一、水稻bicoid反义基因转基因植株胚胎发育的形态变化（论文文献综述）
宋语宁[1]（2020）在《利用TaLEC基因建立小麦再生体系和创制小麦大粒新种质》文中认为小麦（Triticum aestivum L.）是世界三大粮食作物之一。农杆菌介导的遗传转化是小麦基因功能研究的主要手段,但较低的植物再生能力限制了高效遗传转化体系的建立,阻碍了小麦功能基因组学分析和基因工程育种的有效开展。建立高效的再生体系对于小麦高效遗传转化和基因功能研究具有重要意义。本研究从小麦中克隆了转录因子LEAFY COTYLEDON 1（LEC1）和LEC2的同源基因并进行了进化树和时空表达模式分析,进而对该基因在小麦中的生物学功能进行了研究。主要结果如下:本研究用拟南芥LEC2的全长氨基酸序列,在Ensembl Plants数据库中进行BLAST检索。结果表明,TaLEC2基因位于3号染色体上。以中国春和Fielder的胚为材料,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆获得了三个TaLEC2基因,分别命名为TaLEC2-3A、TaLEC2-3B和TaLEC2-3D,它们分别编码248、405和301个氨基酸,含有B3结构域。系统进化树分析发现,TaLEC2s与拟南芥的LEC2在同一分支上。亚细胞定位结果显示,TaLEC2蛋白均定位在细胞核内。qRT-PCR分析结果显示,TaLEC2基因在中国春小麦的胚、二棱期茎尖和小穗原基等均有不同程度的表达,尤其在胚中的表达水平最高。原位杂交实验结果表明,TaLEC2s在中国春小麦不同发育时期的胚中均特异表达,在早期籽粒的种皮和胚乳中亦有较高水平的表达。利用同样的策略获得了TaLEC1的序列信息。结果表明,中国春小麦中与拟南芥LEC1相似性最高的基因位于6A、6B和6D染色体上。以中国春和Fielder的胚为材料,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆得到了三个TaLEC1s基因,将其分别命名为TaLEC1-6A、TaLEC1-6B和TaLEC1-6D。三个TaLEC1均编码246个氨基酸,含有HAP3结构域。系统进化树分析发现,TaLEC1s与水稻的OsLEC1在同一分支上且同源性较高。亚细胞定位结果显示,TaLEC1蛋白定位在细胞核中。qRT-PCR分析结果显示,TaLEC1s基因在中国春小麦的胚、二棱期茎尖和单棱期茎尖等均有不同程度的表达。原位杂交实验结果表明,TaLEC1s基因在中国春小麦不同时期发育的胚中均特异表达。为了研究TaLEC1和TaLEC2基因在小麦中的生物学功能,我们构建了TaLEC1和TaLEC2的过表达载体、amiRNA载体、雌激素诱导的表达载体以及TaLEC2的反义RNA表达载体,以Fielder小麦的幼胚为受体材料,进行农杆菌的遗传转化。目前已获得TaLEC2-3A-OX、TaLEC2-3D-OX和TaLEC2-3D-DOWN的T2代阳性植株,TaLEC2-3B-OX、amiRNATaLEC2和雌激素诱导表达载体已获得T0代阳性植株。qRT-PCR结果显示,TaLEC2-3A和TaLEC2-3D在过表达转基因植株中表达水平显着上调,TaLEC2的表达水平在TaLEC2-3D-DOWN植株中明显下调。与对照Fielder相比,TaLEC2-3A-OX和TaLEC2-3D-OX转基因小麦植株生长缓慢,株高降低,分蘖减少,籽粒变小,粒重减轻。TaLEC2-3D-DOWN转基因小麦植株健壮,株高增高,分蘖增多,籽粒变长、变宽,粒重明显提高,这表明降低TaLEC2的表达水平可有效促进籽粒增大、显着提高单株产量。形态学和组织学的观察结果显示,过表达TaLEC2-3D促进体细胞胚和胚性细胞的形成和维持。过表达TaLEC1促进胚性细胞的形成和维持。综上所述,在小麦中过表达TaLEC2基因在诱导离体条件下胚性细胞的形成和体细胞胚的发生中具有重要作用,而过表达TaLEC1基因促进胚性细胞的形成和维持。利用反义RNA技术降低TaLEC2s的表达水平可促进小麦籽粒增大,粒重提高。我们首次发现TaLEC2基因是小麦籽粒大小和粒重的负调节因子。研究结果为建立基于体细胞胚再生途径的小麦高效再生体系的建立奠定了坚实的基础,也可利用基因编辑技术人为操控TaLEC2的表达水平进而进行小麦高产育种和分子设计育种提供重要思路和线索。
甘露[2]（2019）在《草地早熟禾矮化突变体的遗传差异分析及DXS1基因功能研究》文中进行了进一步梳理草地早熟禾（Poapratensis L.）作为温带地区应用最广泛的草坪草之一,具有抗寒、耐旱、绿色期长、坪观质量高等特点,但需要频繁修剪以维持较高的草坪质量。空间环境中的诱变因子能诱发植物种子产生不定向变异,可能会获得符合育种方向的优良性状。本研究中的草地早熟禾种子经过太空飞行后返回地面种植的后代植株中发现有株高降低、叶色变深等外观质量较好的的变异株系,符合草坪草优良品种的选育方向。本文以空间诱变草地早熟禾M4代的矮化突变体（dwarf mutant,A16）和野生型（wildtype,WT）为研究材料,比较两者在细胞遗传、生理表型、分子表达水平方面的差异,以及对调控植物生长发育的脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因（DXS1）及其启动子进行功能研究,进而了解空间诱变矮化突变体的变异情况和空间诱变对相关基因的影响情况,既对培育草地早熟禾矮化品种具有指导意义,也为更好地利用空间诱变进行植物育种做出贡献。研究结果如下:（1）A16与WT在细胞遗传水平上的差异:空间环境对草地早熟禾叶片组织细胞结构产生了较大的影响。WT叶片上表皮细胞狭长而稀,倾向于横向伸展;而A16上表皮细胞明显呈梭形,短宽而多,倾向于径向伸展,而且A16的叶片气孔分布更密、气孔更小。此外,A16与WT转录组测序发现了 4203个差异表达基因,而且InDel多态性分析侧面表明了A16与WT的基因组/转录组之间存在大量随机的插入/缺失突变,说明空间环境对草地早熟禾的遗传物质产生变异作用。（2）A16与WT在生理表型水平上的差异:在株高方面,矮化突变体的株高调控可能与调控植物萜类物质合成的DXS1基因的下调表达、赤霉素合成通路上的GA3ox4基因下调表达、生长素合成通路的FMO基因和PIN5输出蛋白等基因的下调表达有关,而且A16中的赤霉素和生长素含量均低于WT;在叶色方面,A16的叶绿素含量显着高于WT,且叶绿素a/b的比值比WT要低,叶色差异可能是由叶绿素合成基因UroS的上调表达以及降解基因CLH1基因的下调表达所造成的;在抗旱耐盐方面,综合胁迫处理后的生理生化的反应指标、内源ABA含量、抗逆相关基因的差异表达,A16的抗旱性比野生型WT强,耐盐性方面两者没有显着差异;在抗病性方面,虽然PR1L、NPR1L抗病相关基因在A16中的表达量在病原菌诱导前处于较低水平,但在病原菌侵染后,其转录水平均显着提高,且增幅显着大于WT,说明WT和A16在诱导抗病性方面存在差异。（3）DXS1基因在草地早熟禾中的功能研究表明:草地早熟禾DXS1（PpDXS1）基因含有一个2139 bp的ORF框,与山羊草（Aegilops tauschili）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的DXS1蛋白的最为相似,且属于DXS基因家族的第一族;PpDXS1基因在草地早熟禾的叶片、叶鞘和根中均有表达,其中叶片中的表达量最高;GA3、ABA、JA和病原菌侵染的外施处理均能提高PpDXS1基因的表达。此外,PpDXS1在草地早熟禾中的反义表达使得转基因株系的株高、GAs和IAA含量显着降低,而ABA和叶绿素含量在某些株系（antiDXS1-102）中是增加的,随后对antiDXS1-102转基因株系和转空载的对照植株（CK）进行转录组分析,结果表明与CK相比,与IPP/GGPP合成、GA和IAA生物合成和信号传递以及叶绿素相关的降解基因在antiDXS1-102植株中下调表达,而叶绿素和ABA的生物合成相关基因的表达上调,这与激素含量测定结果一致。（4）A16与WT的DXS1基因启动子序列的比较分析发现A16的PpDXS1基因的启动子区域存在一个715bp的插入片段和一个500bp的缺失片段,推测空间环境诱导DXS1基因启动子区发生插入/缺失突变;启动子在双荧光素酶报告系统及在转基因表达的草地早熟禾中的活性分析表明A16的PpDXS1启动子序列的相对活性是低于WT的,且活性降低是由在A16中缺失的片段所造成的;而且与缺失区域G-box元件结合的G-box结合因子（G-box binding factor 1,GBF1）对启动子活性具有转录激活作用,在过表达GBF1基因的转基因草地早熟禾中PpDXS1基因的转录水平显着提高。因此,我们推测在A16的PpDXS1启动子区缺失的部分含有的G-box元件以及与之结合的GBF1蛋白的转录激活功能可能是A16的DXS1基因启动子活性降低的原因,也是被启动子调控的DXS1基因表达水平降低的原因。综上所述,空间诱变在细胞遗传、生理表型、分子表达等水平对草地早熟禾均产生了较大影响,包括株高、叶色、生理抗性、基因表达等方面;而且空间环境通过诱发PpDXS1基因启动子发生插入/缺失突变来影响其基因表达,进而调控了植物整个生长发育过程。
史桂清[3]（2019）在《小麦小分子RNA TaMIR1119/5086和转录因子基因TaNF-YB6;1分子特征和耐逆功能》文中研究指明干旱和盐分等非生物逆境胁迫是全球范围内限制作物生长及产量形成的重要因素。揭示植物应答和抵御干旱和盐分胁迫的分子机制对于作物耐逆的遗传改良和生产实践具有重要实践意义。本研究在实验室前期工作积累基础上,对应答干旱胁迫的小麦miRNA家族成员TaMIR1119、TaMIR5086和应答盐分和干旱逆境胁迫的转录因子基因TaNF-YB6;1的分子特征及其耐逆功能进行了研究。主要研究结果如下:1.TaMIR1119的前体序列长度为176 nt,成熟序列位于84 nt至107 nt,长度为24 nt。该小分子RNA通过自身碱基互补序列形成二级茎环结构。TaMIR1119作用的靶基因有为6个,功能上分属于转录调控、RNA和生化代谢、运输和氧化胁迫逆境抵御等类别。2.干旱胁迫下,TaMIR1119及其烟草同源基因NtMIR1119在根系中呈上调表达。超表达TaMIR1119的转基因烟草植株,干旱胁迫条件下植株的生长特性得到明显改善,植株形态增大,干物质量增多,叶片光合碳同化能力增强,植株体内SOD、POD、CAT的抗氧化酶活性明显提高,表明该小麦种属miRNA成员通过内在生理生化过程改善和活性氧清除能力增强,在介导植株抵御干旱逆境胁迫过程中发挥着重要生物学功能。3.TaMIR5086的前体序列长度为126 nt,成熟序列位于11 nt至31 nt,长度为21nt。该小分子RNA通过自身序列反向重复区形成二级茎环结构。TaMIR5086作用6个靶基因,但其作用靶基因功能有待进一步验证。4.TaMIR5086在干旱胁迫下,在根系中表达上调,其作用靶基因根系中呈下调表达模式。超表达TaMIR5086的转基因烟草植株,干旱胁迫条件下,超氧化物歧化酶基因SOD1和FeSOD、过氧化氢酶基因CAT和CAT1;2、过氧化物酶基因POD4和POD9的表达明显上调。上述差异表达的抗氧化酶基因在转录水平上受到TaMIR5086的调节,转基因植株的活性氧清除能力和植株抵御干旱胁迫的能力增强。此外,超表达TaMIR5086的转基因烟草植株,在干旱胁迫下通过调节气孔的开度来减少植物的水分散失,降低水分缺少对植株造成的伤害,维持植株正常生长。5.TaNF-YB6;1的cDNA全长1018 bp,含有一个长度为411 bp的开放阅读框,编码136个氨基酸。TaNF-YB6;1的分子量为14.93 kD,等电点（pI）为5.65。TaNF-YB6;1与源于菠萝、油棕、大麦、普通小麦、一粒小麦、水稻和粟等植物的NF-YB型转录因子有高度的同源。6.在干旱和盐分处理下,TaNF-YB6;1的表达呈上调趋势。TaNF-YB6;1的转基因烟草植株在干旱和盐分逆境胁迫下,转基因株系植株形态明显改善。表现为正义转基因系植株生长健壮,个体增大,而反义转基因系植株生长缓慢,植株矮小。表明TaNF-YB6;1在介导植株抵御干旱和盐分逆境发挥作用,但其调控植株抵御渗透胁迫的作用机制有待于进一步研究。综上所述,TaMIR1119、TaMIR5086和转录因子TaNF-YB6;1基因均对干旱胁迫明显应答,TaNF-YB6;1同时对盐分明显应答。TaMIR1119转基因烟草株系,在干旱胁迫下,通过作用靶基因,调控植株氧化逆境防御,增强叶片光合碳同化能力,在介导植株抵御干旱逆境胁迫过程中发挥着重要生物学功能。超表达TaMIR5086的转基因烟草植株,干旱胁迫下,通过快速关闭气孔和增加体内渗透调节物质含量,维持细胞渗透压,降低水分亏缺对细胞的伤害,同时,在转录水平上调节抗氧化酶相关基因的表达,增强转基因植株的活性氧清除能力,调控植株体内的活性氧相对稳态,从而提高植株的抗旱能力。
胡颖[4]（2019）在《拟南芥胚胎发育中TOM40基因的生物学功能研究》文中进行了进一步梳理双受精是被子植物发育的标志性事件,在双子叶植物的双受精过程中一个精细胞与卵细胞融合形成合子,经过一系列的细胞分裂与分化发育为胚胎直至形成种子;另一个精子与中央细胞融合形成胚乳,其间经历了合胞体和细胞化阶段,它为胚胎发育提供营养,直至发育晚期降解并消失。早期胚胎发生形成了植物基本组织的前体,在过去数十年中,科学家们对拟南芥胚胎发育的机制进行了深入研究,发现其胚胎发生和模式建成的过程是高度程序化的,这些事件被一个精确而复杂的基因表达网络所调控,一系列基因参与了拟南芥胚胎发育和模式建成的过程。线粒体外膜转运酶（Translocase of the Outer Membrane,TOM）将细胞质中合成的蛋白前体转运进入线粒体中,起到门户通道的作用。前人对不同物种中TOM40蛋白的生物学功能进行了研究,结果表明该蛋白在酵母中的表达水平与氧离子的释放相关,在人类细胞中TOM40还被证实与衰老和疾病相关。然而在模式植物拟南芥中,关于TOM40的生物学功能仍然知之甚少。因此,本研究以拟南芥tom40的两个突变体为材料,利用生物信息学、分子生物学、细胞生物学、遗传学等技术手段,研究发现AtTOM40基因的突变引起线粒体结构紊乱,导致胚胎发育异常,最终引起种子败育。同时,还利用酵母双杂交技术对拟南芥TOM复合体各亚基之间的相互作用关系进行了研究,为阐明TOM40在拟南芥中的作用机制提供了实验依据和新的信息,具有重要的理论意义。本研究获得的主要结果如下:1、首先利用生物信息学软件CLUSTALX（版本1.83）、MEGA4、SwissPdbViewer 4.01和PyMOL 1.7,以及在线数据库http://www.arabidopsis.org、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov、http://swissmodel.expasy.org/、http://swissmodel.expasy.org、https://www.ebi.ac.uk/interpro/sequencesearch和http://ibs.biocuckoo.org,从氨基酸序列、进化关系分析、三维模建、结构域预测等方面对不同物种的TOM40蛋白进行了生物信息学分析,发现TOM40蛋白在不同真核生物中的氨基酸结构和序列比较保守,AtTOM40蛋白含有19个β-链片段结构域和2个α-螺旋结构,与油菜的同源性最高。以酵母TOM40为模板对双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻中TOM40的三维结构进行同源建模,三个物种中的TOM40蛋白主体结构基本重合,均含有19个β-链片段结构域的桶状蛋白,其中拟南芥和水稻的蛋白结构中含有2个α-螺旋结构。进一步对不同物种的TOM40蛋白进行结构预测,结果显示TOM40是一类真核生物中的孔状蛋白,在不同物种中该蛋白均存在一个孔状结构域,其大小从308个（拟南芥）氨基酸至387个（酵母）氨基酸不等,推测这个保守的孔状结构域的功能在于协助未折叠的多肽链运输进入线粒体。上述结果表明TOM40是一类较为保守的蛋白,在生物体中行使着基本的生物学功能。