一、同种异体骨髓间充质干细胞在大鼠心脏的迁移及分化（论文文献综述）
毛鑫[1]（2021）在《人羊膜间充质干细胞抑制同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用microRNA表达初步探究》文中提出目的:本研究旨在探讨人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）有减轻小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用的基础上,采用RNA-seq技术对其进行micro RNA转录组研究。初步挖掘hAMSCs在减轻排斥损伤方面的潜在机制。为hAMSCs的应用提供理论基础,也为其在减轻心脏移植免疫损伤方面的应用提供新的认识。方法:1.运用显微外科技术进行模型构建。分为同系移植组（A组）,异系移植组（B组）,异系移植干细胞干预组（C组）,干细胞（2.5×105个细胞/次/0.4毫升）于术后第1天、第4天经尾静脉注入。2.观察小鼠存活时间及状态,通过取B、C组供体心脏做HE染色观察心肌病理改变。3.评估模型成功后,于术后第7天取小鼠供心组织,收集RNA样本测序。通过RNA-seq、生物信息技术分析得到差异表达显着的micro RNA。4.应用mi Randa行靶基因预测后,用R的cluster Profiler进行富集分析。5.通过阅读相关文献,测序数据富集结果分析以及在GEO数据库相关测序分析结果中通过韦恩（venn）取得交集的方式,筛选出差异显着的micro RNA进行q RT-PCR验证。结果:1.造模及干预后观察小鼠状态良好,干细胞干预组小鼠存活时间较单纯异系移植组延长（P<0.05）;2.通过HE染色发现单纯异系移植组心肌组织中单核细胞、中性粒细胞侵入肌细胞的周界,肌细胞被浸润细胞包围。心肌纤维扭曲断裂。心肌纤维形态不规则,肌纤维水肿,且连续性消失。干细胞干预组心肌间单核细胞、中性粒细胞浸润明显减少,亦可见心肌纤维损伤断裂和结构变形,但程度较轻。3.通过测序分析得出AB组间、AC组间、BC组间差异性表达micro RNA分别为:1324、1323和1340个,其中显着差异的分别有:213、211、82个。4.通过靶基因预测发现的重要micro RNA包括:mi R-1247-5P、mi R-106b-3p、mi R-127-5p。GO富集分析结果显示,靶基因主要富集包括:蛋白结合、激酶活性、转录调控、磷酸化等方面。KEGG通路富集在多个通路中,主要涉及:Rap1信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、c AMP信号通路等。5.筛选出差异表达显着的micro RNA为:（1）.同、异系移植组间（AB组间）差异表达micro RNA:mi R-199a-3p;mi R-34b-3p;mi R-434-3p;（2）.三组间差异表达micro RNA:mi R-451a;mi R-494-3p;mi R-136-3p。通过q RT-PCR验证发现这些micro RNA与转录组测序得到的结果趋势基本相同。结论:1.初步表明了hAMSCs具有减轻同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用。2.通过RNA-seq、生物信息技术分析及q RT-PCR验证,初步确认mi R-451a、mi R-494-3p、mi R-136-3p的表达可能与hAMSCs减轻同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤的作用存在密切关系。
毛鑫,余丽梅,王峰[2]（2021）在《间充质干细胞在心脏移植免疫耐受诱导中的重要作用》文中研究说明背景:心脏移植是终末期心脏疾病的重要治疗方式,移植后的维持离不开免疫抑制药物的使用。鉴于免疫抑制药物的不良反应较大,甚至可能对宿主生活质量产生巨大影响,人们开始探寻新的诱导移植耐受的方法,来尽量规避免疫抑制药物的使用。间充质干细胞的免疫调节特性受到了研究人员的关注,并开展了大量的相关研究。目的:总结并探讨间充质干细胞的免疫调节特点和心脏移植免疫耐受诱导方面的问题,以及它们之间的关系。方法:检索PubMed数据库中相关文献,时间不限。检索词包括"stem cell; mesenchymal stem cells;MSC;MSCs;heart transplantation;cardiac allograft;heart allograft;immune tolerance;tolerance;immunological rejection"。筛选排除重复研究,对相关研究文献进行整理总结并综述。结果与结论:一方面,间充质干细胞对免疫系统各细胞有着不同的作用;另一方面,间充质干细胞调控或直接产生的众多生物活性因子构成了复杂的网络,创造了一个利于免疫调节的微环境。间充质干细胞在心脏移植中的应用多局限在动物实验,且结果都相对乐观。研究人员对心脏移植免疫耐受诱导的探究,有助于人们对该领域的进一步了解,并给相关临床工作更多的启示。
