%,29.56%,34.38%和27.79%（P<0.05）,胞浆Ca2+浓度分别降低了27.53%,25.84%,22.14%和11.62%（P<0.05）。结论:白藜芦醇可降低离心运动后血清丙二醛浓度和肌细胞浆Ca2+浓度,减轻运动导致的肌肉损伤。
王延洲[10]（2009）在《MDSCs定向分化的调控及其在压力性尿失禁中作用的实验研究》文中提出女性压力性尿失禁（stress urinary incontinence, SUI）是指由于各种原因引起盆底肌肉筋膜组织松驰,膀胱和尿道解剖位置改变及尿道阻力降低,致使排尿自禁功能障碍,从而在腹压突然增高时尿液不自主流出的一种疾病。SUI是临床常见疾病,23%～44%的妇女有尿失禁症状,随人口老年化加重,其发病率会不断升高,不仅严重影响患者的生活质量,而且会加重社会医疗负担。导致SUI的关键机制主要有两种,尿道固有括约肌缺陷（intrinsic sphincter deficiency,ISD）和膀胱颈支撑功能障碍。ISD是导致女性SUI的重要原因,传统的治疗方法对于ISD所致的SUI的疗效差。从本质上改善ISD的方法是纠正其成肌功能障碍,即恢复ISD所致SUI患者成肌细胞功能。随着组织工程和基因治疗发展及干细胞研究深入,干细胞移植成为肌肉组织损伤修复的重要手段,这也为ISD型压力性尿失禁的治疗带来了希望。肌源性干细胞（Muscle derived stem cells,MDSCs）是高度未分化的多潜能细胞,在适当条件下,MDSCs可分化为骨骼肌成肌细胞、造血细胞、成骨细胞、成软骨样细胞。研究发现骨骼肌损伤时,骨骼肌干细胞可分化形成肌纤维参与肌损伤修复过程。将MDSCs注入心肌梗死或尿失禁模型大鼠,MDSCs可参与心肌或尿道平滑肌的修复。在人体,已有成功用MDSCs治疗心肌梗死或压力性尿失禁的的研究报道。目前MDSCs向具体细胞分化的机制尚不完全明确,可能与移植后细胞所处环境中的某些信号有关,不同的微环境可诱导MDSCs向不同的细胞分化,即MDSCs具有组织分化特异性。但是在MDSCs移植治疗骨骼肌损伤的研究中发现,MDSCs除分化为骨骼肌细胞外,在TGF-β等细胞因子的刺激下还可分化为成纤维细胞,导致骨骼肌纤维化,而影响细胞移植的疗效。在MDSCs移植治疗压力性尿失禁的研究中也发现:MDSCs或成纤维细胞移植到中段尿道周围,对尿失禁的治疗效果是相同的,提示:MDSCs移植后可能转分化为成纤维细胞参与尿道修复。我们推测:肌源性干细胞移植后,局部微环境中的炎症细胞释放TGF-β1,诱导肌源性干细胞成纤维分化,而影响了MDSCs成肌功能。探讨TGF-β1及其信号转导途径与肌源性干细胞成纤维分化之间的联系,对更深入的认识细胞移植治疗在体分化状况,提高细胞移植治疗效果具有重要意义。本研究以SD大鼠为研究对象,利用酶消化法和密度梯度离心法相结合,分离纯化了MDSCs。利用RNA干扰技术,构建了靶向Smad3基因的慢病毒载体。体外shRNA抑制Smad3表达前后,Real-Time PCR及Western blot检测TGF-β1诱导的成纤维化/成肌分化标志蛋白表达变化;建立SUI大鼠模型,在体移植Smad3-shRNA基因修饰的MDSCs,检测抑制Smad3表达对大鼠尿控功能及MDSCs体内分化情况的影响。主要实验方法及结果如下:一、MDSCs分离培养及成纤维分化的研究1.通过胶原酶XI和Dispase酶联合消化分离和preplate差速贴壁技术,可以获得纯度较高的SD大鼠MDSCs,在适宜的培养条件MDSCs增殖活力较好,可稳定传代培养。2. MDSCs的特征为:①低粘附性、小圆形、折光性强;②免疫表型:Sca-1（+）、CD34（+）、CD45（-）、Desmin（+）;③有形成肌管的能力,但较肌卫星细胞弱。利用MDSCs的特征组成的鉴定系统可以作为鉴定MDSCs的可靠方法。3.MDSCs能在TGF-β1刺激下表达成纤维分化标志蛋白Vimentin,而其成肌分化标志蛋白Desmin则被抑制,且存在明显的时间依赖关系,提示TGF-β1可能通过对MDSCs,即干细胞水平影响,参与了肌损伤修复/纤维化进程。二、靶向Smad3基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定1.设计4对siRNA干扰序列,并将其成功连接入pGCSIL-GFP载体,体外实验成功筛选出siRNA的最好靶点,靶点序列为:GGATGAAGTGTGTGTAAAT。2.成功构建Smad3基因ShRNA慢病毒载体。用其感染MDSCs,感染效率在80%以上,此时Smad3蛋白表达的抑制效率达80%。三、靶向干扰Smad3对MDSCs定向分化及SUI大鼠尿控功能的影响1.Smad3基因RNA干扰慢病毒载体转染MDSCs可有效阻断TGF-β1诱导的Vimentin表达升高,Desmin表达下调。说明TGF-β1可能是通过激活Smad3蛋白表达,参与了肌损伤--纤维化的进程,阻断Smad3可能具有抑制MDSCs成纤维分化,维持其成肌特性的作用。2.MDSCs细胞在体移植实验表明:MDSCs移植可修复替代损伤的括约肌细胞,能显着提高腹压漏尿点压（ALPP）,改善尿失禁大鼠的控尿功能。抑制Smad3表达后,MDSCs成肌分化能力增强,显着提高SUI大鼠细胞移植治疗的远期疗效。总之,本研究通过RNA干扰技术抑制MDSCs中Smad3基因表达,siRNA在有效抑制靶基因表达的同时可以有效降低成纤维化标志蛋白表达,维持成肌分化标志蛋白表达,改善尿失禁大鼠的控尿功能。本研究为更深入探讨TGF-β1及其信号转导途径与MDSCs成纤维化分化之间的联系,了解移植细胞在体分化状况,提高细胞移植治疗效果提供了新的线索。