2、从拟南芥突变体库ABRC（Arabidopsis biological resource center）（http://abrc.osu.edu/）中购买了TOM40的两个T-DNA插入突变体SALK128170（tom40-1/+）和CS873594（tom40-2/+）,并对其进行了鉴定和分析。利用三引物法对上述两个突变体的T-DNA侧翼序列进行鉴定,发现tom40-1突变体的T-DNA位于AtTOM40基因的第二个外显子上,tom40-2突变体的T-DNA位于AtTOM40基因的第七个外显子上。随后对两个突变体进行筛选和鉴定,发现其均为杂合突变体,无法获得纯合后代,同时两个突变体的雌、雄配子体发育不受影响,但在成熟角果中会出现异常的白化种子并最终死亡,两个突变体中的种子败育率分别为24.92%和25.04%,表明AtTOM40基因的突变导致胚胎隐性纯合致死。回复实验证实两个突变体的胚胎致死表型均可以被完全回复,表明AtTOM40基因的突变是造成败育的直接原因。3、对两个突变体进行胚珠透明观察发现,从心形期胚胎开始两个突变体中的胚胎发育出现异常,不能分化出正常的子叶和顶端分生组织等器官原基,类似球形时期的胚胎。对两个突变体中胚体的高度和宽度进行测量,结果表明胚体的体积会随着发育的进程而增大,但最终会发育停滞。对野生型和两个突变体的胚胎发育进程进行统计,结果表明随着发育的进程,两个突变体中类似球形胚的占比越来越高,其最终比例分别为24.39%和24.49%,与败育率相当。对tom40-1突变体中胚乳观察的结果表明,胚乳可以正常游离核分裂和细胞化。以上结果证实AtTOM40基因的突变会引起胚胎发育异常并最终败育,AtTOM40基因在拟南芥胚胎发育过程中起着重要作用。4、利用荧光实时定量PCR技术对AtTOM40基因的转录水平表达进行了检测,结果表明该基因在根、茎、叶、花、花序、授粉后1/3/5/7天的角果以及萌发后7天和14天的幼苗中都有表达,其中在成熟的花、花序和授粉后1天的角果中表达量较高。将AtTOM40启动子与GUS蛋白融合表达并检测GUS信号,结果显示在成熟叶片、毛状体、萌发7天的幼苗和花序中GUS信号较强,尤其是在成熟胚胎的子叶中表达强烈,但在花药、花丝、柱头等生殖器官中的GUS信号则较弱,甚至检测不到,推测AtTOM40基因参与了拟南芥营养生长和胚胎发育及器官原基分化,但不参与雌雄配子体的发育。进一步利用原位杂交技术研究了AtTOM40基因转录本在拟南芥胚胎中的表达模式,结果在不同时期的胚胎、胚乳游离核以及子叶中均检测到该基因的表达,表明AtTOM40基因参与了拟南芥胚胎和胚乳的发育过程。5、将AtTOM40启动子与GFP蛋白进行融合表达,同时对叶肉原生质体用Mitotracker Red染色。利用激光共聚焦扫描显微镜观察转基因植株叶肉原生质体中GFP荧光定位与Mitotracker染色,结果表明叶肉原生质体中的AtTOM40蛋白与线粒体荧光存在共定位现象,显示该蛋白为线粒体蛋白。利用超薄切片和透射电镜观察的技术对线粒体超微结构进行观察,结果发现tom40-1突变体胚胎细胞中的线粒体嵴结构无法正常形成。上述结果证实了AtTOM40基因在拟南芥中定位于线粒体,该基因编码的是一个线粒体蛋白,与生物信息学的预测结果相符。同时,该基因的突变会影响胚胎细胞的线粒体结构,表明该基因参与了线粒体的生物发生,从而影响拟南芥的胚胎发育。6、为了进一步研究AtTOM40基因的生物学功能,本研究还利用荧光实时定量PCR技术,以授粉后6天（DAP,Day after pollination）野生型种子和tom40-1突变体中白化种子为材料,对19个拟南芥线粒体外膜蛋白相关基因的表达情况进行了检测。结果发现14个基因表达发生了显着变化,证明AtTOM40基因的突变在转录水平上影响了线粒体外膜的功能,从而影响了线粒体的生物发生。对19个拟南芥胚胎发育和模式建成相关基因的表达水平也进行了检测,结果发现18个基因的表达均发生了显着变化,表明AtTOM40基因的突变导致胚胎发育和模式建成在转录水平发生变化。根据上述结果可以推测,AtTOM40基因的突变通过影响线粒体外膜功能从而影响拟南芥胚胎细胞的正常发育。7.利用酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid）检测了拟南芥TOM40亚基与TOM复合体其他亚基之间的互作关系,结果发现TOM40能与TOM5和TOM9存在相互作用,TOM5与TOM7-1、TOM7-2、TOM9和TOM40都存在相互作用;TOM6与TOM7-1存在相互作用;TOM7-1与TOM7-2存在相互作用;TOM9与TOM7-1和TOM40存在相互作用。根据此实验结果绘制了拟南芥TOM复合体各亚基之间的互作关系示意图,为揭示TOM复合体在线粒体外膜蛋白转运过程中的作用机制提供信息。
高红艳[5]（2019）在《毛竹三螺旋家族全基因组分析及PheGT8和PheGT16的功能研究》文中提出毛竹（Phyllostachys edulis）是我国最重要的林产品和非木材森林资源之一,是一种具有很高经济、生态和社会价值的大型木本竹,在经济发展和自然环境保护方面均有重要地位。对毛竹来说,低温和干旱对其能否生存关系最大,往往是毛竹分布的主要限制因素。我国毛竹主要自然分布在南方的亚热带地区,只有极少部分能在北方的寒冷和干旱环境下生长,因而限制了毛竹的生长范围。前人研究发现,三螺旋转录因子在植物的抗逆性方面具有很大的优势和潜力,开展毛竹中三螺旋基因的全基因组鉴定及其关键基因的功能验证具有重要价值和意义。本研究以毛竹为材料,基于毛竹基因组数据库,对三螺旋转录因子家族进行了全面分析与鉴定,探讨其在不同非生物胁迫下的表达差异,克隆了2个毛竹三螺旋基因,并对其进行了低温、干旱和高盐胁迫处理下的转基因功能验证。主要研究结果如下:1.本研究鉴定出24个毛竹三螺旋基因。系统发育分析的结果表明,24个Phe GT蛋白可被划分为6个亚家族:亚家族O、Ⅰ（SH4）、Ⅱ（GT-1）、Ⅲ（GTγ）、Ⅳ（SIP1）和Ⅴ（GT-2）,每个亚家族各自包含1、2、2、4、7和8个蛋白质成员,同时鉴定出8对同源基因。对Phe GT基因的内含子/外显子结构和保守基序均进行分析,结果表明不同的亚家族成员具有不同的基因结构和基序。通过分析Phe GT基因的启动子顺式作用元件,发现其存在着大量的低温、干旱和激素等非生物胁迫相关的调控元件。2.分析毛竹Phe GTs基因的表达模式,结果表明大部分Phe GT基因在低温和干旱胁迫中发挥调控作用,在高盐胁迫中未受到强烈诱导。组织特异性表达谱表明Phe GT基因大部分是在茎中表达,其次是叶片和根。利用实验室已有的转录组数据,构建Phe GT基因的表达谱,分析其在花发育时期的不同阶段和不同高度笋尖中的表达模式,发现三螺旋不同亚家族基因的表达存在一定的差异。3.从毛竹中克隆了两个Phe GT基因,Phe GT8和Phe GT16（基因ID:PH01000551G0750和PH01002648G0060）,其CDS序列长度分别为1317 bp和1200 bp,二者蛋白质分子量大小分别为49.56 k D和46.12 k D,等电点分别为6.18和6.13,均包含一个典型的三螺旋DNA结合结构域。实时定量PCR结果表明,这两个基因均为组成型表达,在毛竹根、茎和叶中均检测到表达量,Phe GT8被低温和干旱胁迫强烈诱导表达,而在高盐胁迫下几乎不表达;Phe GT16主要受到低温胁迫的强烈诱导表达,在干旱和高盐胁迫下其表达量较低。4.将Phe GT8和Phe GT16分别与35S-e GFP构建瞬时表达载体,通过农杆菌介导法瞬时转化烟草细胞,利用共聚焦显微镜观察融合载体的表达位置,结果表明这2个基因均定位在细胞核中。5.将Phe GT8和Phe GT16分别与p GBKT7构建重组载体,转化到酵母菌株AH109中,结果表明Phe GT16蛋白具有转录自激活活性,而Phe GT8蛋白不具有转录自激活活性。6.将反义Phe GT8基因、反义Phe GT16基因和正义Phe GT16基因分别转入模式植物拟南芥中,与野生型拟南芥相比较,发现转正义Phe GT16基因株系对低温和干旱胁迫耐受性有明显的提高,但在高盐胁迫下无法正常生长;而转反义Phe GT16基因和反义Phe GT8基因的株系对低温和高盐胁迫的耐受性均下降。本研究中对于毛竹三螺旋转录因子家族及其成员Phe GT8和Phe GT16基因的研究,对深入探索三螺旋基因在抗逆方面的应答调控有重要参考价值,为将来通过分子手段对竹类植物进行抗逆性状改良有积极的现实意义。
李娟[6]（2017）在《GbWOX9基因植物表达载体的构建及对海岛棉胚性细胞的遗传转化》文中提出植物分生组织的干细胞是植物形态建成、器官持续再生的关键。WUS/WOX家族成员在植物分生组织的干细胞中特异表达,在植物器官发育过程中以及细胞类型转变中发挥着重要作用。本研究以海岛棉“新海16”为材料,克隆WOX/WUS转录因子家族的成员中与植物胚胎发育相关的基因GbWOX9,并对其进行结构预测分析、亚细胞定位预测、同源进化分析及不同体细胞胚阶段的表达分析,同时,构建化学诱导型的GbWOX9正、反义植物表达载体,借助农杆菌介导的遗传转化方法将GbWOX9基因导入到“新海16”的正、反义胚性细胞中并对其在不同诱导剂浓度处理过的细胞组织的表达模式进行分析。主要研究结果如下:1.利用PCR技术对GbWOX9基因进行克隆,借助相关的在线软件及DANMAN、MEGA5等对该基因进行生物信息学分析,结果表明该基因包括1038 bp的开放阅读框,编码345个氨基酸,在线预测其蛋白分子量约为38.26 kD,等电点为6.7。通过氨基酸序列比对发现,序列中含有一个保守的由65个氨基酸组成的DNA结合域,即同源异型结构域。系统进化树分析结果表明海岛棉GbWOX9蛋白与亚洲棉GaWOX9蛋白分布在同一分支上,说明二者在进化上亲缘关系较近。亚细胞定位预测GbWOX9可能定位于细胞核。qRT-PCR表明,该基因在“新海16”体细胞胚阶段的球形胚中表达量最高。2.构建了诱导型的正、反义植物表达载体pTA7002-GbWOX9和Anti pTA7002-GbWOX9,并进行了农杆菌遗传转化体系的优化研究。结果表明,对胚性细胞进行10 d的预培养OD600≈0.50.6,侵染时间为15 min,共培养24 h,抗性培养基中头孢和潮霉素的浓度分别为500 mg·L-1和20 mg·L-1时为转化效果较好。在加有抗生素的培养基上继代筛选两次以后,得到了转基因的阳性细胞。3.提取转化成功的海岛棉“新海16”正、反义植物表达载体胚性细胞的总RNA,利用荧光定量PCR检测GbWOX9的表达量。试验结果表明正、反义链的胚性细胞在30μmol·L-1的DEX浓度诱导之后,GbWOX9表达量皆与没有地塞米松诱导的对照之间有极显着差异（P<0.01）。
李冬兵[7]（2019）在《转RHA2b基因抗穗发芽小麦的创制及其抗性机制》文中研究表明小麦穗发芽（Preharvest sprouting,PHS）是指小麦成熟期在潮湿环境下籽粒在穗上直接发芽的现象。穗发芽对小麦生产的负面影响主要体现在降低产量、恶化品质和降低种用价值。目前,大多数小麦品种的抗穗发芽能力都不强。解决穗发芽的途径:一是应用化学调控技术,二是选育抗穗发芽品种。培育抗穗发芽能力强的品种能很好地解决这一问题,然而小麦抗源的匮乏严重限制了抗穗发芽小麦品种的选育和应用。采用以转基因育种为代表的植物分子育种技术创制抗穗发芽新材料,是提高小麦抗穗发芽能力的理想途径之一。为充分利用RING FINGER类基因进行小麦抗穗发芽性状改良,本研究获得了与种子休眠和穗发芽有关的RsRHA2b基因,建立了高效稳定的转基因小麦创制方法,获得了转基因纯合株系。基于转基因纯合株系,研究了成熟期和萌发早期外源RsRHA2b基因的导入对小麦籽粒淀粉合成关键酶活性、蛋白质合成关键酶活性及相关基因表达的影响。以进行过不同处理的大麦种子的胚为材料构建cDNA文库,采用酵母双杂交系统筛选出与TaRHA2b蛋白互作的蛋白,探索了TaRHA2b基因的调控途径。同时挖掘并分离出抗穗发芽新基因。研究了TaRHA2b基因编码区在供体祖先及在不同品种间的分布情况,开发抗穗发芽分子标记。研究结果如下:1.转RsRHA2b基因抗穗发芽材料的创制及鉴定来自萝卜的RsRHA2b基因编码转录因子类蛋白,该蛋白与ABA信号转导有关,能影响种子休眠和穗发芽,通过种子萌发早期农杆菌介导法将RsRHA2b基因转移至小麦“郑麦9023”;通过Basta抗性筛选,PCR、RT-PCR、q RT-PCR和Southern杂交对转基因株系进行鉴定;针对纯合转基因株系,进行离体种子萌发,整穗萌发及种子萌发特性的分析;二叶期不同浓度ABA处理后,进行ABA的敏感性分析,通过q RT-PCR分析与RHA2b/ABA信号传导途径有关的ABI5,FUS3和MAL基因的表达谱。结果显示RsRHA2b基因已整合到小麦的基因组中,而且能够稳定的遗传;转基因株系的种子休眠性及抗穗发芽能力与对照组相比显着增强;不同浓度ABA处理后,转基因株系的生长量与对照组相比有显着的下降,说明转基因株系与对照组相比有更强的ABA敏感性;q RT-PCR结果显示证实转基因株系中ABI5,FUS3和MAL基因的表达量与对照组相比都显着的增加。这些结果说明RsRHA2b基因提高了转基因小麦休眠性及抗穗发芽能力。2.小麦“郑麦9023”悬浮细胞系的建立和植株再生用普通小麦“郑麦9023”的幼胚诱导愈伤组织,研究了培养基中不同浓度2,4-D、KT对愈伤组织诱导和愈伤组织继代培养的影响。发现诱导效果最好的培养基是含有3.0mg/L2,4-D的MS培养基,出愈率最高达92.5%;愈伤组织进行继代培养的最佳培养基是含有1.0mg/L 2,4-D和0.1mg/L KT的MS培养基;最佳的悬浮培养基是含有1.0mg/L 2,4-D和0.1mg/L KT的MS培养基;最佳的悬浮系继代天数为14d;悬浮系中的成熟胚在基本培养基上可以发育成正常的植株。据此,建立了快速高效的小麦遗传转化体系。3.利用酵母双杂交系统筛选与TaRHA2b互作的蛋白以混合的大麦的胚为材料,构建均一化cDNA文库;构建诱饵蛋白载体p GBKT7-TaRHA2b,转化酵母AH109细胞,进行了自激活检测;通过一对一酵母共转、二缺及四缺培养基筛选、β-半乳糖苷酶显色反应筛选候选阳性克隆;以及一对一体内再共转及体外pull down实验进行再次验证。成功构建了滴度为1.2×106cfu/m L、库容为1.1×106的大麦胚的均一化cDNA文库,插入片段大小在1000-3000bp之间;对cDNA文库进行大规模质粒提取及测序,得到了5000个质粒,获得了120个大片段的序列信息;成功构建了没有自激活功能的诱饵载体,在四缺培养基上筛出132个候选蛋白,β-半乳糖苷酶显色反应呈阳性的有84个,获得了52个有效序列信息,挑选其中的8个做了体内及体外验证,结果表明是阳性的。通过酵母双杂交体系筛选出在酵母细胞内能与TaRHA2b蛋白结合的蛋白包括YTH2450、YTH2456和YTH2476等。这些结果有利于阐述TaRHA2b基因参与调控的具体信号转导通路。4.编码互作蛋白基因的克隆及功能分析以大麦叶片来源的DNA和RNA做模板,采用RT-PCR扩增YTH2450,YTH2456和YTH2476三个基因;采用q RT-PCR对这三个基因的组织表达特异性以及ABA处理条件下的表达模式进行分析;同时分别构建了相应基因的过表达载体,进行了水稻的遗传转化和鉴定。结果表明,YTH2450和YTH2456基因没有内含子,YTH2476基因有5个内含子;三个基因均有较强的组织特异性,对ABA的响应达到显着水平;构建了三个候选基因的表达载体,成功地得到了株系,PCR结果鉴定有阳性株系。这些结果为进一步研究YTH2450,YTH2456和YTH2476三个基因自身的功能及阐明TaRHA2b和相应蛋白所形成的复合体的作用机制奠定了基础。5.外源RsRHA2b基因对小麦灌浆期关键酶活性及编码互作蛋白基因表达的影响以纯合的转RsRHA2b基因材料1477和对照小麦“郑麦9023”为材料,对灌浆期淀粉合成关键酶及蛋白质合成关键酶活性进行了研究,同时对相关基因的表达量做了荧光定量分析。结果表明,外源RsRHA2b基因的导入提高了淀粉合成关键酶SBE、SSS、AGPP、GBSS及蛋白合成关键酶GOGAT的活性,降低了蛋白合成关键酶GS的活性。同时,外源RsRHA2b基因的导入促进了YTH311、YTH611、YTH1065、YTH2437、YTH2438、YTH2456、YTH2496、YTH3049等基因的表达,抑制了YTH2433基因的表达。上述结果表明,外源RsRHA2b基因的导入所带来的CN代谢关键酶活性的变化及对相关基因表达的影响可能是转RsRHA2b基因小麦抗穗发芽能力增强的重要原因。6.小麦TaRHA2b基因在供体基因组及不同品种上的克隆及分析利用基因组PCR技术从乌拉尔图小麦（Triticum urartu）、拟斯卑尔托山羊草（Aegilops Speltoides）、粗山羊草（Aegilops tauschii）及22个小麦品种中克隆了RHA2b基因的序列,同时对22个小麦品种做了穗发芽特性的鉴定。结果表明,小麦祖先种中RHA2b基因序列的长度变化很大,最短的441bp,最长的476bp,小麦B组供体与A/D组供体相差35bp,它们分别对应的推导的成熟多肽含143和155个氨基酸。推导的一级结构都含有Zinc finger RING-type profile。22个品种的抗穗发芽能力差异较为明显。不同品种间RHA2b基因序列的长度变化不大,但是存在许多单核甘酸多态性位点的差别。这些结果有利于开发抗穗发芽分子标记和探索RHA2b基因介导小麦抗穗发芽能力增强的原理。