王弘德[3]（2020）在《使用杂交移植物重建前交叉韧带的临床与基础研究》文中认为前交叉韧带损伤是常见的膝关节韧带损伤之一。由于前交叉韧带周围滑膜的存在,损伤后的前交叉韧带断端无法形成血痂为前交叉韧带愈合提供稳定的支架,导致前交叉韧带损伤后无法自愈,常导致半月板损伤及骨关节炎的发生。前交叉韧带重建手术旨在恢复膝关节的稳定性,使患者重返伤前运动状态。目前最常用的前交叉韧带重建的移植物为自体腘绳肌腱,相比于自体骨-腱-骨移植物,腘绳肌腱的使用大大降低了供区并发症的发生率。然而,在临床工作中发现,有部分患者腘绳肌腱细小,无法满足前交叉韧带重建所需的力学强度。另一种常用的移植物是同种异体移植物,其主要优势在于,无供区并发症,并可按照需要自行增减移植物数量。正因如此,许多学者指出,使用同种异体移植物作与自体腘绳肌腱混编成杂交移植物,可以解决患者腘绳肌腱细小的问题进行前交叉韧带重建。目前,关于杂交移植物的研究仅限于部分临床疗效的评价,且研究结果并不明确,缺乏对杂交移植物更全面的基础研究、临床研究与循证医学研究。同时,肌腱干细胞在肌腱、韧带愈合过程中的作用逐渐被揭示,为促进前交叉韧带重建术后杂交移植物愈合提供了新的思路。因此,本研究将从基础研究、临床研究与循证医学研究角度分析使用杂交移植物重建前交叉韧带的实际效果及应用前景,并尝试用肌腱干细胞条件培养基促进前交叉韧带移植物愈合,探讨提高杂交移植物愈合能力的新策略。第一部分:杂交移植物与自体移植物用于前交叉韧带重建在患者主观评价、膝关节稳定性与失败率方面的临床研究目的:对比使用杂交移植物与自体移植物重建前交叉韧带患者术后临床疗效。方法:回顾分析我院2013年7月至2014年7月间接受杂交移植物与自体腘绳肌腱前交叉韧带重建患者在主观评价、膝关节稳定性与失败率方面的资料。本研究共纳入57例患者,其中,28例患者接受了杂交移植物重建,29例患者接受自体移植物重建。患者主观评价内容包括主观Tegner评分、Lysholm评分和主观IKDC评分;膝关节稳定性评价包括overall IKDC评分、轴移试验、Lachman试验和KT-1000测量;失败率评价主要通过患者主观评级、体格检查、MRI评价以及术后关节镜下二次探查证实。结果:术后3年发现,两组患者在轴移试验（P=0.013）和Lachman试验（P=0.027）方面具有统计学差异。杂交移植物组失败率为14.3%,自体移植物组失败率为3.4%,但两组间失败率差异不具有统计学意义（P=0.328）。在KT-1000测量方面,自体移植物组为2.5±1.0 cm,杂交移植物组为3.5±2.0 cm,两组之间差异具有统计学意义（P=0.024）。杂交移植物组在Lysholm评分（P=0.00）和主观IKDC评分（P=0.006）方面显着低于自体移植物组。结论:接受自体移植物重建的患者在主观评价和膝关节稳定性方面优于接受杂交移植物重建的患者。两种移植物的使用在术后失败率方面虽无统计学差异,但是,使用杂交移植物的患者术后仍有较高的失败风险,其主要原因可能与杂交移植物韧带化和腱骨愈合能力较差有关。第二部分:杂交移植物与自体移植物在大鼠前交叉韧带损伤模型中的实验研究目的:在大鼠前交叉韧带损伤模型中,对比杂交移植物与自体移植物用于前交叉韧带重建术后在生物力学、影像学与组织学方面的差异。方法:将66只成年雄性SD大鼠随机分为两组,自体移植物（AT）组中的33只大鼠接受单侧自体移植物重建,杂交移植物（HB）组中的33只大鼠接受单侧杂交移植物重建。分别于术后第4周、第8周和第12周取材进行生物力学测试、显微CT定量与组织学评价。在显微CT定量评价中,股骨与胫骨侧骨隧道分为三部分,即隧道内口部分（IA）、隧道中部分（MT）和隧道外口部分（EA）。选择直径为1.4mm,高度为50层（股骨侧）或100层（胫骨侧）的圆柱体区域作为感兴趣区域用来研究隧道内新骨形成;选择内径为1.4mm,外径为2.0mm,高度为50层（股骨侧）或100层（胫骨侧）的管状区域作为感兴趣区域用来研究隧道外骨变化。分别对同一区域的两个感兴趣区的骨体积比（BV/TV）参数进行评价。结果:术后第8周和第12周,AT组具有较高的失败负荷（第8周P=0.006,第12周P=0.008）与刚度（第8周P<0.001,第12周P=0.008）,两组间差异具有统计学意义。在骨隧道内的新骨形成方面,术后第8周（IA P<0.001,EA P=0.030）和第12周（IA P=0.010,MT P=0.041,EA P=0.003）,AT组在胫骨侧骨隧道具有更高的BV/TV,两组间差异具有统计学意义。在骨隧道周围骨重塑方面,术后第8周（MT P=0.007,EA P=0.030）和第12周（IA P<0.001,MT P<0.001）,AT组在胫骨侧骨隧道具有更高的BV/TV,两组间差异具有统计学意义。术后第8周,自体移植物组可见夏贝氏纤维形成,成纤维细胞大量减少于术后第12周。AT组在术后第4周（P<0.001）、第8周（P=0.002）与第12周（P=0.001）腱骨结合界面宽度较HB组狭窄,两组间腱骨结合宽度差异具有统计学意义。结论:使用自体移植物进行前交叉韧带重建相比使用杂交移植物,术后移植物生物力学表现更佳,并能促进骨隧道内新骨形成,促进隧道周围骨重塑,促进腱骨界面愈合。第三部分:杂交移植物与自体移植物用于前交叉韧带重建在患者主观评价、膝关节稳定性与失败率方面的meta-分析研究目的:回顾当前已发表的文献,对比接受杂交移植物与自体移植物重建前交叉韧带患者术后在患者主观评价、膝关节稳定性与失败率方面的临床疗效。方法:通过对Pubmed、Embase和Cochrane Library数据库检索进行检索,纳入主题为自体移植物与杂交移植物进行前交叉韧带重建术后疗效对比的相关前瞻性或回顾性研究,对纳入的文献中关于患者主观评价、膝关节稳定性与失败率方面的数据进行meta分析评价。