二、Dispase在成年鼠骨骼肌干细胞纯化中的价值（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Dispase在成年鼠骨骼肌干细胞纯化中的价值（论文提纲范文）
（1）神经遗传疾病及认知障碍相关基因的RNA选择性剪接调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 选择性剪接机制 |
| 1.2 选择性剪接模式 |
| 1.3 神经系统中的RNA选择性剪接调节因子 |
| 1.3.1 神经特异性剪接调控因子SRRM4(nSR100)和SRRM3 |
| 1.3.1.1 SRRM4(nSR100) |
| 1.3.1.2 SRRM3 |
| 1.3.2 PTBP在神经发生中的作用 |
| 1.3.3 Nova蛋白 |
| 1.3.4 Rbfox家族 |
| 1.3.5 KHDRBSs(含KH结构域RNA结合信号转导相关蛋白) |
| 1.3.6 Hu/ELAV(神经元特异性哺乳动物胚胎致死异常视觉样蛋白) |
| 1.3.7 HNRNPA1 |
| 1.3.8 CELF1( CUGBP1) |
| 1.3.9 MBNL(类肌盲蛋白) |
| 1.4 选择性剪接与神经疾病的关系 |
| 1.4.1 选择性剪接与神经退行性疾病 |
| 1.4.1.1 Alzheimers disease(AD)阿尔茨海默症 |
| 1.4.1.2 Parkinson’s disease(PD)帕金森氏症 |
| 1.4.1.3 Amyotrophic Lateral Sclerosis-Frontotemporal Dementia肌萎缩侧索硬化症与额颞部痴呆 |
| 1.4.1.4 Myotonicdystrophy( DM)强直性肌营养不良 |
| 1.4.2 选择性剪接与神经发育疾病 |
| 1.5 Neurexins的选择性剪接 |
| 1.5.1 Neurexins的结构 |
| 1.5.2 Neurexins基因选择性剪接的调控 |
| 1.5.3 Neurexins的功能 |
| 1.6 展望 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 小鼠品系与饲养 |
| 2.2 重组质粒制备 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.3.1 常规细胞系培养、转染 |
| 2.3.2 神经元细胞的原代培养和共培养 |
| 2.3.3 小鼠成肌细胞的原代培养及慢病毒感染 |
| 2.4 免疫荧光染色 |
| 2.5 免疫印记 |
| 2.6 RNA提取及real-time RT-PCR |
| 2.7 小鼠脑组织原位杂交 |
| 2.7.1 脑组织冷冻切片的制备 |
| 2.7.2 原位杂交 |
| 2.8 图像采集与统计分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 第一节 HNRNPA1在DM1 疾病中的作用 |
| 3.1 在DM1 小鼠模型中全身性过表达HNRNPA1 |
| 3.2 在DM1 小鼠模型中过表达HNRNPA1 会诱导DM1 表型和肌肉病理改变 |
| 3.2.1 全身性过表达HNRNPA1 诱导DM1 表型的产生及缩短HSA~(LR)小鼠的寿命 |
| 3.2.2 全身性过表达HNRNPA1 诱导HSA~(LR)小鼠产生DM1相关肌肉病理改变 |
| 3.3 HNRNPA1在HSA~(LR)小鼠中诱导DM1 靶基因的错误剪接 |
| 3.3.1 HNRNPA1全身性过表达导致DM1靶基因剪接异常 |
| 3.3.2 HNRNPA1 肌肉过表达导致DM1 靶位点剪接异常 |
| 3.4 体外过表达HNRNPA1 导致DM1 靶基因剪接异常 |
| 3.4.1 成肌细胞体外分化体系的建立及内源性DM1 靶基因在该体系中的剪接变化 |
| 3.4.2 体外过表达HNRNPA1 导致内源DM1 靶基因剪接异常 |
| 3.5 HNRNPA1 直接结合DM1 靶基因进行剪接调控 |
| 3.6 HNRNPA1 直接与MBNL1 调控的外显子侧翼内含子上游结合拮抗MBNL1 的作用 |
| 3.7 HNRNPA1 主要在发育早期发挥作用 |
| 3.7.1 HNRNPA1 及相关RNA结合蛋白在肌肉发育过程中的表达谱系 |
| 3.7.2 肌肉再生实验进一步证明HNRNPA1 主要在发育早期发挥作用 |
| 3.8 HNRNPA1在DM1 活检肌肉样本中转录水平及蛋白质表达量均增加 |
| 3.9 DM1 发病机制中RNA结合蛋白共失调模型 |