豆明珠[8]（2017）在《通过外源MYB基因的表达提高水稻的抗逆性》文中研究指明MYB基因家族是植物中数量最多的一类转录调控因子,R2R3-MYB基因是MYB基因家族中最大的一个亚家族。R2R3-MYB基因不仅参与植物的发育及代谢过程,同时还在生物胁迫以及非生物胁迫耐性中发挥重要作用。Am ROSEA1属于R2R3-MYB蛋白,是调节金鱼草花色素分布及密度的关键因子。Am Rosea1之前被引入烟草、番茄、矮牵牛以及棉花等多个双子叶物种中,并且显着提高了转基因植株花青素或其他次级代谢物的含量。为了研究Am Rosea1异位表达对于水稻生长发育的影响,我们将Am Rosea1转入日本晴水稻,检测了转基因水稻中花青素以及类黄酮的含量,并进行了高盐胁迫以及干旱胁迫实验。我们发现,外源Am Rosea1基因能够显着提高转基因水稻对于高盐胁迫以及干旱胁迫的耐性。我们对野生型水稻以及转基因水稻在正常生长环境以及高盐或干旱胁迫条件下的转录组进行了测序分析,发现一系列和胁迫相关的基因的转录水平受到了外源Am Rosea1的影响。这些受影响的基因涉及胁迫信号转导、激素信号通路、离子平衡以及活性氧的清除。实验结果如下:1、获得过量表达Am Rosea1的转基因水稻植株我们构建了35S启动子启动Am Rosea1过量表达的表达载体,并将其转入水稻栽培品种日本晴中。利用Am Rosea1特定的引物,对抗性苗进行PCR验证,共有24棵PCR阳性植株。半定量实验证明OXR20,OXR21和OXR22三个植株中Am Rosea1的表达量较高。2、测量花青素和总类黄酮的含量为检测Am Rosea1的过量表达对水稻花青素和总类黄酮积累量的影响,我们用分光光度法测量了成熟种子、三叶期以及抽穗期叶子中的含量,发现Am Rosea1的过量表达并没有影响转基因水稻植株中花青素和总类黄酮的含量。3、检测转基因植株对于高盐和干旱胁迫的耐性经干旱胁迫处理之后,OXR20、OXR21和OXR22的存活率分别为78%±5.6%,85%±8.2%和80%±7.1%,均高于WT植株20.8%±1.7%的存活率;高盐胁迫处理之后,OXR20、OXR21和OXR22的存活率分别为70%±5.9%、75%±5.6%和69%±4.3%,WT植株全部死亡。这些结果表明:过量表达Am ROSEA1基因显着提高了转基因水稻植株对于干旱和高盐胁迫的耐性。4、转录组分析为了研究转基因株系胁迫耐性的分子机制,我们将OXR21作为转基因株系的代表。取OXR21和WT在胁迫处理前以及胁迫处理不同时间点的叶片,进行转录组测序。筛选与胁迫响应相关的,在OXR21和WT之间差异表达的基因,结果如下:与WT相比,在PEG处理的0 h、6 h和24 h,OXR21中分别有64、282和50个干旱胁迫响应基因表达上调,49、240和33个干旱胁迫响应基因表达下调;在盐处理的0 h、1 h和6 h,OXR21中分别有49、197和58个盐胁迫响应基因表达上调,34、266和26个盐胁迫响应基因表达下调。对差异表达基因的venn分析表明:分别有8个和12个基因在PEG处理的0 h、6 h、24 h三个时间点和盐处理的0 h、1 h、6 h三个时间点的表达都上调;分别有20个基因在PEG处理的6 h、24 h和盐处理的1 h、6 h的表达上调;分别有15和26个基因在PEG处理的24 h和盐处理的6 h的表达上调。对差异表达基因的GO富集分析表明,在“生物学过程”这一类别里,干旱胁迫和盐胁迫的差异基因分别富集到6个GO term里,其中有4个是相同,它们是“对内源性刺激响应”“对非生物刺激响应”“对胁迫响应”和“对刺激响应”。KEGG分析表明,无论是在干旱胁迫条件下还是在盐胁迫条件下,与WT植株相比,转基因植株中的茉莉酸信号通路均被促进,而乙烯信号通路均被抑制。差异表达的基因里包含有钾离子高亲和运输蛋白、果糖基转移酶等与渗透保护相关的蛋白的编码基因,以及过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等与氧化胁迫相关的蛋白的编码基因。另外,RD22、热激蛋白、LEA蛋白和RAB16A,这些胁迫响应蛋白;转录因子DREB1F、MYB48和NAC134;信号转导分子,丝氨酸-苏氨酸激酶、CIPK14、CIPK15的编码基因的转录水平,在WT和转基因植株之间也表现出差异。另外,还有一些不知功能的基因的表达被改变。总之,Am ROSEA1在水稻中过量表达通过直接或间接地改变一系列基因的表达水平,使得转基因水稻植株获得了较WT高的盐胁迫耐性和干旱胁迫耐性。被子植物的胚乳由受精极核发育而来,为胚胎的发育提供一些信号。胚乳在种子发育的早期,为胚胎提供营养;在有永久胚乳的种子中,胚乳还为萌发时的幼苗提供营养。谷类种子的胚乳不仅是地球上人类和牲畜最重要的粮食资源,同时能为加工商品和生物燃料提供原材料。因此,研究胚乳的发育不仅具有重要的理论意义,还能产生经济效益。大多数被子植物的胚乳发育类型为核型,发育过程经历:合胞体期,细胞化,内层淀粉胚乳和外层糊粉层胚乳的分化以及细胞的程序化死亡。目前,对于胚乳早期发育的研究已经有了很大进展,但对于胚乳细胞死亡过程的研究仍十分有限。At ZOU基因编码的b HLH转录因子是调节拟南芥胚乳程序化细胞死亡的重要因子。作为重要粮食作物和单子叶模式植物的水稻,其种子中保留有永久性的淀粉胚乳。为研究水稻中ZOU同源基因在水稻胚乳发育以及胚胎发育中的功能,更好地认识水稻胚乳降解的调控机制,我们克隆了水稻中ZOU的同源基因,进行了基因表达分析,功能互补试验,构建了GUS报告载体、正义表达载体、反义表达载体并转化水稻。实验结果表明:1、水稻ZOU基因的进化与表达分析通过序列比对和进化分析,我们发现水稻中存在两个ZOU同源基因:LOCOs04g35010（Os ZOU-1）和LOCOs02g34320（Os ZOU-2）。通过实时荧光定量PCR检测它们在营养生长期水稻的根、茎、叶、拔节孕穗期的小花、花后2天、5天、7天以及9天的种子中的表达水平。发现Os ZOU-1在营养器官以及受精前的种子中表达量极低,在DAP2的种子中轻微表达,DAP5时表达量很高,之后降低。Os ZOU-2主要在茎和叶中表达,在种子中表达量极低。2、Os ZOU-1基因互补拟南芥zou-4突变体表型转化At ZOUpromoter::Os ZOU-1的拟南芥zou-4突变体的表型得到部分回复;转化At ZOUpromoter::Os ZOU-2未能改变zou-4突变体的表型。3、通过GUS染色检测Os ZOU-1在种子中的表达模式用报告载体Os ZOU-1promoter::GUS转化水稻,我们发现,在受精后3天的种子上没有GUS信号;受精后5天的种子整个胚乳区都有GUS信号;之后GUS信号的范围逐渐缩小至种子的背部区域。4、Os ZOU-1组成性表达水稻植株的表型用组成性过量表达的载体Ubipromoter::Os ZOU-1转化水稻,转化株系表现出与At ZOU组成性过表的拟南芥株系（zou-1D）相似的表型:植株矮小,叶片窄且沿叶边缘向上卷曲,育性降低。另外我们还发现:组成性过表株系的颖壳细胞变小导致颖壳变窄进而导致种子窄;淀粉胚乳积累不充分,不能完全充满整个果皮。5、Os ZOU-1表达沉默的水稻植株的表型用反义载体ZOUpromoter::Os ZOU-1anti-sense转化水稻植株,转基因种子未能正常进行PCD,胚胎同胚乳粘连在一起;沉默株系种子的生长停滞在大约受精后第8天;淀粉积累明显较WT少。上述结果证明:Os ZOU-1在水稻胚乳发育中起到了调控水稻胚乳程序性细胞死亡的作用。Os ZOU-1过量表达以及Os ZOU-1表达沉默的种子中,淀粉积累均不足,我们推测胚乳程序性细胞死亡影响淀粉的积累。本研究的创新点:本研究首次将Am Rosea1基因导入到水稻（Oryza sativa L.）中。异位表达的Am ROSEA1通过直接或间接地调节不同基因的表达,提高了转基因水稻对高盐和干旱胁迫的耐受,这为利用该基因提高其他水稻品种的非生物胁迫耐受提供了一条可能的途径。本研究首次报道了Os ZOU基因在调控水稻胚乳程序性细胞死亡中的功能,以及PCD异常的水稻种子中淀粉胚乳的积累情况,有助于我们更好地认识水稻种子发育过程中,胚乳细胞程序性死亡的调节机制以及营养物质代谢同结构发育之间的关系。
蒋晶晶[9]（2012）在《白菜花粉发育和授粉受精相关基因的表达分析与功能验证》文中指出花粉发育和授粉受精是植物生命周期中的重要环节,直接关系到蔬菜等农作物的产量高低、质量好坏、种子多少和品质优劣等。花粉发育和授粉受精过程的机制极其复杂,涉及众多基因的表达与调控。目前对这两个过程的已有研究成果尚不足以全面深入认识该过程。同时从转录组水平、转录后调控及基因表达与功能验证等三个方面对花粉发育和授粉受精进行分析,将为认识这两个相互独立又紧密联系的过程的分子调控机制提供入口和契机,具有十分重要的理论意义和应用价值。本文以白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino, syn. B. rapa ssp. chinensis）‘矮脚黄’核不育（’Aijiaohuang’ genic male sterility, ajhGMS）两用系’Bcajh97-01A/B’、’Polima’核质互作不育（polima genic-cytoplasmic male sterility, polG-CMS）系’Bcpol97-05A’以及’Ogura’细胞质不育（ogura cytoplasmic male sterility, oguCMS）系’Bcogu97-06A’为材料,在通过授粉实验确定白菜‘矮脚黄’授粉受精过程的不同阶段及其所经历的时间的基础上,采用拟南芥全基因组表达谱芯片（GeneChip（?） Arabidopsis ATH1genome array, ATH1）分析’Bcajh97-01A’授粉前后雌蕊的转录组差异；继而对Bcajh97-01A’授粉前后的雌蕊,以及3个不育系及其共享保持系的花序进行microRNA （miRNA）的表达差异分析,筛选白菜中与花粉发育及授粉受精相关的miRNA；随后,对两个类果胶酸裂解酶基因Brassica campestris pectate lyase like9（BcPLL9）、BcPLL10及一个新基因IBrassica campestris male fertile21（BcMF21）进行结构、表达、进化等分析,并采用反义RNA技术对其分别受抑制后的转基因芽系进行形态学、分子生物学、细胞学等鉴定,分析其在白菜花粉发育和授粉受精中的作用机制。取得的主要结果与结论如下：（1）植株形态和细胞学观察结果表明白菜授粉受精过程可划分为4个特征时期。以ajhGMS不育株系’Bcajh97-01A’为母本,可育株系’Bcajh97-01B’为父本,观察授粉后,花粉在柱头萌发和在花柱中的生长情况。其授粉受精过程表现出4个特征时期,其中时期Ⅰ（0～2HAP）为花粉粘附、吸水和萌发,即花粉萌发期；时期Ⅱ（2～4HAP）为花粉管在花柱中生长；时期Ⅲ（4～16HAP）为花粉管在子房中生长,发生受精,即花粉管生长和受精期；时期Ⅳ（16～24HAP）为胚胎发育早期。（2）通过ATH1芯片分析,比较白菜授粉前后雌蕊转录组的差异,发现了77个授粉前后差异表达基因；将其与花粉发育相关基因进行比较,发现了10个花粉发育和授粉受精持续表达白菜同源基因。通过拟南芥ATH1芯片分析白菜’Bcajh97-01A’授粉前后雌蕊转录组差异,在授粉后雌蕊中检测到44个上调表达和33个下调表达的基因,对它们进行功能分类发现上调表达基因中有20%与细胞壁代谢相关。通过授粉受精相关基因与前人报导的花粉发育相关基因进行比较,发现At2g02720等10个基因在花粉发育和授粉受精过程均表达上调,表现出持续表达。并且这10个基因中有7个与细胞壁发育相关,其中包含两个PLL基因（At2g02720, PLL9和At3g01270, PLL10）。（3）白菜3个雄性不育系与其共同保持系花序的miRNA表达差异分析,表明不同遗传模式不育系花序miRNA表达具有相似性。利用植物microRNA μParafloTM微流体芯片（miRNA芯片）对白菜ajhGMS ’Bcajh97-01A’、polG-CMS ’Bcpol97-05A’和oguCMS ’Bcogu97-06A’及它们共同的保持系’Bcajh97-01B’的花序进行miRNA表达的比较分析,在’Bcajh97-01A’与’Bcajh97-01B’花序中检测到属于7个miRNA家族的差异表达的miRNA为11个；在’Bcpol97-05A’与’Bcajh97-01B’花序中检测到属于23个miRNA家族的差异表达的miRNA为64个；在‘Bcogu97-06A’与’Bcajh97-01B’花序中检测到属于20个miRNA家族的差异表达的miRNA为70个。其中,在3个不育系中共同下调表达的miRNA基因家族有1个（miR894）、上调表达的有2个（miR172和miR399）。’Bcajh97-01A’和Bcpol97-05A’共同下调和上调表达：miRNA家族分别为1个和4个；’Bcajh97-01A’和’Bcogu97-06A’共同下调和上调的miRNA分别为1个和2个；’Bcpol97-05A’（?）（?）’Bcogu97-06A’共同下调和共同上调表达的miRNA分别为8个和7个。这些结果表明不同遗传模式不育系花序miRNA表达具有相似性。采用miRNA芯片对白菜’Bcajh97-01A’授粉前后的雌蕊进行分析,发现属于4个miRNA家族的6个miRNA下调表达,属于4个miRNA家族的16个miRNA上调表达。将授粉受精相关miRNA与花粉发育相关niRNA进行比较,发现有6个miRNA家族（miR896、miR1450、miR172、miRNA168、miR396和miR158）在两个过程均差异表达。通过对所有检测获得的差异表达miRNA进行比较,发现参与花粉发育或授粉受精的非冗余miRNA共30个。通过查找已发表的数据发现,在它们中,有近70%曾被报导在花粉中表达。（4）通过基因表达和功能分析,发现花粉和雌蕊特异表达的类果胶酸裂解酶基因BcPLL9与花粉壁内壁相关。采用同源克隆的方法获得白菜类果胶酸裂解酶基因BcPLL9的cDNA（?）（?）DNA全长,核酸结构和氨基酸结构分析表明其具有果胶酸裂解酶基因的特征。qRT-PCR和组织原位杂交分析表明BcPLL9的转录本在成熟花粉粒、雌蕊的柱头、花柱上部中表达。采用反义RNA技术抑制BcPLL9的表达后,发现转基因植株的花粉活力部分下降,当花粉体外萌发时,花粉管生长无力,管壁处于松散的状态,不像对照那样紧贴花粉管质膜；花粉管生长长度变短。形态异常的花粉管比例为44.8%。花粉管体内萌发时能穿过柱头组织,但是到达胚珠的花粉管比例降低,结籽数减少。BcPLL9反义RNA转基因植株的成熟花粉粒出现异常的胼胝质沉积,萌发沟部位异常突起,花粉内壁缺少清晰的内壁内层和内壁外层结构。（5）通过基因表达和功能分析,发现花粉和雌蕊特异表达的类果胶酸裂解酶基因BcPLL10与花粉壁发育相关。采用同源克隆的方法获得白菜类果胶酸裂解酶基因BcPLL10的cDNA和DNA全长,核酸结构和氨基酸结构分析表明其同样具有果胶酸裂解酶基因的特征。qRT-PCR和组织原位杂交分析发现BcPLL10在成熟花粉粒、雌蕊的柱头、花柱和胚珠中表达；采用反义RNA技术抑制BcPLL10基因的表达后,发现转基因植株的花粉大小、形态不一,萌发沟位置异常,含油层外溢并包裹整颗花粉粒,有时导致花粉粘连。萌发沟处内壁外层过度增厚,内壁内层变薄；非萌发沟处内壁的内层和外层结构不明显。（6）通过PLL基因家族的结构和进化模式分析,发现白菜PLL基因在其3个亚基因组上有不同的分布密度,表达模式趋向保守；PLL8、PLL9、PLL10、PLL11可能是来自基因新功能化或亚功能化。通过对白菜46个PLL基因在其3个亚基因组的分布情况分析发现有18个位于高密度模块（less fractionized, LF）上,分别有16个和12个位于两个低密度模块（more fractionized, MF1和MF2）上。这一结果支持芸薹属进化过程中经历两次四倍化跟随两次基因丢失过程的假说。对植物PLL基因的结构进行分析,发现PLL8、PLL9、PLL10、PLL11具有不同于其它PLL的N端保守结构域。对白菜PLL基因的表达分析发现BcPLL8、BcPLL9、BcPLL10、BcPLL11在花药和雌蕊中特异表达,推测它们是由其祖先基因新功能化或亚功能化产生。（7）通过基因表达和功能分析,发现小孢子和绒毡层特异表达的BcMF21在花粉发育早期发挥作用。采用同源克隆和RACE-PCR技术对本实验室前期经cDNA-AFLP分析获得的差异表达片段（A18T19-4, BBP10/BPO054）克隆获得基因全长,通过核酸结构和氨基酸结构分析,发现其与已知基因同源性很低,可能是一个在花粉发育早期相关的新基因,逐按照本实验室命名与雄性育性相关的基因系统,命名为Brassica campestris male fertile21（BcMF21）;生物信息学分析表明其可能在信号转导中发挥重要作用；RT-PCR和原位杂交分析表明其在减数分裂、四分体和单核小孢子时期的绒毡层和小孢子中特异表达。BcMF21反义RNA转基因植株的花粉有48.2%表现出个体小、干瘪、内陷；而个体大小正常,饱满的花粉的萌发沟附近的外壁被一层类似油脂类的物质覆盖,不具有清晰的网纹结构。这些结果表明BcMF21可能通过信号转导途径而在花粉发育早期发挥作用。