结果:共纳入10篇文献,其中二级证据等级文献1篇,三级证据等级文献9篇。自体移植物组398例,杂交移植物组341例,平均随访时间范围分别为24.0-69.6月与24.0-70.8月。患者主观评价包括Lysholm评分、Tegner评分与主观IKDC评分,共8篇文献进行了报道;膝关节稳定性评价包括KT-1000测量、轴移试验、Lachman试验及overall IKDC评分,共4篇文献进行了报道;纳入的10篇文献均报道了术后失败率。在患者主观评价、失败率与KT-1000测量方面,杂交移植物组与自体移植物组差异不具有统计学意义。结论:基于当前证据,使用自体移植物与杂交移植物重建前交叉韧带术后在患者主观评价与失败率方面并不统计学差异。在膝关节稳定性方面是否存在差异由于缺乏有关膝关节稳定性的证据支持,目前仍是未知的。第四部分:肌腱干细胞条件培养基对小鼠成纤维细胞的影响目的:围绕肌腱干细胞条件培养基对成纤维细胞作用进行研究,模拟肌腱干细胞条件培养基对关节内移植物韧带化的早期影响,探讨肌腱干细胞促进前交叉韧带移植物愈合的新策略。方法:采用I型胶原酶消化法分离大鼠肌腱干细胞,并对所分离的细胞进行表面标记物鉴定及多项分化潜能鉴定。使用传代纯化后第三代细胞与无双抗、血清的DMEM培养基制成肌腱干细胞条件培养基。通过对比NIH/3T3细胞在加入DMEM培养基（对照组）与加入肌腱干细胞条件培养基（肌腱干细胞条件培养基组）条件下生长情况,检测肌腱干细胞条件培养基对小鼠成纤维细胞的增殖和分化方面相关m RNA的表达。结果:肌腱干细胞均一表达CD44和CD90,阳性率分别为80.02%和99.92%。造血来源干细胞标记物（CD34和CD45）与内皮细胞标记物（CD31）表达均低于1%。经成脂诱导液诱导后,细胞脂质积累,脂滴变大合并后呈串珠状,油红O染色呈现鲜红色;经成软骨细胞诱导液诱导后,形成质地较硬的软骨样组织,软骨组织中的酸性粘多糖被阿利辛蓝染液染成蓝色;经成骨诱导液诱导后细胞内有钙化沉积,茜素红染色后钙化结节呈现红色。Mki67 m RNA在TDSCs-CM组成纤维细胞中相对于对照组的表达量为2.27±0.39,明显高于对照组的表达量（P=0.010）);Col1a1m RNA在TDSCs-CM组成纤维细胞中相对于对照组的表达量为1.09±0.21,明显高于对照组的表达量（P=0.012）;Acta2 m RNA在TDSCs-CM组成纤维细胞中相对于对照组的表达量为1.41±0.25,明显高于对照组的表达量（P=0.011）。结论:通过消化法可以获高纯度的具有自我更新和多项分化的潜能的大鼠肌腱干细胞。肌腱干细胞条件培养基具有促进成纤维细胞增殖、分化及胶原合成的潜能,为前交叉韧带重建后促进移植物韧带化提供了新的策略。
李广杰[4]（2020）在《microRNA-149/SDF-1轴刺激骨髓间充质干细胞成骨分化的研究》文中研究说明背景:骨缺损主要是骨骼受到严重撞击、创伤、肿瘤切除、骨关节炎等后遗症引起的骨损伤,是临床常见的骨科病变。骨缺损的修复主要通过骨移植方式的进行治疗。骨髓间充质干细胞BMMSCs自发现后,因其具有成骨分化的功能,由于BMMSCs取材比较简单,容易培养、无免疫排斥反应,近年已被广泛用于骨缺损临床治疗和试验研究。由于BMMSCs定向分化成骨的几率受到很多因素的影响,因此研究如何刺激BMMSCs向成骨转化的机制,具有重要的临床意义。目的:本研究通过microRNA-149甲基化及lncRNA-H19与microRNA-149的相互作用下调microRNA-149的表达,从而上调基质细胞衍生因子-1（SDF-1）的表达,观察BMMSCs的成骨分化的效果,探讨如何下调microRNA-149的表达,上调SDF-1并刺激BMMSCs向成骨细胞转化的分子机制。方法:利用TargetScan和StarBase发现SDF-1是miR-149下游的靶基因,而H19是miR-149上游调控的lncRNA,并通过双荧光素酶报告基因分析技术验证miR-149与SDF-1及lncRNA的相互关系。膜诱导技术建立大鼠成骨分化模型,免疫组化检测骨膜H19、miR-149和SDF-1的表达;Von Kossa染色观察骨膜的钙沉积,PNP比色法检测大鼠骨膜ALP活性,ELISA检测OCN含量。分离大鼠BMMSCs进行成骨分化诱导,分别用甲基转移酶抑制剂Aza-CdR、SDF-1中和抗体、CXCR4拮抗剂AMD3100、H19、sh-SDF-1、miR-149 mimic、miR-149inhibitor等处理BMMSCs,检测钙化结节（Von Kossa染色）、矿化结节（茜素红S染色）、ALP和OCN等指标;流式细胞仪检测CD44、CD90、CD14和CD45等表面标志;Western blot检测ALP、OCN、RUNX2、OSX等蛋白的表达。结果:（1）成功建立大鼠成骨分化模型。与假手术比较,在第2周和第4周时大鼠成骨分化模型组的STRO-1蛋白表达、ALP活性和OCN含量显着升高（P<0.05）。分离BMMSCs,成功诱导其成骨分化。BMMSCs诱导成骨分化3周后,细胞形态由梭形变为多边形,可见钙盐结节。与对照组比较,骨分化诱导组ALP活性及OCN含量明显增强（P<0.05）。（2）生物信息学分显示SDF‐1的3′UTR与miR‐149序列之间有1个特定的结合区域。与对照组比较,miR-149明显抑制SDF-1-wt 3’-UTR的荧光素酶活性（P<0.05）。