| 3.10 讨论 |
| 3.10.1 HNRNPA1在DM1 中的作用 |
| 3.10.2 DM1 致病机制模型对其他非稳定微卫星疾病病理机制的意义 |
| 3.10.3 DM1 的潜在治疗途径 |
| 第二节 RNA剪接调控因子对Nrxns选择性剪接的调控 |
| 3.1 体外筛选调控Nrxns选择性剪接的RNA剪接调控因子 |
| 3.1.1 候选RNA剪接因子的筛选与构建 |
| 3.1.2 Nrxns的 mini-gene报告载体的构建 |
| 3.2 体外验证SRRM4与SRRM3对Nrxns的剪接调控作用 |
| 3.2.1 SRRM4对Nrxns选择性剪接位点的调控更广泛 |
| 3.2.2 SRRM3对Nrxns选择性剪接的调控作用 |
| 3.2.3 Nrxns AS6 的选择性剪接调控具有神经特异性 |
| 3.3 在原代神经元中过表达SRRM3和SRRM4 促进Nrxns小外显子的包含 |
| 3.4 SRRM4和SRRM3 在成年鼠中脑亚区的分布 |
| 3.5 SRRM3和SRRM4 干扰序列的筛选 |
| 3.6 在小鼠大脑亚区-海马体敲降SRRM3 抑制Nrxn1/3 小外显子(AS6)的包含效应 |
| 3.7 在小鼠大脑亚区-海马体敲降SRRM4抑制Nrxn1/3小外显子(AS6)的包含效应 |
| 3.8 不同Nrxns剪接产物对突触后配体的募集效应 |
| 3.8.1 构建包含特定剪接位点的Nrxns蛋白 |
| 3.8.2 Nrxns对兴奋性突触后骨架分子PSD95 的募集 |
| 3.8.3 Nrxns对抑制性突触后骨架分子Gephyrin的募集 |
| 3.9 Nrxns的选择性剪接依赖神经活性 |
| 3.10 SRRM4和SRRM3 的表达依赖神经活性 |
| 3.11 工作计划及展望 |
| 3.12 讨论 |
| 3.12.1 SRRM4 介导的神经小外显子的选择性剪接与ASD相关 |
| 3.12.2 SRRM4 调控Nrxns神经小外显子的选择性剪接 |
| 3.12.3 SRRM3与SRRM4 功能的冗余 |
| 3.12.4 Nrxns的选择性剪接调控是神经元活性依赖的 |
| 3.12.5 研究Nrxns基因小外显子选择性剪接的意义 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）双峰驼骨骼肌卫星细胞形态学观察与体外培养（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 骆驼基本概况及发展史 |
| 1.2 双峰驼概况 |
| 1.3 骨骼肌概述 |
| 1.4 骨骼肌卫星细胞的概述 |
| 1.5 骨骼肌卫星细胞信号通路的概述 |
| 1.6 卫星细胞龛对骨骼肌的再生的作用 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 1.8 技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验材料来源 |
| 2.1.2 主要药品试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 特殊染液的配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 骨骼肌卫星细胞的透射电镜拍摄 |
| 2.3.2 骨骼肌卫星细胞组织块法培养 |
| 2.3.3 卫星细胞的纯化 |
| 2.3.4 卫星细胞传代培养 |
| 2.3.5 卫星细胞生长曲线的绘制 |
| 2.3.6 卫星细胞免疫荧光染色鉴定 |
| 2.3.7 骨骼肌卫星细胞的诱导分化 |
| 2.3.8 骨骼肌卫星细胞的PCR鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 试验结果 |
| 3.1.1 双峰驼骨骼肌卫星细胞形态学观察 |
| 3.1.2 骨骼肌卫星细胞组织块法培养 |
| 3.1.3 细胞生长曲线 |
| 3.1.4 免疫荧光染色鉴定 |
| 3.1.5 普通PCR技术对卫星细胞的鉴定 |
| 3.1.6 骨骼肌卫星细胞的诱导分化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 5.1 骨骼肌卫星细胞的电镜拍摄 |
| 5.2 骨骼肌卫星细胞培养 |
| 5.3 卫星细胞生长曲线 |
| 5.4 双峰驼卫星细胞验证试验 |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）microRNA-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 骨骼肌卫星细胞的研究进展 |
| 1.1.1 骨骼肌卫星细胞的生物学特性 |
| 1.1.2 骨骼肌卫星细胞在肌肉发育及损伤修复中的作用 |
| 1.2 miRNAs的研究进展及在肌肉生长发育过程中的作用 |
| 1.2.1 miRNAs的生物合成、分布与表达特征 |