李朝霞[10]（2011）在《磷匮乏影响玉米根系发育机制的研究》文中研究表明土壤有效磷供给不足和磷资源匮乏将引起未来的农业危机。在我国玉米主栽区,土壤有效磷不足已成为限制作物产量和增加生产成本的重要因素之一。同时,磷肥的大量使用也带来了水域富营养化等生态问题。因此,利用作物固有的生物学特性,挖掘作物自身对磷素高效吸收利用的潜力来解决上述问题已成为植物生物学研究中的热点领域。由于土壤磷素移动性差,根系的生长发育和形态结构对磷素吸收尤为重要,同时根系还可通过合成生长调节物质（如CTK、ABA等）来调控整个植株的状态包括叶片衰老、光合速率、气孔开度等。玉米是最重要的农作物之一,其根系特点与拟南芥明显不同,其发育调控机理也可能有差异,研究磷营养影响玉米根系发育的机制对于培育磷高效玉米新材料有重要意义。本研究以玉米骨干自交系齐319（Q319）和其细胞工程突变体99038去胚乳幼苗为材料,比较了它们在不同供磷水平下的转录组差异；分析了低磷诱导的转录因子基因ZmPTF1的表达强度变化对玉米植株生长发育的影响及其作用机制；克隆了与生长素浓度梯度形成与维持相关的包含Zea mays auxin transporter protein 3（ZmAUX1）在内的4个生长素极性转运流入载体基因和包含ZmPIN1a和ZmPIN1b在内的13个生长素极性转运流出载体基因,并进行了表达谱分析和启动子序列分析；利用农杆菌介导法将正反向的ZmAUX1、ZmPIN1a和ZmPIN1b基因导入到了玉米骨干自交系DH4866中,获得了纯合的转基因植株,对转基因植株的生长发育状况、产量性状、根系构型和对低磷环境的反应进行了分析。在本工作中,获得了具有很好应用前景的转ZmPTF1基因和转ZmPIN1a基因的玉米育种材料。玉米自交系Q319和99038的根系转录组比较分析利用玉米全基因组芯片（microarray）检测了低磷处理0、2、8d的玉米自交系Q319和99038的根尖和侧根原基发生区的转录组变化。该芯片含47K的玉米寡核苷酸探针,后者代表3万多个基因。设在3个生物学重复中符合ratio≤0.66 or ratio≥1.5且p≤0.1 （t-test）的基因为有意义的差异基因。低磷处理前,在根尖区中99038比Q319中表达上调的基因有470个,表达下调的基因有542个；而在侧根原基发生区99038比Q319中表达上调的基因为621个,表达下调的有572个。在低磷处理2d后,与Q319的相比,99038根尖表达上调的基因有343个下调的有245个；在侧根原基发生区99038比Q319上调表达的基因有272个下调表达的有270个。在低磷处理8d后,在根尖区,99038比Q319表达上调的基因为984个,表达下调的为812个；在侧根原基发生区99038比Q319表达上调的基因为601个,表达下调的为457个。这些差异表达基因的功能分类表明,Q319和99038根系在低磷处理的不同时间点上存在着不同的应答反应,根的不同部位对低磷胁迫的响应也存在差异。在这些差异表达基因中,约有50%的差异基因功能不清楚,其余大多数与代谢相关,其次与细胞信号转导、转录、细胞增殖关联等。这些结果表明,玉米根系对低磷胁迫的应答是一个复杂的过程,存在多个适应或调节机制。在低磷处理前,一些参与乙烯和生长素代谢及信号途径的基因,其表达强度在两基因型之间存在显着差异。1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid（ACC） oxidase编码基因（对应探针号：TM00025945、TM00042027）和acc synthase编码基因（TM00018872）的表达在99038的侧根原基发生区显着低于Q319的,而在根尖区却高于Q319的,提示由腺苷甲硫氨酸生成乙烯的强度可能在99038和Q319的不同部位根区段中存在差异。在乙烯信号途径中位于CTR1下游的膜结合蛋白EIN2（ethylene insensitive 2, TM00057348）和乙烯应答转录因子（ethylene-responsive factor-like protein 1,ERF1, TM00030445）和ethylene-responsive small GTP-binding protein（TM00014304）在99038侧根原基发生区的表达量也显着低于Q319的,乙烯响应元件结合蛋白（ethylene responsive element binding factor 3,TM00018574和TM00042351）等基因的表达在99038的根尖高于Q319的。这些结果表明乙烯信号转导途径参与了99038更发达根系的形成。生长素是调控植物根系发育的核心激素之一,参与了植物对低磷胁迫的反应。生长素的极性转运对生长素浓度梯度的形成、生长素信号的启动、生长素调控生长发育过程至关重要。生长素极性转运流入载体AUX1-like permease （TM00029483）的表达在99038根尖和侧根原基发生区显着高于Q319的,可能与99038侧根数量有关。TM00003447编码phosphatase 2A的调节亚单位,在99038的侧根发生区表达强度远低于Q319的。该酶通过磷酸化与去磷酸化作用可逆调节生长素流出载体PIN蛋白的分布,这暗示着在该区段生长素流出速率大幅度降低,有利于生长素在此处的积累。PGP1 （TM00020888）是参与生长素极性运输的另一类载体,也在两个基因型中的表达强度差异表达。TM00047995编码IAA-Ala hydrolase,该酶水解IAA-Ala复合物产生有活性的IAA,在侧根发生区99038的转录丰度显着高于Q319的,而在根尖区却低于Q319的,这与99038的根系形态相对应。Tryptophan synthase （TM00016868）、putative tyrosine/dopa decarboxylase （TM00005060）、indole-3-glycerol phosphate lyase（TM00005958）和.cinnamic acid 4-hydroxylase （YUCCA,TM00025513）等IAA生物合成中的关键酶基因也在这两个基因型间差异表达,可能导致局部IAA的合成或活性IAA的浓度在99038和Q319中出现差异。另外,玉米中的生长素结合蛋白auxin binding protein1 （ABP1, TM00041857）、auxin-induced in root cultures protein 12（TM00055925）和GH3家族成员（TM00048104）等生长素信号途径或应答基因在两个基因型之间的表达也出现差异。以上这些差异暗示着根系不同区段的IAA含量及活性的变化、以及信号途径及下游基因的表达差异很可能是造成两个基因型根系形态差异的主要因素之一生长素和乙烯的合成、代谢和信号转导及调控参与了玉米对低磷胁迫的应答。在低磷处理2d和8d的植株中,生长素极性运输和分布调节相关基因的表达在99038和Q139之间存在明显差异,可能低磷胁迫通过影响生长素极性转运而影响整个植株的生长状态。与足磷供给条件下相比,MAP3K、MAPK4、MAPK5、MAPK6等基因在根尖区呈下调表达,MAPK信号系统可能参与了低磷胁迫信号的转导及代谢变化。乙烯信号途径中的EIN3、ERF1、赤霉素信号途径中的Gibberellin-regulated protein 2等基因的差异表达可能与低磷胁迫下侧根发生和两个基因型在低磷胁迫下的根系差异有关。99038和Q319对生长素、乙烯信号反应的差异很可能是造成它们对低磷胁迫响应差异的重要原因。一些转录因子和在信号转导及生长发育中起重要作用的基因,如14-3-3、ABP1、AUX1、RHD3、ROP6、SGR2、BRI1等,在两个基因型间或／和在低磷处理前后出现表达丰度的差异,提示它们参与了玉米根系发育的调控和对低磷胁迫耐的响应,可作为玉米根系改良和磷高效育种的操控靶标。过表达ZmPTF1改进了玉米根系发育和耐低磷特性前期工作中,实验室通过RACE的方法克隆到ZmPTF1基因,该基因编码具有bHLH（basic helix-loop-helix domain）结构域的转录因子,与水稻的OsPTF1有高的相似性。该基因在根中受低磷胁迫诱导表达。ZmPTF1过表达株系在不同介质培养条件下根系发达,根系明显大于对照和转反义基因植株的。当生长于低磷土壤中,ZmPTF1过表达株系具有较多的雄穗分支数和较饱满的籽粒,受低磷胁迫影响较小。过表达ZmPTF1导致了一些低磷胁迫响应基因如RNases. vacuolar H+ pyrophosphatase(H+-PPase]、PEP carboxykinase等在正常磷供给下高量表达。糖含量测定表明,ZmPTF1过表达株系叶片中可溶性糖浓度（Glu+Fru+Suc）低于对照和转反义基因植株的,而根中的可溶性糖浓度高于对照和转反义基因植株的。对蔗糖合成和分解代谢相关基因的表达分析发现,过表达ZmPTF1导致了蔗糖合成关键基因fructose-1,6-bisphosphatase和sucrose phosphate synthase 1的表达在叶片中显着提高,在根中明显低于对照植株的。同时,参与蔗糖代谢的酶基因在过表达株系根中的表达量也低于对照的。ZmPTF1过表达导致了玉米代谢和根系形态发生变化,当遭受低磷胁迫时,这些特征能促进过表达株系较快适应低磷环境,减少了低磷对玉米生长发育和产量的影响。该工作为深入了解ZmPTF1-耐低磷-根系形态-糖之间的关系积累了重要资料,提供了一个通过基因工程育种来提高作物对低磷环境的耐性的成功实例。获得的转基因材料己通过转基因生物安全性中间试验,并提供给多家育种单位用于育种。生长素极性运输相关基因在玉米根系发育中的表达变化生长素极性运输使生长素在植株体内形成以器官顶端为中心的浓度梯度,并维持植物不同组织中的生长素浓度差,以调控植物的生长发育。介导生长素极性运输的蛋白有AUX1/LAX家族、PIN-formed家族,ABCB家族蛋白。拟南芥和水稻中分别含有4个可能的生长素流入载体,8个和12个PIN蛋白家族成员。通过生物信息学预测和RT-PCR从玉米克隆出4个可能的生长素流入载体,13个可能的生长素流出载体。与拟南芥和水稻中生长素输入／出载体相比较,发现早期报道的玉米ZmAUX1（rename=Zm auxin transporter protein 3）与拟南芥auxin transporter 2和3、水稻Os auxin transporter protein 3的序列相近,在氨基酸组成、长度、等电点和分子量上差异不大。在克隆的13个可能的玉米生长素流出PIN-like基因中,与AtPIN1同源的基因有4个,分别为ZmPIN1a、ZmPIN1b、ZmPIN1c和ZmPIN1d。ZmPIN1b和ZmPIN1c在玉米基因组上对应于同一段序列,推测认为它们是同—mRNA前体可变剪接的产物,与OsPIN1a有较高的相似性。ZmPIN1a是水稻OsPIN1c的同源基因,玉米ZmPIN1d与水稻OsPIN1b和OsPIN1d亲缘关系近。与AtPIN5同源的玉米基因有5个,分别定位于玉米的3、4、8、2、1染色体上,编码产物相似性较高。与AtPIN8同源的玉米基因只1个,命名为ZmPIN8。在玉米中还有一个与水稻OsPIN9同源的基因,命名为ZmPIN9。未找到AtPIN2、AtPIN4、AtPIN6和AtPIN7在玉米中的同源基因,在水稻基因组中也未发现AtPIN4、AtPIN6和AtPIN7的同源基因。启动子元件分析发现Zm auxin transporter protein 3可能更多的参与干旱胁迫诱导的反应,而Zm auxin transporter protein 2和Zm auxin transporter protein 4则在伤害反应中起作用。PIN1家族对冷、热胁迫的响应可能主要是通过ZmPIN1b/c完成的,而ZmPIN1a在干旱、ABA的应答反应中起主要作用。ZmPIN1a表达可能是受干旱、内源ABA、GA、乙烯等调控,在植株形态建成和生长发育中起重要作用。ZmPIN3b基因可能受MYBHvl的调控。ZmPIN3a和ZmPIN3b可能参与了损伤反应及形态发生,并对环境胁迫发生反应,受玉米素、赤霉素和生长素浓度梯度或信号途径的调控。ZmAUX1在地上部分的表达丰度远高于根中,如在萌发4d的小苗中幼叶的表达丰度是幼根的5倍多。推测该基因在生长素从地上部分向地下部的转运中起关键作用。生长素流出载体ZmPIN1b,ZmPIN1a表达强度相对高,ZmPIN3a、ZmPIN3b、ZmPIN5a、ZmPIN5b、ZmPIN5c、ZmPIN8、ZmPIN9的表达在5叶期玉米中表达强度很低。这些基因在种子萌发期活跃表达暗示着它们参与了植株早期生长与发育。生长素极性转运相关基因在5叶期玉米的叶片、侧根发生区和根尖区具有不同的表达丰度。各基因对低磷胁迫的响应也与器官部位有关。在侧根发生区ZmAUX1、ZmPIN1a、ZmPIN1b受低磷胁迫的诱导,而ZmPIN1c表达却被低磷胁迫抑制。在根尖和叶片中ZmPIN1a的表达受低磷胁迫的诱导,而其它基因的表达受到抑制。以上结果表明,生长素极性运输相关基因参与了玉米形态建成和生长发育的调控,参与了对低磷胁迫的应答。转ZmPIN1a/1b基因和ZmAUX1基因对玉米生长发育和磷胁迫抗性的影响在对生长素极性转运相关基因分析的基础之上,构建了ZmPIN1a、ZmPIN1b和ZmAUX1的正、反向植物表达载体,通过农杆菌介导的转化法将它们分别导入到玉米优良自交系DH4866中,获得了纯合的转基因植株,在此基础上研究了ZmPIN1a、ZmPIN1b和ZmAUX1的表达强度变化对玉米生长发育、根系构型和对低磷环境反应的影响。转正义ZmPIN1b或ZmPIN1a基因植株的根系比WT和转反义基因植株的发达,其中以转正义ZmPIN1a基因的更为明显,表现为种子根长、侧根数目增多,根体积变大。生物量测定表明,转正义ZmPIN1a基因的根系生物量显着高于WT的,而茎叶生物量明显低于WT的。在SP营养液培育下,转正义ZmPIN1a株系玉米根系较发达,虽然种子根数和冠根数与WT植株基本无差异,但侧根是对照植株的121～173%。转反义ZmPIN1a株系的侧根数目则为WT植株的82%～106%。