与对照组比较,miR-149 mimic组BMMSCs的SDF-1表达明显降低（P<0.05）,而在miR-149 inhibitor组明显升高（P<0.05）。与对照组比较,miR-149inhibitor组BMMSCs的ALP活性、OCN含量、矿化结节和钙化结节数量、RUNX2和OSX蛋白表达明显升高,而miR-149 mimic组明显降低（P<0.05）。（3）与对照组比较,骨分化诱导组miR-149的甲基化水平较高,而在5-Aza-CdR组中,miR-149的甲基化水平较低（P<0.05）;与DMSO组相比,第7、12天5-Aza-CdR组的miR‐149表达明显降低（P<0.05）。与骨分化诱导组相比,5-Aza-CdR组的ALP活性、OCN含量、CD44、CD90阳性率等明显降低（P<0.05）。（4）与对照组相比,骨分化诱导组、SDF-1中和抗体组和AMD3100组miR‐149表达明显下降（P<0.05）。与骨分化诱导组比较,SDF-1中和抗体组或AMD3100组的ALP活性、OCN含量、Nanog、Oct-4、Sox-2等表达均降低（P<0.05）。（5）生物信息学分析显示miR-149与H19有部分碱基互补;成骨分化大鼠模型骨膜的miR-149与H19的表达呈显着负相关（P<0.05）。与anti-IgG比较,anti-AGO2组H19和miR-149明显富集（P<0.05）。与对照组比较,成骨分化诱导组BMMSCs的H19表达明显升高（P<0.05）。与sh-H19组BMMSCs组比较,H19组BMMSCs的H19表达、钙化结节和矿化结节数量、ALP活性、OCN含量、RUNX2及OSX蛋白表达明显增加（P<0.05）。（6）与对照组相比,H19+miR-149mimic组BMMSCs的H19表达、ALP活性、OCN含量、钙化和矿化结节数量、RUNX2及OSX蛋白的表达下降,而H19+miR-149 inhibitor组升高（P<0.05）。与H19-NC组相比,H19组SDF-1表达、ALP活性、OCN含量、矿化结节、钙化结节、RUNX2、OSX表达等明显升高（P<0.05）;与H19+sh-SDF-1-NC比较,H19+sh-SDF-1的SDF-1表达、ALP活性、OCN含量、矿化结节、钙化结节、RUNX2、OSX表达等明显升高降低（P<0.05）。结论:miRNA-149能够与SDF-1基因的3′UTR结合,下调成骨转化BMMSCs的SDF-1蛋白的表达,而miRNA-149基因启动子区的甲基化,下调胞质中miRNA-149的表达,进而上调SDF-1与CXCR4的表达,刺激BMMSCs的成骨分化,增加BMMSCs的钙化结节和矿化结节的形成,升高ALP活性和OCN含量。H19与miRNA-149基因相互作用,下调miRNA-149的表达,从而通过SDF-1/CXCR4通路,促进BMMSCs成骨分化。
芦笛[5]（2019）在《间充质干细胞在急性移植物抗宿主病和异体皮片移植排斥反应中对B细胞的免疫调节作用研究》文中研究指明目的 间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSC）因其广泛而强大的免疫调节作用,被应用于移植中,以减轻移植后免疫抑制剂的用量。在急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-hostdisease,aGVHD）中,MSC对B细胞的免疫调节作用尚未十分明确。我们试图通过检测小鼠aGVHD中B细胞活化标志和共刺激分子的表达以及相关细胞因子的分泌情况,研究MSC在aGVHD中的作用以及对B细胞的作用。MSC在体内输注后,能够到达次级淋巴器官的MSC寥寥无几,这造成MSC在体内的免疫调节作用明显不如在体外的作用。为了增加MSC靶向迁移到次级淋巴器官,我们尝试将MSC过表达CCR7,探索过表达CCR7的MSC能否减轻大鼠同种异体皮片移植的排斥反应,并探究这种MSC对排斥反应中B细胞的作用。为临床减轻移植免疫排斥反应提供理论支持。方法 第一部分:从C57小鼠的股骨、胫骨中,采用全骨髓贴壁法分离获得骨髓MSC,并鉴定细胞表面标志物、多能诱导分化（成脂、成骨和成软骨）。第二部分:建立小鼠aGVHD模型,实验组同时合并输注1×106个MSC,观察小鼠平均生存时间,术后第五天取受体脾细胞对P815细胞的杀伤作用,术后6h、12h、24h、3d、5d取受体脾细胞检测淋巴细胞亚群的变化及B细胞其活化标志（CD69）和B细胞共刺激分子（CD86）的表达水平,检测B细胞刺激因子IL-4和Bregs调节因子IL-10的mRNA含量。第三部分:采用免疫磁珠分选系统获得B220-的脾单个核细胞,并用此种细胞建立小鼠B220-aGVHD模型,实验组同时合并输注1×106个MSC,观察小鼠平均生存时间,术后24h受体脾细胞检测淋巴细胞亚群的活化标志（CD69）和B细胞共刺激分子（CD86）的表达水平。第四部分:包装表达大鼠CCR7的慢病毒,测定包装的慢病毒滴度;用此慢病毒转染MSC细胞,检测MSC-CCR7的免疫表型、增殖、多向分化能力等生物学特性。