| 1.2.2 miRNAs的作用机制及研究方法 |
| 1.2.3 miRNAs在骨骼肌发育中的作用 |
| 1.3 小结与展望 |
| 第二章 牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 牛肌卫星细胞的分离培养及诱导分化 |
| 2.2.2 牛肌卫星细胞及分化后肌管的RT-PCR和免疫染色鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 牛miR-128靶基因预测及双荧光素酶实验 |
| 3.2.2 牛肌卫星细胞中调控miR-128表达对Sp1基因表达及对细胞周期的影响 |
| 3.2.3 miR-128对牛肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控作用 |
| 3.2.4 miR-128对牛肌卫星细胞增殖分化调控作用的潜在机制 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-128在失神经肌肉萎缩模型中对肌纤维的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 失神经肌肉萎缩模型的构建及对miR-128表达量的影响 |
| 4.2.2 向失神经肌萎缩模型内注射miR-128 mimics或inhibitors后对肌纤维的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（4）电针“委中”穴对腰多裂肌卫星细胞增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 MSCs在骨骼肌损伤修复过程中的作用研究进展 |
| 引言 |
| 1 骨骼肌的再生 |
| 2 MSCs的基本特性 |
| 3 MSCs的异质性 |
| 4 影响MSCs参与骨骼肌再生的相关生长因子 |
| 4.1 MRF |
| 4.2 Pax7 |
| 4.3 HGF |
| 4.4 NO |
| 4.5 IGF |
| 4.6 FGFs |
| 5 与MSCs参与骨骼肌再生的相关信号通路 |
| 5.1 PI3K/Akt通路 |
| 5.2 P38MAPK通路 |
| 5.3 ERK5/BMK1通路 |
| 5.4 Norch信号通路 |
| 5.5 Wnt信号通路 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 针灸促进骨骼肌组织再生的作用研究进展 |
| 1 临床试验研究 |
| 2 动物实验研究 |
| 2.1 针灸对损伤骨骼肌的形态学影响 |
| 2.2 针刺对骨骼肌损伤后功能变化的影响 |
| 2.3 针灸对骨骼肌相关蛋白代谢的影响 |
| 2.4 针灸对骨骼肌细胞内酶活性的调节作用 |
| 2.5 针灸对骨骼肌周围血管的影响 |
| 2.6 针灸对肌肉组织中生长因子表达的影响 |
| 2.7 针灸对骨骼肌损伤局部炎症反应的影响 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 针灸血清的作用研究进展 |
| 1 抗肿瘤 |
| 2 改善胃功能 |
| 3 保护骨关节 |
| 4 调整Ca~(2+)浓度 |
| 5 促进损伤脑组织修复 |
| 6 保护心肌 |
| 7 抗哮喘 |
| 8 降血糖 |
| 9 改善免疫功能 |
| 10 抗衰老 |
| 11 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 实验技术路线图 |
| 实验一 电针“委中”穴对腰多裂肌损伤模型大鼠Pax7、Myod表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 单根肌纤维法分离培养大鼠多裂肌MSCs及其鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 电针血清对MSCs增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）重组质粒载体pEGFP-N2-SMDF体外转染小鼠肌源性干细胞及其鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩写对照 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 小鼠肌源性干细胞诱导分化为类雪旺细胞的实验研究 |
| 实验一 小鼠来源肌源性干细胞的分离培养与鉴定 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 定向诱导小鼠肌源性干细胞分化为类雪旺细胞 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小鼠 SMDF 基因的克隆及其真核表达载体的构建 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 pEGFP-N2-SMDF 体外转染 MDSCs 及其鉴定 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 研究小结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况说明 |