根长度分析揭示,转正义ZmPIN1a植株的初生根长度显着高于WT及反义株系的,但平均根长却显着低于WT和转反义基因株系的,形成了种子根较长侧根密集的表型。当在LP营养液中生长时,各株系均表现出适应性变化,主要表现在初生根增加,侧根数目减少,而ZmPIN1a基因过表达的效果更加明显。比较低磷条件下不同株系的性状差异,得出转正义ZmPIN1a植株的根数目是WT的141%～261%,但总根长是WT的98%～132%,即过表达ZmPIN1a促进侧根发生这与低磷胁迫下生长素浓度梯度的局部变化相对应。分析成株期植株的形态,发现转正义ZmPIN1a基因植株下部茎节间变短、穗位和株高均降低、侧根数目增多、根系涉猎面积显着增大,从而提高了植株对水分和养分的吸收能力,有利于产量提高。所创造的种质材料可能在玉米耐密植育种中有很好的应用价值。ZmPIN1b基因转正义基因植株的茎叶生物量高于WT的,但未达到差异显着程度,根系生物量则显着高于WT的。其反义株系的表型和生物量与WT无明显差别。在SP营养液培养下转正义ZmPIN1b基因的植株根数目比WT增加,为WT的129%～146%,根总长是WT的114%～138%。而转反义基因株系的根数目和根总长比WT略有下降。在LP营养液中培养时,转正义基因植株和转反义基因植株都表现出对低磷胁迫的敏感性降低,侧根数、总根数和SP培养液中的植株相差不大,与WT对低磷胁迫的应答有显着差异。可能ZmPIN1b影响了玉米在低磷胁迫条件下根系的适应性变化。转ZmAUX1正、反义株系的分析表明,过表达ZmAUX1的植株在低磷环境中能维持较高的生物量和较好长势。并且ZmAUX1的过表达调节其它生长素极性运输相关基因的表达。该实验结果表明,通过调节生长素极性运输强度来改变玉米植株构型及根系构型是可行的,为玉米抗逆育种和高产育种提供了新思路。ZmPIN1a基因过表达对植株转录组影响采用Real-time RT-PCR方法分析了过表达和抑制表达ZmPIN1a对生长素极性转运相关基因表达的影响,发现过表达ZmPIN1a引起ZmAUX、ZmPIN1b、ZmPIN1c、ZmPIN3b、ZmPIN3b在幼叶和幼根中上调表达,在多数转反义基因株系中这些基因则不同程度下调表达。ZmAUX1表达强度在过表达株系叶中是对照的3-6倍,在根中是对照的1.4-2.2倍;ZmPIN1b表达强度变化在根中和ZmAUX1相近,在叶中则低于ZmAUX1的,是对照植株的2-5倍；ZmPIN1c也表现出同样的变化趋势,但变化幅度较小。PIN3的2个成员的表达也受到ZmPIN1a过表达的诱导,且变化幅度大,但与ZmPIN1a的表达强度对应关系不明显。ZmPIN5、ZmPIN8、ZmPIN9这几个短loop的PIN基因表达变化不明显。采用数字表达谱分析了不同供磷状态下ZmPIN1a正、反义株系和对照的叶片和根中的差异表达基因,发现过表达ZmPIN1a对转录组有较大影响,抑制ZmPIN1a表达对转录组影响相对较小,尤其在根中。过表达ZmPIN1a植株的根系形态和株型发生了显着变化,转录组分析表明这些变化是大量基因表达变化引起的体内代谢反应及生长发育调整的结果。生长素和乙烯的代谢及信号转导途径明显受到ZmPIN1a表达水平的影响,光合作用在过表达ZmPIN1a植株中增强。另外,在过表达ZmPIN1a基因植株中一些中间代谢产物出现积累,昼夜节律相关因子出现不同变化趋势。这些资料为深入了解生长素极性转运与玉米株型之间的关系提供了大量信息。本工作利用两个对低磷胁迫响应有明显差异的玉米自交系为材料进行了转录组比较,鉴别出一些可能在玉米低磷胁迫反应和根系发育中起重要作用的信号途径和相关基因；克隆并系统分析了玉米生长素极性转运相关基因,初步确定了它们的表达与玉米耐低磷特性的关系；通过转基因植株的鉴定和分析确定了过表达或抑制表达ZmPTF1、ZmPIN1a、ZmPIN1b、ZmAUX1基因对玉米生长发育和耐低磷特性的影响,选出了在玉米育种上有很好应用价值的转基因新种质。
二、水稻bicoid反义基因转基因植株胚胎发育的形态变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、水稻bicoid反义基因转基因植株胚胎发育的形态变化（论文提纲范文）
（1）利用TaLEC基因建立小麦再生体系和创制小麦大粒新种质（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 小麦籽粒大小和粒重的研究现状 |
| 1.2 小麦再生和遗传转化的研究现状 |
| 1.3 转录因子LEC1和LEC2的功能 |
| 1.3.1 LEC1和LEC2转录因子对胚胎发育的影响 |
| 1.3.2 LEC1和LEC2转录因子对种子成熟和存储化合物积累的影响 |
| 1.3.3 LEC1和LEC2转录因子对种子大小的影响 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料与其生长培养条件 |
| 2.1.2 菌株与质粒载体 |
| 2.1.3 酶及其生化试剂 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 引物序列合成 |
| 2.1.6 DNA测序 |
| 2.1.7 实验引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物组织中总RNA的提取 |
| 2.2.2 反转录合成第一链的cDNA |
| 2.2.3 植物组织中DNA的提取 |
| 2.2.4 培养基的配置 |
| 2.2.5 克隆构建载体 |
| 2.2.5.1 PCR反应扩增目的片段 |
| 2.2.5.2 目的片段的胶回收 |
| 2.2.5.3 载体的连接与转化 |
| 2.2.5.4 质粒DNA的提取 |
| 2.2.6 表达载体的构建 |
| 2.2.6.1 酶切连接反应 |
| 2.2.6.2 表达载体的连接转化 |
| 2.2.7 根瘤农杆菌的连接转化 |
| 2.2.8 DNA产物纯化 |
| 2.2.9 小麦TaLEC-OX、amiRLEC和TaLEC2-DOWN表达载体的构建 |
| 2.2.10 农杆菌介导的小麦遗传转化实验 |
| 2.2.11 转基因小麦阳性植株的鉴定 |
| 2.2.11.1 bar试纸条鉴定 |
| 2.2.11.2 PCR鉴定 |
| 2.2.12 mRNA原位杂交实验 |
| 2.2.12.1 小麦胚的固定与包埋 |
| 2.2.12.2 制备探针 |
| 2.2.12.3 组织切片 |
| 2.2.12.4 脱蜡和复水 |
| 2.2.12.5 杂交液的配制 |
| 2.2.12.6 杂交后处理 |
| 2.2.12.7 信号检测 |
| 2.2.13 苏丹红染色 |
| 2.2.14 转基因小麦幼胚石蜡切片实验 |
| 2.2.14.1 材料的固定 |
| 2.2.14.2 脱水与浸蜡 |
| 2.2.14.3 复水和染色 |
| 2.2.15 烟草的瞬时转化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TaLEC2、TaLEC1基因的克隆和进化树分析 |
| 3.2 TaLEC2、TaLEC1蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3 TaLEC2、TaLEC1基因的表达模式分析 |
| 3.4 TaLEC基因在小麦中的遗传转化 |
| 3.5 过表达TaLEC2和TaLEC1对体细胞胚和胚性细胞形成的影响 |
| 3.5.1 过表达TaLEC2-3D对Fielder小麦胚性细胞的诱导作用 |
| 3.5.2 TaLEC2-3D-OX对其它小麦种质材料胚性细胞的诱导作用 |
| 3.5.3 TaLEC2-3D-OX诱导体细胞胚发生的组织学观察 |
| 3.5.4 TaLEC2-3D-OX诱导体细胞胚发生的扫描电镜观察 |
| 3.5.5 T2代TaLEC2-3D-OX转基因小麦幼胚外植体上体细胞胚和胚性细胞团的观察 |
| 3.5.6 TaLEC2-3D-OX愈伤组织中胚胎特异基因的表达 |
| 3.5.7 TaLEC2-3D-OX愈伤组织中生长素合成基因的表达 |
| 3.6 TaLEC2小麦转基因植株的表型分析 |
| 3.6.1 T0代TaLEC2小麦转基因植株的基因型鉴定 |
| 3.6.2 T1代TaLEC2小麦转基因植株的表型分析 |
| 3.6.3 T2代TaLEC2小麦转基因植株的表型分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TaLEC2基因调控体细胞胚的再生以及提高遗传转化效率 |
| 4.2 TaLEC2基因调控小麦的籽粒大小和粒重 |
| 4.3 TaLEC1基因促进胚性细胞的产生 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）草地早熟禾矮化突变体的遗传差异分析及DXS1基因功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 太空环境对植物生物学的影响 |
| 1.1.1 太空环境的诱变因子 |
| 1.1.2 太空环境诱变因子对植物的影响 |
| 1.1.3 牧草和草坪植物空间生物学研究进展 |
| 1.2 草地早熟禾育种研究进展 |
| 1.2.1 草地早熟禾简介及其应用 |
| 1.2.2 草地早熟禾生殖特性 |
| 1.2.3 草地早熟禾遗传育种进展 |
| 1.3 植物矮化研究进展 |
| 1.3.1 植物矮化突变的来源 |
| 1.3.2 植物矮化基因及矮化机理研究 |
| 1.4 植物萜类物质研究进展 |
| 1.4.1 萜类物质的种类及其在植物中的作用 |
| 1.4.2 萜类物质合成途径 |
| 1.4.3 MEP途径脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的、内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 2 草地早熟禾矮化突变体叶片组织细胞结构的差异分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 原始材料 |
| 2.1.2 空间诱变突变体M1-M4代植株的种植和选择 |
| 2.1.3 植株高度及叶片长宽度测量 |
| 2.1.4 叶片组织细胞结构观察 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 叶片上表皮细胞形态的差异 |
| 2.2.2 气孔参数的差异 |
| 2.2.3 叶片横切面组织结构的差异 |
| 2.2.4 叶片长宽比差异 |
| 2.3 讨论 |
| 3 草地早熟禾矮化突变体生理表型的差异分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 植株高度、内源激素和叶绿素含量的测定 |
| 3.1.3 非生物胁迫处理与分析 |
| 3.1.4 生物胁迫处理与分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 矮化突变体与野生型的植株高度及喷施赤霉素后的变化 |
| 3.2.2 矮化突变体与野生型的叶绿素含量 |
| 3.2.3 矮化突变体和野生型的内源激素含量 |
| 3.2.4 矮化突变体与野生型干旱胁迫下的生理反应 |
| 3.2.5 矮化突变体与野生型盐胁迫下的生理反应 |
| 3.2.6 矮化突变体与野生型对生物胁迫的抗性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 4 草地早熟禾矮化突变体转录组测序及分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 测序样品制备及检测 |
| 4.1.2 测序cDNA文库的构建 |
| 4.1.3 RNA-seq上机测序 |
| 4.1.4 无参考基因组序列的转录组信息分析 |
| 4.1.5 荧光定量PCR分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 矮化突变体和野生型植株的转录组测序概况 |
| 4.2.2 草地早熟禾转录组与其他植物的同源分析 |
| 4.2.3 草地早熟禾矮化突变体与野生型的差异分析概况 |
| 4.2.4 植物矮化相关的差异表达基因的筛选 |
| 4.2.5 叶绿素合成代谢相关的差异表达基因的筛选 |
| 4.2.6 抗非生物胁迫相关的差异表达基因的筛选 |
| 4.2.7 抗病相关的差异表达基因的筛选 |
| 4.3 讨论 |
| 5 草地早熟禾脱氧木酮糖-5-磷酸合酶1基因的功能研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 DXS1基因克隆 |
| 5.1.3 DXS1基因序列和氨基酸序列的生物信息学分析 |
| 5.1.4 蛋白提取和Western Blot实验 |
| 5.1.5 内源激素和叶绿素含量测定 |
| 5.1.6 实时荧光定量PCR |
| 5.1.7 反义表达载体的构建及草地早熟禾的遗传转化 |
| 5.1.8 DXS1反义表达植株的转录组测序及差异表达分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 PpDXS1基因克隆及其在WT和A16中的序列比较 |
| 5.2.2 PpDXS1蛋白的生物信息学分析 |
| 5.2.3 PpDXS1基因在草地早熟禾不同组织中的表达分析 |
| 5.2.4 不同诱导因子对PpDXS1基因表达的调控 |
| 5.2.5 PpDXS1反义表达对草地早熟禾株高、叶绿素和激素含量的影响 |
| 5.2.6 PpDXS1反义转基因株系和对照植株的差异表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 6 启动子变异和G-box结合因子对PpDXS1基因表达的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 PpDXS1基因启动子序列的分离与克隆 |
| 6.1.3 启动子生物信息学分析 |
| 6.1.4 草地早熟禾原生质体分离及双荧光素酶表达系统 |
| 6.1.5 转录因子与启动子序列互作验证 |
| 6.1.6 遗传转化及鉴定 |
| 6.1.7 荧光定量PCR分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 PpDXS1基因启动子序列的获取及分析 |
| 6.2.2 PpDXS1启动子在原生质体双荧光素酶系统中的活性 |
| 6.2.3 PpDXS1启动子在草地早熟禾中的遗传转化分析 |
| 6.2.4 G-box结合因子对PpDXS1启动子活性的影响 |
| 6.2.5 G-box结合因子在草地早熟禾中的过表达分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 空间环境引起PpDXS1基因启动子插入/缺失突变 |
| 6.3.2 PpDXS1启动子变异影响了启动子活性 |
| 6.3.3 与变异区域结合的G-box结合蛋白对启动子活性有影响 |
| 7 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（3）小麦小分子RNA TaMIR1119/5086和转录因子基因TaNF-YB6;1分子特征和耐逆功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 植物miRNA的分子特征与作用机制 |
| 1.1.1 植物miRNA的分子特征 |
| 1.1.2 植物miRNA的作用机制 |
| 1.2 植物miRNA的生物学功能 |
| 1.2.1 参与生长激素信号传导 |
| 1.2.2 miRNA对植物生长发育的调控 |
| 1.2.3 植物miRNA与干旱胁迫 |
| 1.2.4 植物miRNA与盐分胁迫 |
| 1.2.5 植物miRNA与营养胁迫 |
| 1.2.6 植物miRNA与其他逆境的胁迫 |
| 1.3 NF-Y转录因子的结构特征和生物学功能 |