第五部分:建立大鼠异体背部皮片移植模型,分为三组,空白对照组,MSC-CCR7输注组和MSC-GFP输注组,移植术前24h内空白对照组仅输注0.5mlPSB,另两组输注2×106对应细胞;术后7天打开包扎,观察皮片成活时间,并于D7、D10、D14行皮片活检;D3、D7、D10、D14取淋巴结和脾脏行流式细胞学,检测T细胞活化（CD3+CD69）、Treg亚群、B细胞活化（CD45R+CD69）及共刺激分子（CD86、CD40）表达情况;D3、D7、D10、D14取血浆,流式检测血浆中细胞因子（IL-2、IL-6、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α）的含量。结果 第一部分:全骨髓贴壁法可以分离出小鼠骨髓间充质干细胞;第二部分:aGVHD+MSC组较aGVHD组生存时间延长;移植术后D5,aGVHD+MSC组脾单个核细胞对P815细胞的杀伤性小于aGVHD组;MSC输注抑制了供者源性B细胞表面CD69和CD86的表达,B细胞中的IL-4的mRNA水平显着降低,IL-10的水平在D5显着升高。第三部分:分选后的脾单个核细胞几乎不含B细胞;B220-aGVHD组、B220-aGVHD+MSC较aGVHD组和aGVHD+MSC组生存时间明显延长,术后24h CD69+在CD3 阳性T淋巴细胞上的表达明显降低低。第四部分:采用脂质体转染慢病毒包装+PEG6000浓缩,可以获得高滴度的病毒（CCR7病毒滴度为5.6×109/ml,GFP病毒滴度为6.0×1010/ml）;用此慢病毒转染后的MSC-CCR7细胞,荧光下呈绿色,流式检测CCR7 阳性;MSC,MSC-CCR7,MSC-GFP表面标志物符合间充质干细胞标准,均能成脂、成骨诱导;三种细胞MTT法测得生长速率无统计学差异。第五部分:MSC-CCR7输注组异体皮片存活时间较MSC-GFP输注组和空白对照组长（P<0.05）;外观出现急性排斥反应的最初征象较其余两组晚;同一取材时间点,MSC-CCR7输注组的病理表现最轻;MSC-CCR7输注组活化的T、B细胞细胞含量、B共刺激分子CD86和CD40的表达均较其他两组低,Treg含量较其他两组高;MSC-CCR7输注组IFN-y、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α先升高又降低,IL-17、IL-10持续升高;MSC-GFP输注组和空白对照组IL-4先下降后升高,IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-17、TNF-α先升高又降低,IL-10持续升高。结论①采用全骨髓贴壁+连续传代法可以获取符合间充质干细胞标准的小鼠骨髓间充质干细胞;②共输注MSC可以延长aGVHD模型小鼠的生存时间,减轻脾单个核细胞对供体细胞的杀伤性;③共输注MSC可以通过通过减少T细胞活化比例、减少B细胞共刺激分子分泌水平、降低B细胞刺激因子IL-4、升高Breg诱导因子IL-10,抑制aGVHD发生发展;④B细胞的缺失进一步延长了 aGVHD小鼠的平均生存时间;⑤清除B细胞、输注MSC均可减轻24h活化的T细胞所占T细胞的比例;⑥采用慢病毒转染+药筛的方式,获得较纯的高表达CCR7基因且仍符合间充质特性干细胞的细胞,;⑦过表达CCR7的间充质干细胞可以延长大鼠异体皮片移植的生存时间,减轻大鼠异体皮片移植的排斥反应;⑧输注的MSC-CCR7通过降低、延缓T细胞活化、B细胞活化和抗原呈递作用,增加Treg细胞比例,增加抗炎类细胞因子分泌,降低促炎类细胞因子分泌,减轻异体皮片移植的排斥反应。
高连升[6]（2019）在《苯甲酸钠调控DJ-1对创伤性脊髓损伤的神经保护作用及机制研究》文中研究指明背 景创伤性脊髓损伤（traumatic spinal cord injury,t-SCI）是世界范围内最严重的损伤之一,具有很高的致死率和致残率,严重威胁着人类的生命健康。T-SCI的发病机制复杂,涉及一系列病理、生理和生化改变,概括起来可以分为原发性损伤以及继发性损伤。原发性损伤指的是损伤当时外力对脊髓神经细胞、突起、血管等造成的急性机械性破坏,造成脊髓压迫、挫伤甚至离断,导致血脊髓屏障（blood-spinal cord barrier,BSCB）破坏,脊髓出血、缺血,细胞坏死。继发性损伤是由原发性损伤引发的一系列分子、细胞和生化反应,持续进展贯穿整个t-SCI过程。包括出血性损伤、缺血性损伤、氧化应激损伤、谷氨酸兴奋性毒性、炎症、细胞凋亡、轴突脱髓鞘和变性、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）重塑以及胶质增生等。以上这些机制综合作用并相互促进,互为因果,进一步加重脊髓损伤。其中氧化应激损伤是t-SCI的关键机制之一。在氧化应激反应中,活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）过量生成并引起一系列有害效果,包括脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤,同时还会激活多条信号通路引发细胞凋亡。神经元凋亡是t-SCI后重要的病理变化,与t-SCI后的神经功能障碍密切相关,抑制神经元凋亡可显着改善t-SCI后的神经功能。DJ-1是一种高度保守并广泛表达的蛋白,在全身多种组织中都有表达,其作用涉及细胞生命活动的多个方面,包括氧化应激,线粒体功能调节,转录调节,蛋白质-RNA相互作用,分子伴侣活性等,其中最重要的作用是抵抗氧化应激损伤。研究表明,DJ-1 在帕金森病（Parkinson’s disease,PD）,阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）以及其他神经退行性疾病及缺血性卒中发挥重要的神经保护作用,而其神经保护效果可能有赖于其抗氧化应激及抗凋亡能力。