| 致谢 |
（6）大鼠肌卫星细胞体外培养及移植延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠肌卫星细胞的体外培养与鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 肌卫星细胞移植与体内分化的观察 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 肌卫星细胞移植延缓失神经肌萎的疗效观察 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）超支化纳米载体转基因修饰骨骼肌成肌细胞治疗缺血性心脏病的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 |
| 前言 |
| 实验资料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 学术成果 |
| 致谢 |
（8）大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：勃起功能障碍基因及干细胞治疗研究进展中英文对照缩略词表 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（9）白藜芦醇对离心运动后骨骼肌微损伤的修复（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组比目鱼肌超微结构比较见图2。 |
| 2.2 白藜芦醇对血清丙二醛浓度的影响 |
| 2.3 白藜芦醇对肌细胞浆Ca2+浓度的影响 |
| 3 讨论 |
（10）MDSCs定向分化的调控及其在压力性尿失禁中作用的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 MDSCs 定向分化的调控及其在压力性尿失禁中作用的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 MDSCs 分离培养及成纤维分化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 靶向Smad3 基因RNA 干扰慢病毒载体的构建与鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 靶向干扰Smad3 对MDSCs 定向分化及SUI 大鼠尿控功能的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 女性压力性尿失禁的非手术治疗 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 肌源性干细胞治疗压力性尿失禁 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间主要科研成果 |
| 英文论着 |
四、Dispase在成年鼠骨骼肌干细胞纯化中的价值（论文参考文献）
- [1]神经遗传疾病及认知障碍相关基因的RNA选择性剪接调控机制研究[D]. 庄燕. 东南大学, 2020
- [2]双峰驼骨骼肌卫星细胞形态学观察与体外培养[D]. 邓天健. 内蒙古农业大学, 2020(02)
- [3]microRNA-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制研究[D]. 代阳. 天津农学院, 2016(10)
- [4]电针“委中”穴对腰多裂肌卫星细胞增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响[D]. 刘通. 北京中医药大学, 2016(08)
- [5]重组质粒载体pEGFP-N2-SMDF体外转染小鼠肌源性干细胞及其鉴定[D]. 宋艳玲. 第二军医大学, 2012(10)
- [6]大鼠肌卫星细胞体外培养及移植延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究[D]. 陈立. 复旦大学, 2012(02)
- [7]超支化纳米载体转基因修饰骨骼肌成肌细胞治疗缺血性心脏病的研究[D]. 朱铠. 复旦大学, 2012(03)
- [8]大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究[D]. 岳明宗. 苏州大学, 2012(10)
- [9]白藜芦醇对离心运动后骨骼肌微损伤的修复[J]. 郭刚,赵海燕,宋吉锐. 中国组织工程研究与临床康复, 2009(24)
- [10]MDSCs定向分化的调控及其在压力性尿失禁中作用的实验研究[D]. 王延洲. 第三军医大学, 2009(05)