| 1.3.1 NF-Y转录因子的结构特征 |
| 1.3.2 NF-Y转录因子的生物学功能 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料及培养 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 小麦幼苗培养方法 |
| 2.1.3 转基因烟草植株的培养方法 |
| 2.2 供试基因的获得 |
| 2.3 供试基因的分子特征分析 |
| 2.4 TaMIR1119和TaMIR5086 作用靶基因的预测 |
| 2.5 供试基因在逆境下的表达特征分析 |
| 2.6 供试基因转基因烟草和小麦株系的建立 |
| 2.6.1 融合正反义双元表达载体的构建 |
| 2.6.2 供试基因的烟草遗传转化株系的建立 |
| 2.6.3 供试基因的小麦遗传转化株系的建立 |
| 2.7 供试基因转基因烟草植株耐逆能力鉴定 |
| 2.7.1 转基因烟草植株的表型鉴定 |
| 2.7.2 转基因烟草植株的光合参数、渗透物质含量和抗氧化酶活性的测定 |
| 2.7.3 转基因烟草株系耐逆相关基因的表达特征分析 |
| 2.7.4 干旱处理下野生型和转基因烟草植株的气孔关闭特征 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 耐逆因子的分子特征 |
| 3.1.1 TaMIR1119 的分子特征 |
| 3.1.2 TaMIR5086 的分子特征 |
| 3.1.3 TaNF-YB6;1 的分子特征 |
| 3.2 耐逆因子的表达模式 |
| 3.2.1 TaMIR1119 应答干旱逆境的表达模式 |
| 3.2.2 TaMIR5086 应答干旱逆境的表达模式 |
| 3.2.3 TaNF-YB6;1 应答干旱和盐分逆境的表达模式 |
| 3.3 耐逆因子转基因烟草和小麦株系的建立 |
| 3.3.1 TaNF-YB6;1 转基因烟草株系的建立 |
| 3.3.2 TaNF-YB6;1 转基因小麦株系的建立 |
| 3.4 耐逆因子介导植株抵御逆境胁迫的功能 |
| 3.4.1 TaMIR1119 介导植株抵御干旱胁迫的功能 |
| 3.4.2 TaMIR5086 介导植株抵御干旱逆境的功能 |
| 3.4.3 TaNF-YB6;1 介导植株抵御干旱和盐分的功能 |
| 3.5 TaMIR1119 转基因系中渗透调节物质含量和抗氧化酶活性 |
| 3.6 TaMIR5086 转基因烟草植株抗氧化酶基因的表达特征分析 |
| 3.7 TaMIR5086 转基因烟草的气孔开度 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（4）拟南芥胚胎发育中TOM40基因的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 拟南芥胚胎发育的研究进展 |
| 1.1.1 胚胎发育过程 |
| 1.1.2 胚胎模式建成及分子机理研究 |
| 1.1.3 胚乳的发育 |
| 1.2 线粒体蛋白运输机制的研究进展 |
| 1.2.1 线粒体蛋白的转运 |
| 1.2.2 线粒体外膜转运酶(TOM)复合体 |
| 1.3 TOM40的研究进展 |
| 1.3.1 TOM40的结构特征 |
| 1.3.2 TOM40的组装与转运机制 |
| 1.3.3 TOM40的生物学功能 |
| 1.3.4 植物线粒体外膜蛋白 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 拟南芥TOM40的生物信息学分析及突变体鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 植物材料与种植 |
| 2.2.3 AtTOM40基因突变体的鉴定与败育率统计 |
| 2.2.4 突变体自交和杂交后代的分离比统计 |
| 2.2.5 胚珠透明和胚胎发育过程的观察 |
| 2.2.6 胚乳细胞的自发荧光观察 |
| 2.2.7 回复载体的构建 |
| 2.2.8 拟南芥浸花法转基因及阳性植株的鉴定 |
| 2.2.9 本章所用引物 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 TOM40蛋白序列的生物信息学分析 |
| 2.3.2 突变体tom40-1和tom40-2均为杂合突变体 |
| 2.3.3 突变体tom40-1和tom40-2的T-DNA插入位点鉴定 |
| 2.3.4 AtTOM40的纯合突变导致种子败育 |
| 2.3.5 AtTOM40基因的突变影响胚胎发育 |
| 2.3.6 tom40-1/+和tom40-2/+的胚胎败育表型能被回复 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 拟南芥TOM40基因的表达模式及亚细胞定位研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料与种植 |
| 3.2.2 生物信息数据库中AtTOM40基因的表达分析 |
| 3.2.3 荧光定量PCR分析 |
| 3.2.4 AtTOM40基因启动子与GUS融合表达分析 |
| 3.2.5 原位杂交技术 |
| 3.2.6 AtTOM40基因启动子与GFP融合表达的观察 |
| 3.2.7 超薄切片制样及透射电镜观察 |
| 3.2.8 本章所用引物 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 AtTOM40基因在生物信息学数据库中的表达预测 |
| 3.3.2 AtTOM40基因在转录水平的检测结果与分析 |
| 3.3.3 AtTOM40::GUS的组织表达模式具有特异性 |
| 3.3.4 AtTOM40基因的原位杂交分析 |
| 3.3.5 AtTOM40基因编码的蛋白定位于线粒体 |
| 3.3.6 AtTOM40基因的突变影响胚胎细胞线粒体的超微结构 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 拟南芥TOM40基因的生物学功能研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料与种植 |
| 4.2.2 胚珠材料的收集和保藏 |
| 4.2.3 胚珠总RNA的提取及反转录 |
| 4.2.4 荧光定量PCR检测 |
| 4.2.5 酵母双杂交技术 |
| 4.2.6 本章所用引物 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 纯合tom40-1突变体中线粒体外膜蛋白的功能受到干扰 |
| 4.3.2 纯合tom40-1突变体胚胎的模式建成紊乱 |
| 4.3.3 AtTOM40与TOM复合体中其他亚基间的互作关系 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 总讨论 |
| 5.1 拟南芥TOM40是一个保守的线粒体外膜蛋白 |
| 5.2 拟南芥TOM40对于线粒体的生物发生至关重要 |
| 5.3 拟南芥TOM40通过维持线粒体外膜功能参与胚胎发育及形态建成 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）毛竹三螺旋家族全基因组分析及PheGT8和PheGT16的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 三螺旋转录因子研究进展 |
| 1.2.2 三螺旋基因的生物学功能 |
| 1.3 研究目的及主要研究内容 |
| 1.3.1 关键的科学问题与研究目标 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 1.4 项目来源和经费支持 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 毛竹三螺旋家族基因生物信息学分析 |
| 2.1 生物信息学分析方法 |
| 2.1.1 毛竹GT基因的鉴定方法 |
| 2.1.2 毛竹GT基因的系统发育分析方法 |
| 2.1.3 毛竹GT基因序列和结构分析方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 毛竹GT转录因子家族蛋白质分析 |
| 2.2.2 毛竹PheGT蛋白之间的系统发育分析 |
| 2.2.3 毛竹PheGT基因结构和序列分析 |
| 2.2.4 毛竹PheGT基因启动子区域分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 毛竹三螺旋家族基因表达模式分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料与处理方法 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 总RNA提取及c DNA的制备 |
| 3.1.4 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 3.1.5 转录组数据分析方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 毛竹Phe GTs的组织特异性表达分析 |
| 3.2.2 毛竹Phe GTs基因响应胁迫的表达分析 |
| 3.2.3 不同时期和组织中Phe GTs表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 毛竹Phe GT8和Phe GT16 基因的克隆及功能验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.1.3 实验载体、菌株及常用的培养基 |
| 4.1.4 实验所用引物序列 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 毛竹总RNA的提取、纯化及检测 |
| 4.2.2 反转录合成cDNA第一链 |
| 4.2.3 目的基因克隆 |
| 4.2.4 转化拟南芥 |
| 4.2.5 转基因拟南芥植株的PCR鉴定 |
| 4.2.6 T2代拟南芥植株的功能验证 |
| 4.2.7 目的基因生物信息学分析方法 |
| 4.2.8 三螺旋基因在酵母中的转录活性分析方法 |
| 4.2.9 三螺旋基因的亚细胞位置分析方法 |
| 4.2.10 不同胁迫和外源激素处理毛竹实生苗 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 毛竹总RNA提取 |
| 4.3.2 基因克隆 |
| 4.3.3 目的基因的生物信息学分析 |
| 4.3.4 转录自激活活性鉴定 |
| 4.3.5 Phe GT8和Phe GT16 蛋白亚细胞位置分析 |
| 4.3.6 组织特异性表达分析 |
| 4.3.7 干旱处理下Phe GT8和Phe GT16 基因的表达变化 |
| 4.3.8 低温处理下Phe GT8和Phe GT16 基因的表达变化 |
| 4.3.9 高盐处理下Phe GT8和Phe GT16 基因的表达变化 |
| 4.3.10 不同激素处理下Phe GT8和Phe GT16 基因的表达变化 |
| 4.3.11 基因异位表达和功能验证 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 基因结构和序列分析 |
| 4.4.2 转录活性鉴定 |
| 4.4.3 基因表达特征 |
| 4.4.4 异位表达植株验证 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（6）GbWOX9基因植物表达载体的构建及对海岛棉胚性细胞的遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 组织培养概述 |
| 1.2 WOX/WUS基因家族研究进展 |
| 1.3 研究内容及意义 |
| 第2章 海岛棉WOX9 基因的克隆及表达模式分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 GbWOX9 植物表达载体的构建及对胚性细胞的侵染 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 诱导GbWOX9 基因在转化细胞中的过量、抑制表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 正、反义GbWOX9 基因的表达模式结果分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 全文结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 研究展望及不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 RNA的提取步骤 |
| 2 胶回收步骤 |
| 3 母液的配置 |
| 4 其它培养基的配方 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）转RHA2b基因抗穗发芽小麦的创制及其抗性机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 小麦抗穗发芽转基因研究概况 |
| 2 RING finger类基因的研究概况 |
| 2.1 泛素化过程的关键酶 |
| 2.2 RING finger型蛋白的特点 |
| 2.3 RING finger型基因的研究进展 |
| 2.4 RHA2b基因的研究进展 |
| 3 小麦遗传转化研究概况 |
| 3.1 基因枪法 |
| 3.2 愈伤组织农杆菌介导法 |
| 3.3 种子萌发早期农杆菌介导法 |
| 4 小麦抗穗发芽机制研究概况 |
| 4.1 环境因素 |
| 4.2 基因型因素 |
| 5 酵母双杂交研究概况 |
| 5.1 酵母双杂交实验的一般流程 |
| 5.2 酵母双杂交系统的运用及其局限性 |
| 6 小麦基因组供体的来源及应用于基因组学研究的必要性 |
| 7 植物体细胞胚胎发生研究概况 |
| 7.1 体细胞胚发生的方式 |
| 7.2 体细胞胚胎发生研究的意义 |
| 7.3 影响小麦体细胞胚胎发生的因素 |
| 7.3.1 内部条件的影响 |
| 7.3.2 外部条件的影响 |
| 8 本研究的技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 转RsRHA2b基因小麦的创制及小麦悬浮系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 RsRHA2b基因重组表达载体的构建及转化 |
| 1.3 转基因材料的鉴定及加代 |
| 1.3.1 最佳Basta抗性筛选浓度的确定 |
| 1.3.2 转基因株系的分子鉴定 |
| 1.3.3 转基因株系的加代 |
| 1.4 转基因材料的离体萌发和整穗萌发 |
| 1.5 转基因材料的ABA敏感性检测和ABA相关基因的表达分析 |
| 1.6 数据处理 |
| 1.7 小麦“郑麦9023”悬浮细胞系的建立和植株再生 |
| 1.7.1 愈伤组织的诱导 |
| 1.7.2 胚性愈伤组织的继代培养 |
| 1.7.3 悬浮细胞系的建立 |
| 1.7.4 悬浮细胞系的各种参数测定 |
| 1.7.5 植株再生与移栽 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RsRHA2b基因克隆和分析 |
| 2.2 转基因小麦材料创制与筛选 |
| 2.3 转RsRHA2b基因小麦种子的抗穗发芽能力显着增强 |
| 2.4 转基因小麦ABA敏感性提高,促进了与ABA相关基因的表达 |
| 2.5 小麦“郑麦9023”悬浮细胞系的建立和植株再生 |
| 2.5.1 不同浓度2,4-D对“郑麦9023”小麦幼胚诱导愈伤组织的影响 |