苯甲酸钠（natrium benzoate,NaB）是一种芳香羧酸的钠盐,具有广泛的药理作用。许多研究表明NaB可通过提高DJ-1的表达而发挥神经保护作用,然而其潜在机制尚不明确。在t-SCI中NaB是否能通过升高DJ-1发挥神经保护作用,其相应机制如何,目前尚无相关研究。本研究旨在探讨NaB调控DJ-1对t-SCI的神经保护作用及机制,为t-SCI治疗提供潜在的药物和可能的作用靶点。方 法第一部分实验1:SD大鼠分为7组,假手术组（sham组）,创伤性脊髓损伤后3小时组（t-SCI 3h组）,创伤性脊髓损伤后6小时组（t-SCI 6h组）,创伤性脊髓损伤后12小时组（t-SCI 12h组）,创伤性脊髓损伤后24小时组（t-SCI 24h组）,创伤性脊髓损伤后48小时组（t-SCI 48h组）,创伤性脊髓损伤后72小时组（t-SCI 72h组）。蛋白免疫印迹（western blot,WB）检测 DJ-1 的表达变化,免疫荧光（immunofluorescence,IF）检测DJ-1和NeuN共染情况,苏木素和伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色观察脊髓显微结构。实验2:SD大鼠分为6组,假手术组（sham组）,创伤性脊髓损伤+溶剂组（t-SCI+vehicle组）,创伤性脊髓损伤+scramble小干扰RNA组（t-SCI+scramble siRNA组）,创伤性脊髓损伤+DJ-1小干扰RNA组（t-SCI+DJ-1 siRNA组）,创伤性脊髓损伤+苯甲酸钠组（t-SCI+NaB组）,创伤性脊髓损伤+苯甲酸钠+DJ-1小干扰RNA组（t-SCI+NaB+DJ-1 siRNA组）。WB检测DJ-1、Nrf-2、HO-1、SOD2、p-p38 MAPK、Bcl-2、Bax、CC-3、MMP-9、Claudin-5、Occludin及ZO-1 的表达,同时检测ROS水平,干湿重法检测脊髓水含量（spinal cord water content,SCWC）,伊文思蓝（evans blue,EB）渗出法检测BSCB破坏情况。实验3:SD大鼠分为3组,假手术组（sham组）,创伤性脊髓损伤+溶剂组（t-SCI+vehicle组）,创伤性脊髓损伤+苯甲酸钠组（t-SCI+NaB组）。T-SCI+vehicle组和t-SCI+NaB组大鼠术后连续给药7天。于术后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天和第28天行BBB（Basso,Beattie,and Bresnahan）评分和斜板试验（inclined plane test,IPT）评分观察大鼠运动功能。第二部分实验1:采用第一部分实验1的动物样品及分组,WB检测p-Akt的表达变化。实验2:采用第一部分实验2的动物样品及分组,WB检测p-Akt的表达。实验3:SD大鼠分为5组,假手术组（sham组）,创伤性脊髓损伤+溶剂组（t-SCI+vehicle组）,创伤性脊髓损伤+苯甲酸钠组（t-SCI+NaB组）,创伤性脊髓损伤+MK2206组（t-SCI+MK2206组）,创伤性脊髓损伤+苯甲酸钠+MK2206组（t-SCI+NaB+MK2206 组）。WB 检测 DJ-I、p-Akt、Nrf-2、HO-I、SOD2、p-p38 MAPK、Bcl-2、Bax以及CC-3的表达,同时检测ROS水平。IF检测CC-3、TUNEL和NeuN共染情况,透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）观察神经元超微结构。实验4:人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）分为5组,对照组（control组）,损伤+溶剂组（injury+vehicle组）,损伤+苯甲酸钠组（injury+NaB组）,损伤+MK2206组（injury+MK2206 组）,损伤+苯甲酸钠+MK2206 组（injury+NaB+MK2206 组）。四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法,台盼蓝（trypan blue,TB）染色法检测细胞活性,WB 检测 DJ-1、p-Akt、Nrf-2、HO-1、SOD2、p-p38 MAPK、Bcl-2、Bax以及CC-3的表达,同时检测ROS水平。结 果第一部分T-SCI后,DJ-1的水平显着升高,24小时达最高峰后逐渐下降。T-SCI后24小时,DJ-1 阳性神经元比例显着升高,DJ-1、Nrf-2、HO-1、SOD2、ROS、p-p38 MAPK和CC-3的水平显着升高,Bcl-2/Bax比值显着降低。DJ-1 siRNA显着降低了 DJ-1及Nrf-2、HO-1、SOD2的水平,升高了 ROS、p-p38 MAPK及CC-3的水平并降低了 Bcl-2/Bax比值。NaB治疗显着升高了 DJ-1及Nrf-2、HO-1、SOD2的水平,降低了 ROS、p-p38 MAPK及CC-3的水平并升高了 Bcl-2/Bax比值,且这些效果可以被DJ-1 siRNA所逆转。T-SCI后24h,SCWC和EB渗出显着升高,MMP-9的水平显着升高,Claudin-5、Occludin和ZO-1的水平显着降低,NaB治疗显着改善了上述情况。