| 2.5.2 不同浓度的2,4-D,KT的培养基对愈伤组织继代的影响 |
| 2.5.3 “郑麦9023”悬浮系的最佳pH值 |
| 2.5.4 “郑麦9023”悬浮系的继代最佳周期 |
| 2.5.5 “郑麦9023”悬浮系的建立 |
| 2.5.6 植株再生与移栽 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1 第二章补充材料 |
| 第三章 TaRHA2b互作蛋白的筛选和鉴定及编码互作蛋白基因的克隆和分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 均一化cDNA文库的构建及鉴定 |
| 1.2.1 大麦胚的总RNA的制备及纯度检测 |
| 1.2.2 1st strand及2nd Strand cDNA的合成 |
| 1.2.3 均一化处理 |
| 1.2.4 ds cDNA纯化,酶切,连接及文库的转化 |
| 1.2.5 文库的鉴定 |
| 1.3 cDNA文库质粒的提取,测序及生物信息学分析 |
| 1.4 诱饵蛋白载体的构建及自激活检测 |
| 1.4.1 小麦TaRHA2b基因的克隆 |
| 1.4.2 诱饵蛋白载体的构建 |
| 1.4.3 诱饵载体的自激活检测 |
| 1.5 互作蛋白的筛选 |
| 1.5.1 诱饵质粒和文库质粒一对一共转酵母感受态 |
| 1.5.2 酵母阳性克隆的鉴定 |
| 1.5.3 阳性质粒的测序 |
| 1.6 互作蛋白的体内鉴定 |
| 1.7 互作蛋白的体内Gst pull down验证 |
| 1.7.1 互作蛋白对应的基因及TaRHA2b基因的克隆 |
| 1.7.2 原核表达载体的构建 |
| 1.7.3 融合蛋白的诱导表达及纯化 |
| 1.7.4 GST pull down试验 |
| 1.8 编码互作蛋白基因gDNA和 cDNA扩增及生物信息学分析 |
| 1.9 编码互作蛋白基因的时空表达特异性分析 |
| 1.10 编码互作蛋白基因重组表达载体的构建及水稻的遗传转化 |
| 1.10.1 编码互作蛋白基因重组表达载体的构建 |
| 1.10.2 编码互作蛋白基因重组表达载体的水稻遗传转化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 大麦胚均一化cDNA文库的构建及鉴定 |
| 2.2 文库质粒的大规模提取、测序及生物信息学分析 |
| 2.3 RHA2b互作蛋白的筛选 |
| 2.3.1 诱饵蛋白重组载体的构建及自激活检测 |
| 2.3.2 通过诱饵蛋白载体p GBKT7-RsRHA2b筛选cDNA文库 |
| 2.3.3 阳性质粒的一对一再共转体内验证 |
| 2.3.4 阳性质粒的一对一GST-pull down体外验证 |
| 2.4 编码互作蛋白基因的克隆,表达及遗传转化 |
| 2.4.1 YTH2450 基因g DNA和 cDNA序列分析 |
| 2.4.2 YTH2450基因有很强的组织表达特异性 |
| 2.4.3 YTH2450 基因的表达对于外源ABA处理是敏感的 |
| 2.4.4 YTH2450基因转基因表达载体的构建和遗传转化 |
| 2.4.5 转YTH2450基因植株的分子鉴定 |
| 2.4.6 YTH2456 基因g DNA和 cDNA序列分析 |
| 2.4.7 YTH2456基因有很强的组织表达特异性 |
| 2.4.8 YTH2456 基因的表达对外源ABA处理是敏感的 |
| 2.4.9 转YTH2456基因表达载体的构建和遗传转化 |
| 2.4.10 YTH2476 基因g DNA和 cDNA序列分析 |
| 2.4.11 YTH2476基因有很强的组织表达特异性 |
| 2.4.12 YTH2476 基因的表达对于外源ABA处理是敏感的 |
| 2.4.13 YTH2476基因转基因表达载体的构建和遗传转化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录2 第三章补充材料 |
| 第四章 外源RsRHA2b基因对小麦灌浆期关键酶活性及编码互作蛋白基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 小麦籽粒淀粉合成关键酶活性的测定 |
| 1.3 小麦籽粒蛋白质合成关键酶活性的测定 |
| 1.4 外源RsRHA2b基因对编码互作蛋白基因表达的影响 |
| 1.5 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 外源RsRHA2b基因对灌浆期淀粉合成关键酶活性有显着的影响 |
| 2.2 成熟期外源RsRHA2b基因对蛋白质合成关键酶活性有显着的影响 |
| 2.3 外源RsRHA2b基因对编码互作蛋白基因的表达有显着的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录3 第四章补充材料 |
| 第五章 普通小麦及其供体基因组TaRHA2b基因的克隆及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 TaRHA2b基因在供体基因组上的克隆及测序分析 |
| 1.2.1 基因组供体材料的DNA的提取 |
| 1.2.2 TaRHA2b基因在三个供体基因组上的克隆及测序 |
| 1.3 不同小麦种质资源的穗发芽特性的鉴定 |
| 1.4 小麦TaRHA2b基因在不同小麦基因组上的克隆及测序分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 三个供体基因组TaRHA2b基因的序列存在一定的差异 |
| 2.2 不同品种小麦穗发芽特性存在显着性差异 |
| 2.3 不同品种小麦TaRHA2b基因的序列存在一定的差异 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 本研究的创新点及展望 |
| Abstract |
| 博士研究生在读期间发表和投稿的论文 |
（8）通过外源MYB基因的表达提高水稻的抗逆性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 植物的抗盐抗旱分子机制 |
| 1.1 盐与旱胁迫对植物生理生化性质的影响 |
| 1.2 参与植物盐与旱胁迫应答的蛋白激酶 |
| 1.3 参与植物盐与旱胁迫应答的转录因子 |
| 1.4 脱落酸信号通路同盐与旱胁迫应答 |
| 1.5 乙烯信号通路同盐与旱胁迫应答 |
| 1.6 茉莉酸信号通路同盐与旱胁迫应答 |
| 1.7 盐与旱胁迫应答中的渗透保护 |
| 1.8 盐与旱胁迫应答中的氧化胁迫保护 |
| 1.9 盐与旱胁迫应答中的其他保护机制 |
| 2 MYB转录因子参与植物非生物胁迫应答 |
| 3 MYB基因在植物基因工程上的应用 |
| 3.1 AmRosea1对金鱼草花色的调控 |
| 3.2 AmRosea1的异位表达 |
| 4 RNAseq测序技术及其应用 |
| 5 胚乳发育研究概况 |
| 5.1 水稻胚乳发育研究概况 |
| 5.2 拟南芥胚乳发育研究概况 |
| 6 胚胎周围区域（ESR）研究概况 |
| 6.1 玉米ESR研究概况 |
| 6.2 拟南芥ESR研究概况 |
| 6.3 ESR和胚胎空洞 |
| 6.4 ESR总结 |
| 7 植物程序化细胞死亡（PCD） |
| 7.1 谷粒胚乳发育的PCD过程 |
| 7.2 谷粒胚乳PCD受激素调节 |
| 7.3 ZOU基因对拟南芥胚乳PCD的调控 |
| 8 本课题研究意义 |
| 第二部分 实验论文 |
| 第一章 通过外源MYB基因的表达提高水稻的抗逆性 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 pCAMBIA1300-35S::AmRosea1载体的构建 |
| 3.2 获得转基因水稻植株 |
| 3.3 35S::AmRosea1转基因水稻的PCR鉴定 |
| 3.4 转基因水稻的半定量分析 |
| 3.5 筛选纯合转基因株系 |
| 3.6 转基因水稻的表型观察 |
| 3.7 转基因水稻类黄酮及花青素含量测定 |
| 3.8 转基因水稻的抗盐抗旱性分析 |
| 3.9 转录组数据结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第二章 水稻中胚乳凋亡控制因子ZOU的克隆和功能分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 进化分析 |
| 2.2 实时荧光定量PCR检测OsZOU基因的表达模式 |
| 2.3 基因克隆 |
| 2.4 拟南芥互补 |
| 2.5 甲苯胺蓝染色 |
| 2.6 种子透明 |
| 2.7 水稻转化 |
| 2.8 PCR鉴定转基因株系 |
| 2.9 GUS染色 |
| 2.10 实时荧光定量PCR检测转基因株系中OsZOU-1 的表达水平 |
| 2.11 石蜡切片 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 水稻中ZOU同源基因进化分析 |
| 3.2 实时荧光定量PCR检测水稻中ZOU同源基因的表达模式 |
| 3.3 水稻OsZOU-1 基因互补拟南芥zou-4 突变体种子表型 |
| 3.4 GUS染色检测水稻种子发育过程中OsZOU-1 的表达模式 |
| 3.5 OsZOU-1 过表水稻植株的表型及基因表达分析 |
| 3.6 OsZOU-1 沉默株系的表型及基因表达分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献（References） |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表文章 |
| 致谢 |
（9）白菜花粉发育和授粉受精相关基因的表达分析与功能验证（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 目录 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述：十字花科植物花粉发育与授粉受精研究进展 |
| 1.1 花粉壁发育 |
| 1.1.1 花粉壁发育模式 |
| 1.1.1.1 成熟花粉壁的结构 |
| 1.1.1.2 花粉壁发育过程 |
| 1.1.1.3 花粉发育不同阶段的细胞壁结构 |
| 1.1.2 脂类代谢与花粉外壁形成 |
| 1.1.2.1 孢粉素合成与脂肪酸代谢密切相关 |
| 1.1.2.2 孢粉素运输 |
| 1.1.3 多糖代谢与花粉壁形成 |
| 1.1.3.1 果胶代谢与花粉壁形成 |
| 1.1.3.2 纤维素代谢与花粉壁形成 |
| 1.1.3.3 胼胝质代谢与花粉壁形成 |
| 1.1.4 花粉壁发育相关的其它基因与蛋白质 |
| 1.1.5 花粉壁发育的转录调控 |
| 1.2 授粉受精 |
| 1.2.1 花粉与柱头的互作 |
| 1.2.1.1 花粉黏附 |
| 1.2.1.2 花粉水合 |
| 1.2.1.3 花粉萌发 |
| 1.2.2 花粉管生长 |
| 1.2.2.1 花粉管生长 |
| 1.2.2.2 花粉管的引导 |
| 1.2.2.3 花粉管进入胚珠 |
| 1.2.4 配子融合 |
| 1.2.4.1 精细胞在胚囊中的传送 |
| 1.2.4.2 配子识别 |
| 1.2.4.3 配子融合的方式 |
| 1.3 果胶代谢 |
| 1.3.1 果胶代谢相关酶类 |
| 1.3.2 果胶酸裂解酶 |
| 1.3.2.1 微生物中的果胶酸裂解酶 |
| 1.3.2.2 植物中的类果胶酸裂解酶基因 |
| 1.3.2.3 类果胶酸裂解酶与果实软化 |
| 1.3.2.4 类果胶酸裂解酶与植物生殖发育 |
| 2 白菜授粉受精过程的细胞学观察 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 授粉实验 |
| 2.1.3 通过SEM观察花粉在柱头上的萌发 |
| 2.1.4 通过光学显微观察花粉萌发和花粉管生长 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 白菜花粉萌发的SEM鉴定 |
| 2.2.2 白菜花粉管生长时间的苯胺蓝染色鉴定 |
| 2.2.3 用于授粉实验的雌蕊长度的测定 |
| 2.3 讨论 |
| 3 白菜授粉受精相关基因的ATH1芯片分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 基因芯片分析 |
| 3.1.2.1 ATH1芯片杂交 |
| 3.1.2.2 数据处理 |
| 3.1.2.3 差异基因分类 |
| 3.1.3 RT-PCR和qRT-PCR验证 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 白菜授粉受精前后转录组差异的基因芯片分析 |
| 3.2.2 白菜授粉受精前后转录组差异基因的qRT-PCR验证 |
| 3.2.3 白菜授粉受精前后转录组差异基因的功能分类 |
| 3.2.4 授粉受精与花粉发育相关基因的比较 |
| 3.2.5 持续表达基因的时空表达模式分析 |
| 3.2.6 白菜授粉受精特异表达基因在雌蕊部位的表达模式分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 持续表达基因可能同时参与花粉发育和授粉受精过程 |
| 3.3.2 持续表达基因主要与细胞壁发育相关 |
| 3.3.3 ATH1芯片筛选白菜差异表达基因的可行性和局限性 |
| 4 白菜花粉发育和授粉受精表达的microRNA分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 总RNA提取与小RNA富集 |
| 4.1.3 植物microRNA μParaflo~(TM)微流体芯片杂交与数据处理 |
| 4.1.3.1 microRNA芯片杂交 |
| 4.1.3.2 数据处理 |
| 4.1.3.3 差异microRNA分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 三种不同雄性不育遗传模式的不育系花序差异表达的microRNA比较 |
| 4.2.2 ‘Bcajh97-01A’授粉前后雌蕊差异表达的microRNA比较 |
| 4.2.3 microRNA靶基因预测及差异表达microRNA的分类 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 白菜不同雄性不育遗传模式的花序microRNA表达不尽相同 |
| 4.3.2 差异表达的microRNA可能参与小孢子的发育过程 |
| 4.3.3 花粉发育与授粉受精均表达的microRNA |
| 5 花粉发育和授粉受精持续表达基因的功能分析：类果胶酸裂解酶基因BcPLL9 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料与主要试剂 |
| 5.1.2 DNA、RNA的提取与cDNA的合成 |
| 5.1.2.1 基因组DNA的提取 |
| 5.1.2.2 总RNA的提取 |
| 5.1.2.3 cDNA的合成 |
| 5.1.3 cDNA、DNA全长的克隆 |
| 5.1.4 核酸序列分析 |
| 5.1.5 基因时空表达模式分析 |
| 5.1.5.1 qRT-PCR分析 |
| 5.1.5.2 原位杂交分析 |
| 5.1.6 反义表达载体的构建 |
| 5.1.6.1 反义基因片段的分离 |
| 5.1.6.2 反义表达载体的构建 |
| 5.1.6.3 反义表达载体转化农杆菌 |
| 5.1.7 反义表达载体对菜心的遗传转化 |
| 5.1.7.1 实验材料及菌株 |
| 5.1.7.2 遗传转化 |
| 5.1.8 转基因植株的分子检测 |
| 5.1.8.1 转基因植株基因组DNA和总RNA的提取 |
| 5.1.8.2 转基因植株的PCR检测 |
| 5.1.8.3 转基因植株的Southern印迹杂交和qRT-PCR检测 |
| 5.1.9 转基因植株的形态与细胞学观察 |
| 5.1.9.1 转基因植株的形态观察 |
| 5.1.9.2 转基因植株花粉生活力观察 |
| 5.1.9.3 花粉形态扫描电镜和花粉发育透射电镜观察 |
| 5.1.9.4 花粉萌发试验 |
| 5.1.9.5 花粉在雌蕊中的生长实验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 BcPLL9具有果胶酸裂解酶基因的特征 |
| 5.2.2 BcPLL9在花粉发育和授粉受精过程均表达 |
| 5.2.3 构建获得反义BcPLL9表达载体并导入农杆菌 |
| 5.2.4 获得BcPLL9反义表达载体转化菜心植株 |
| 5.2.5 转反义基因植株bcpll9的分子检测 |
| 5.2.5.1 PCR检测初步证明反义表达载体导入菜心植株 |
| 5.2.5.2 Southern印迹杂交进一步证明反义表达载体整合进入受体细胞 |
| 5.2.5.3 qRT-PCR检测证明转基因植株中BcPLL9基因表达下调 |
| 5.2.6 转反义基因植株bcpll9的形态学和细胞学观察 |
| 5.2.6.1 bcpll9的花粉形态异常 |
| 5.2.6.2 bcpll9的花粉内壁发育异常 |
| 5.2.6.3 bcpll9的花粉管生长异常 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 BcPLL9是花粉发育和授粉受精过程均表达的基因 |
| 5.3.2 BcPLL9表达受抑制导致花粉管生长异常但不影响花粉萌发 |
| 5.3.3 BcPLL9可能通过调控果胶代谢而发挥作用 |
| 6 花粉发育和授粉受精过程持续表达基因的功能分析：类果胶酸裂解酶基因BcPLL10 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 植物材料与主要试剂 |
| 6.1.2 DNA、RNA的提取与cDNA的合成 |
| 6.1.3 cDNA和DNA全长的克隆 |
| 6.1.4 核酸序列分析 |
| 6.1.5 基因时空表达模式分析 |
| 6.1.6 反义表达载体的构建 |
| 6.1.7 反义表达载体对菜心的遗传转化 |
| 6.1.8 转基因植株的分子检测 |
| 6.1.9 转基因植株的形态与细胞学观察 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 BcPLL10具有果胶酸裂解酶基因的特征 |
| 6.2.2 BcPLL10在花粉和雌蕊中表达 |
| 6.2.3 构建获得反义表达载体并导入农杆菌 |
| 6.2.4 获得BcPLL10反义表达载体转化菜心植株 |
| 6.2.5 转反义基因植株bcpll10的分子检测 |
| 6.2.6 转反义基因植株bcpll10的形态学和细胞学观察 |
| 6.2.6.1 bcpll10的花粉形态异常 |
| 6.2.6.2 bcpll10花粉壁发育异常 |
| 6.2.6.3 bcpll10的花粉萌发异常 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 BcPLL9是花粉发育和授粉受精持续表达基因 |
| 6.3.2 BcPLL10表达受抑制影响花粉萌发 |
| 6.3.3 BcPLLlO与花粉壁的发育相关 |
| 7 植物PLL基因家族的结构、进化与表达分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 基因序列的获得 |
| 7.1.2 染色体定位 |
| 7.1.3 表达分析 |
| 7.1.4 基因结构分析 |
| 7.1.6 进化树分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 白菜和拟南芥中PLL基因的命名、结构和分布 |
| 7.2.1.1 白菜中PLL基因的分布与命名 |
| 7.2.1.2 白菜和拟南芥中PLL基因的结构分析 |
| 7.2.1.3 白菜和拟南芥中PLL基因的染色体定位 |
| 7.2.2 白菜中PLL基因的表达分析 |
| 7.2.2.1 白菜PLL基因在不同组织部位的表达模式 |
| 7.2.2.2 白菜PLL基因在花器官中的表达模式 |
| 7.2.2.3 白菜PLL基因在花粉发育过程中的表达模式 |
| 7.2.2.4 白菜PLL基因在授粉受精过程中的表达模式 |
| 7.2.3 植物PLL基因的演化关系分析 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 白菜PLL基因在3个亚基因组上有不同的分布密度 |
| 7.3.2 白菜PLL基因的亚家族成员间表达模式趋向保守 |
| 7.3.3 BcPLL8～BcPLL11可能来自基因的新功能或亚功能化 |
| 8 白菜花粉发育相关的新基因BcMF21的功能分析 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 植物材料与主要试剂 |
| 8.1.2 cDNA、DNA全长及启动子片段的分离 |
| 8.1.3 核酸序列分析 |
| 8.1.4 基因时空表达模式分析 |
| 8.1.5 反义RNA植物表达载体的构建 |
| 8.1.5.1 反义基因片段的分离 |
| 8.1.5.2 反义表达载体的构建 |
| 8.1.6 反义表达载体对菜心的遗传转化 |
| 8.1.7 转基因植株的分子检测 |
| 8.1.8 转基因植株的形态与细胞学观察 |
| 8.1.9 进化分析 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 分离获得该基因的cDNA和DNA全长及启动子片段 |
| 8.2.2 BcMF21为一个无内含子的功能未知新基因 |
| 8.2.3 BcMF21是一个花粉和绒毡层特异表达的花粉早期基因 |
| 8.2.3.1 BcMF21在花粉发育早期表达 |
| 8.2.3.2 BcMF21在小孢子和绒毡层中表达 |
| 8.2.3.3 BcMF21启动子能够驱动GUS基因表达 |
| 8.2.4 构建获得BcMF21反义表达载体并导入农杆菌 |
| 8.2.5 获得BcMF21反义RNA表达载体转化菜心植株 |
| 8.2.6 转反义基因植株bcmf21的分子检测 |
| 8.2.7 转反义基因植株bcmf21的形态与细胞学观察 |
| 8.2.7.1 bcmf21的花粉部分畸形 |
| 8.2.7.2 bcmf21的花粉萌发率低 |
| 8.2.8 BcMF21是一个进化保守的基因 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 BcMF21是花粉发育早期特异表达基因 |
| 8.3.2 BcMF21与花粉发育和萌发有关 |
| 8.3.3 BcMF21可能通过参与信号转导途径而发挥作用 |
| 8.3.4 BcMF21在芸蔓属中的同源基因的进化与其物种分化一致 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
（10）磷匮乏影响玉米根系发育机制的研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 植物响应磷胁迫机制的研究 |
| 1.1.1 土壤磷资源状况 |
| 1.1.2 磷素在植物生长发育中的作用 |
| 1.1.3 植物对低磷胁迫的响应 |
| 1.1.4 植物对低磷胁迫反应的分子机制 |
| 1.2 植物根系发育的调控 |
| 1.2.1 根系的主要类型与结构 |
| 1.2.2 植物根系的发育调控 |
| 1.3 生长素在植物生长发育中的作用 |
| 1.3.1 生长素极性运输在维管组织分化中的作用 |
| 1.3.2 生长素在植物根系生长发育中的作用 |
| 1.3.3 生长素在植株生长和向性中的作用 |
| 1.3.4 生长素合成及代谢机制的研究 |
| 1.3.5 生长素极性分布的调节 |
| 1.3.6 生长素的作用机制研究 |
| 1.3.7 生长素信号与细胞分裂素信号的相互作用 |
| 1.4 玉米磷高效育种的意义和根系作物根系改良育种的可行性 |
| 1.4.1 磷高效转基因育种的研究现状 |
| 1.4.2 作物根系改良育种的可行性 |
| 1.4.3 本工作的目的及意义 |
| 第二章 玉米自交系Q319和99038的根转录组比较分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 药品及试剂 |
| 2.1.3 玉米溶液培养方法 |
| 2.1.4 根系形态参数的测定 |
| 2.1.5 玉米植株生物量的测定 |
| 2.1.6 Real-time RT-PCR分析 |
| 2.1.7 基因芯片实验方法 |
| 2.1.8 玉米根段RNA的抽提与纯化 |
| 2.1.9 RNA体外扩增 |
| 2.1.10 荧光标记的aRNA的合成与回收 |
| 2.1.11 芯片杂交 |
| 2.1.12 芯片洗涤 |
| 2.1.13 芯片的扫描 |
| 2.1.14 芯片原始数据的获取和处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同供磷水平下99038与Q319的生物量和根系形态的差异 |
| 2.2.2 DNA芯片杂交结果的可靠性分析 |
| 2.2.3 差异基因的数目及功能分类 |
| 2.2.4 足磷条件下99038与Q319差异表达基因 |
| 2.2.5 低磷处理2d时99038和Q319之间的差异表达基因 |
| 2.2.6 低磷处理8d时99038与Q319的差异表达基因 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 玉米磷吸收和利用效率的差别取决于多个基因的差异表达 |
| 2.3.2 多种激素信号参与了玉米根系构型和生长速率的调节 |
| 2.3.3 低磷胁迫对玉米根系性状的影响涉及多个重要基因的表达改变 |
| 第三章 转ZmPTF1促进玉米根系发育提高了玉米耐低磷特性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料和质粒、菌株 |
| 3.1.2 药品、试剂和培养基(液) |
| 3.1.3 ZmPTF1植物表达载体的鉴定及农杆菌转化 |
| 3.1.4 农杆菌介导的玉米芽尖遗传转化和转基因植株检测 |
| 3.1.5 ZmPTF1及下游基因的表达分析 |
| 3.1.6 ZmPTF1启动子元件分析 |
| 3.1.7 植株生长发育过程中形态学观察分析方法 |
| 3.1.8 生物量、可溶性糖和植株磷含量测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 内源ZmPTF1拷贝数和表达模式分析 |
| 3.2.2 玉米遗传转化和转基因植株的检测 |
| 3.2.3 不同磷供给水平下植株形态生物量分析 |
| 3.2.4 不同磷供给水平下V5期植株磷含量测定 |
| 3.2.5 转基因植株可溶性糖含量变化 |
| 3.2.6 ZmPTF1下游基因的表达分析 |
| 3.2.7 与糖代谢相关基因的表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 生长素极性运输相关基因在玉米根系发育中的表达变化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料、菌株及质粒载体 |
| 4.1.2 试剂盒及试剂 |
| 4.1.3 数据库及软件 |
| 4.1.4 玉米生长素极性运输相关基因的生物信息学资料的利用 |
| 4.1.5 用于基因克隆的cDNA制备和基因克隆 |
| 4.1.6 玉米生长素极性运输相关基因的克隆 |
| 4.1.7 各基因启动子序列的电子克隆及分析 |
| 4.1.8 玉米生长素极性运输相关基因的表达模式分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 生长素极性运输相关基因的克隆和生物信息学分析 |
| 4.2.2 生长素极性运输相关基因启动子元件分析 |
| 4.2.3 不同器官和不同供磷水平下生长素极性运输相关基因表达模式分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 转ZmPIN1a/1b基因对玉米生长发育和磷胁迫抗性的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 玉米芽尖遗传转化和转基因植株的分子检测 |
| 5.1.4 植株形态学分析方法 |
| 5.1.5 转基因植株数字基因表达谱分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 植物表达载体pCAMBIA-Prsp::ZmPIN1a/1b-Tnos-P35S::EPSP的构建 |
| 5.2.2 玉米遗传转化植株的选择和分子鉴定 |
| 5.2.3 转ZmPIN1a/1b基因植株的表型分析 |
| 5.2.4 ZmPIN1a过表达对玉米产量性状和抗逆性的影响 |
| 5.2.5 不同供磷水平下添加生长调节物质对转ZmPIN1a植株和对照植株的影响 |
| 5.2.6 生长素极性运输相关基因在转ZmPIN1a基因株系中的表达分析 |
| 5.2.7 转ZmPIN1a基因植株数字表达谱分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 转ZmAUX1基因对玉米根系生长和低磷胁迫的反应 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 植物表达载体pCAMBIA1300-Pubi::ZmAUX1-Tnos-P35S::EPSP构建 |
| 6.2.2 转基因植株的获得 |
| 6.2.3 转基因后代的分子鉴定 |
| 6.2.4 转ZmAUX1正、反义基因植株的表型分析 |
| 6.2.5 ZmAUX1表达水平对生长素极性运输相关基因表达的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 结语 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 材料与方法 |
| 附录Ⅱ 第二章中部分实验结果 |
| 附录Ⅲ 第三章中部分实验结果 |
| 附录Ⅳ 第四章中部分实验结果 |
| 附录Ⅴ 第五章中部分实验结果 |
| 博士学习期间发表的文章及申请的专利 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、水稻bicoid反义基因转基因植株胚胎发育的形态变化（论文参考文献）
- [1]利用TaLEC基因建立小麦再生体系和创制小麦大粒新种质[D]. 宋语宁. 山东农业大学, 2020
- [2]草地早熟禾矮化突变体的遗传差异分析及DXS1基因功能研究[D]. 甘露. 北京林业大学, 2019(04)
- [3]小麦小分子RNA TaMIR1119/5086和转录因子基因TaNF-YB6;1分子特征和耐逆功能[D]. 史桂清. 河北农业大学, 2019(03)
- [4]拟南芥胚胎发育中TOM40基因的生物学功能研究[D]. 胡颖. 武汉大学, 2019(06)
- [5]毛竹三螺旋家族全基因组分析及PheGT8和PheGT16的功能研究[D]. 高红艳. 中国林业科学研究院, 2019
- [6]GbWOX9基因植物表达载体的构建及对海岛棉胚性细胞的遗传转化[D]. 李娟. 新疆农业大学, 2017(02)
- [7]转RHA2b基因抗穗发芽小麦的创制及其抗性机制[D]. 李冬兵. 河南农业大学, 2019(06)
- [8]通过外源MYB基因的表达提高水稻的抗逆性[D]. 豆明珠. 山东师范大学, 2017(10)
- [9]白菜花粉发育和授粉受精相关基因的表达分析与功能验证[D]. 蒋晶晶. 浙江大学, 2012(08)
- [10]磷匮乏影响玉米根系发育机制的研究[D]. 李朝霞. 山东大学, 2011(12)