T-SCI后,BBB评分和IPT评分显着下降,NaB治疗在t-SCI后21和28天显着提高了上述评分。第二部分T-SCI后,p-Akt的水平显着升高,24小时达最高峰后逐渐下降。T-SCI后24小时,DJ-1 siRNA显着降低了 p-Akt的水平,NaB治疗显着升高了 p-Akt的水平,且这种效果可以被DJ-1 siRNA所逆转。T-SCI后24小时,CC-3和TUNEL 阳性神经元比例显着升高,TEM显示神经元超微结构呈现凋亡改变,线粒体空泡化比例显着升高。NaB治疗显着改善了上述情况,且这些效果效果可以被MK2206所逆转。体外实验发现损伤后细胞活性显着降低。NaB治疗显着改善了上述情况,显着升高了 DJ-1、p-Akt、Nrf-2、HO-1、SOD2 的水平,显着降低了 ROS、p-p38 MAPK和CC-3的水平,显着升高了 Bcl-2/Bax比值,且这些效果效果可以被MK2206所逆转。结 论第一部分NaB治疗可以增加DJ-1及抗氧化蛋白水平,减少ROS及ROS诱导的神经元凋亡,同时还可减轻BSCB破坏和脊髓水肿,并改善长期运动功能。第二部分DJ-1通过促进Akt磷酸化介导其下游抗氧化应激效果,从而减轻氧化应激诱导的神经元凋亡。
邵联波[7]（2018）在《低免疫排斥性的间充质干细胞及其外泌体在心肌梗死修复中的机制研究》文中认为急性心肌梗死是临床常见的急症之一,死亡率高,而且预后差,对人们的健康造成了严重危害。干细胞移植治疗是近年发展起来的一项新型临床前沿技术,其原理是通过移植或动员干细胞进入梗死心肌组织,增加梗死区心肌样细胞及毛细血管数量,替代、修复或加强受损的组织或器官的生物学功能,逆转心脏重构,改善心功能。本文通过CRISPR/Cas9系统构建了低免疫排斥性的B2M-UMSCs细胞,并在此基础上研究了将外泌体中的miRNA分子在心肌梗死后的心肌修复过程中的具体作用机制。首先从幼龄大鼠中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）,并收集骨髓间充质干细胞来源的外泌体。分别将间充质干细胞及其来源的外泌体移植到大鼠心梗模型中,通过心超检测、免疫组化、Masson染色等对修复效果进行检测,同时利用不同的体外细胞模型,对外泌体的作用机制进行初步研究。发现BMSCs细胞及其来源的外泌体都具有修复心肌梗死的效果,且BMSCs来源的外泌体具有促进细胞增殖、抑制心肌细胞凋亡、抑制纤维化反应的功能;将BMSCs细胞和外泌体进行miRNA测序后发现,BMSCs细胞及其来源的外泌体具有相似的表达谱。异体间充质干细胞移植已经成为干细胞治疗心肌梗死的最新发展趋势,但是异体移植的MSCs可以引起免疫反应,而且其表达的HLA-I类分子是引起免疫排斥反应的主要原因。为了研究免疫排斥反应对干细胞移植治疗心肌梗死的影响,我们利用CRISPR/Cas9系统敲除细胞表面的B2M分子,进而降低其HLA-I类分子的表达,构建了低免疫排斥性的B2M-UMSCs细胞。敲除B2M分子后,细胞的干性无明显变化。体外实验证实B2M敲除后,能够降低CD8+T细胞介导的杀伤作用;将B2M-UMSCs移植到心梗模型中后,发现其几乎不引起免疫排斥反应,且更能改善心功能。旁分泌是间充质干细胞发挥作用的主要途径之一,间充质干细胞来源的外泌体移植可以修复心肌损伤,但是其发挥作用的具体机制还有待研究。本研究中以LAD结扎诱导的急性心肌梗死为模型,研究间充质干细胞来源的外泌体修复心肌梗死的具体作用机制。通过miRNA测序筛选出在细胞和外泌体中表达量较高的miRNA分子,然后通过生物信息学分析发现mi R-24可以通过抑制Bim的表达进而抑制心肌细胞凋亡;按照loss/gain of function的策略,对外泌体中mi R-24的表达进行调控,并在H2O2诱导的细胞凋亡模型和大鼠急性心肌梗死模型中验证了外泌体中的mi R-24抑制细胞凋亡功能。最终体内、体外实验均证实UMSCs细胞通过外泌体将mi R-24传送到心肌细胞中,并通过抑制心肌细胞中Bim蛋白的表达来抑制心肌细胞凋亡,修复心肌梗死。结论:我们的研究结果证实,敲除B2M分子是避免异体间充质干细胞移植免疫排斥反应的一个方便、有效的策略,为未来临床上使用无需HLA配型的组织修复、再生细胞治疗提供了思路;B2M-UMSCs细胞通过外泌体将mi R-24传送到心肌细胞中,并通过抑制心肌细胞中Bim蛋白的表达来抑制心肌细胞凋亡,修复受损心肌,为临床使用间充质干细胞来源的外泌体修复受损的心肌提供了依据。
廖肇福[8]（2019）在《心脏Telocytes协同心脏干细胞治疗缺血性心肌梗死及其机理的研究》文中提出目的:（1）对心脏Telocytes（CTs）、心脏干细胞（CSCs）和骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗缺血性心肌梗死的疗效进行比较;（2）对CTs与CSCs不同的协同方式移植治疗缺血性心肌梗死的疗效进行比较;（3）对CTs分泌外泌体治疗缺血性心肌梗死的疗效及其机制进行研究;（4）对CTs外泌体所含的miRNA-21-5p治疗缺血性心肌梗死的疗效及其机理进行研究;（5）对不同细胞、CTs外泌体治疗和miR-21-5p治疗心肌梗死的疗效进行比较;（6）对CTs外泌体的蛋白组可能参与梗死心肌修复再生的可能机理进行生物信息学预测;（7）对年青与年老CTs表达基因的差异组学及随增龄相应通路改变进行研究。方法:（1）通过贴壁法分离得到MSCs,磁珠分选法分离得到CTs和CSCs,然后分别将总细胞量为5×105的CTs、CSCs、MSCs、4种不同的CTs协同CSCs的方式[（1）CTs与CSCs在Transwell系统中共培养48小时后,移植共培养后的CSCs（5×105个细胞）（CSCs-co）;（2）移植正常培养的CTs（2.5×105个细胞）和低氧（5%O2）培养48 h的CSCs（2.5×105个细胞）（CTs+CSCs-hyp）;（3）移植正常培养的CTs（2.5×105个细胞）和在Transwell中与CTs共培养48 h后的CSCs（2.5×105个细胞）（CTs-nor+CSCs-co）;（4）移植CTs（2.5×105个细胞）和CSCs（2.5×105个细胞）混合培养48 h后的混合细胞（CTs+CSCs-co）]及PBS移植到利用左冠状动脉前降支（LAD）结扎术构建的心肌梗死大鼠的心肌层中。细胞心肌内移植4周后,使用超声心动图评价心功能;使用Masson’s trichrome染色,对各组心肌梗死面积、心脏纤维化程度、左心室室壁厚度进行半定量比较分析;使用抗v WF免疫组化染色对各组梗死区和梗死边缘区的血管密度进行半定量分析比较;使用抗PH3和α-SA,抗Ki67和Cardiac troponin I的免疫荧光双标染色对各组梗死区和梗死边缘区的增殖心肌数进行半定量分析;使用抗c-Kit和CD34,及抗c-Kit和Sca-1的免疫荧光双标染色分别对各组梗死区存活的CTs和CSCs密度进行半定量分析;（2）使用透射电镜观察大鼠心肌层的CTs及CTs分泌的外泌体。通过心肌内注射移植CTs外泌体到LAD结扎的大鼠梗死心肌层中,4周后使用超声心动图对CTs分泌外泌体治疗组和PBS对照组的心功能进行评价分析;使用Masson’s trichrome染色,对心肌梗死面积、心脏纤维化程度、左心室室壁厚度进行半定量分析;使用抗α-SMA和抗MMP2的免疫荧光染色分别对各组梗死区成肌成纤维细胞密度和MMP2的表达量进行半定量分析;使用抗v WF的免疫组化染色和抗Ki67与Cardiac troponin I的免疫荧光双标染色分别对各组梗死区与梗死边缘区的血管密度和增殖心肌数进行半定量分析;使用抗c-Kit和Sca-1的免疫荧光双标染色分别对各组梗死区存活的CSCs密度进行半定量分析;把经Di I染色的CTs分泌外泌体与CSCs进行共孵育,以观察CTs分泌外泌体是否能进入CSCs;使用流式细胞技术、死活细胞染色和CCK8分别对CTs分泌外泌体对缺血缺氧环境中的CSCs可能的保护作用进行分析;（3）使用qPCR对与CTs共培养48小时的CSCs中的miR-21-5p表达水平进行定量分析。通过心肌内注射miR-21-5p agomir和无关序列对照至LAD结扎致心梗的大鼠缺血心肌层中,7天后利用超声心动图对心功能进行评价;使用Masson’s trichrome染色对心肌梗死面积进行半定量分析比较;使用抗Ki67和Cardiac troponin I的免疫荧光双标染色对各组梗死区和梗死边缘区的增殖心肌数进行半定量分析;使用抗c-Kit和Sca-1的免疫荧光双标染色对各组梗死区存活的CSCs进行半定量分析。使用生物信息学预测miR-21-5p潜在靶基因,并利用qPCR和双荧光素酶报告系统确认miR-21-5p的靶基因,并使用针对靶基因的siRNA对miR-21-5p靶基因及功能进行研究。（4）通过单因素方差分析比较不同细胞、CTs外泌体和miR-21-5p治疗心肌梗死的射血分数、缩短分数、左心室收缩和舒张末期直径和梗死面积,以比较相应的疗效。（5）使用蛋白质非标记定量质谱技术和Ingenuity Systems Pathway Analysis（IPA）生物信息学系统对常氧和低氧环境下,CTs分泌外泌体参与心肌修复与再生的功能因子进行分析。（6）通过基因芯片和IPA生物信息学系统对年老和年青CTs差异表达的基因可能参与调控心血管生理与病理与通路进行分析。结果:（1）CTs,MSCs和CSCs分别对心梗治疗的疗效比较:心功能指标,CTs治疗组的射血分数、缩短分数、左心室收缩和舒张末期直径相比MSCs组和CSCs组差异均无显着性统计学意义（P>0.05）;梗死面积,CTs治疗组的梗死面积显着小于MSCs组（P<0.05）,与CSCs组的差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;心脏纤维化指标,CTs治疗组的梗死区胶原面积和梗死对侧区的血管周边胶原面积均分别显着小于MSCs组和CSCs组（P<0.05）;左心室重构指标,CTs治疗组的梗死区边缘厚度和最小厚度与MSCs组和CSCs组差异均无显着性统计学意义（P>0.05）;血管新生,CTs治疗组的梗死区血管密度分别显着性大于MSCs组和CSCs组（P<0.05）,CTs治疗组的梗死边缘区血管密度显着性大于MSCs组（P<0.05）,而和CSCs组的差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;梗死区和边缘区的心肌增殖,CTs治疗组的PH3阳性心肌或Ki67阳性的心肌数与MSCs组和CSCs组的差异无显着性统计学意义（P>0.05）;梗死区CSCs和CTs的密度,CTs治疗组的梗死区CTs密度和CSCs密度分别与MSCs组和CSCs组相比,差异无显着性统计学意义（P>0.05）。（2）4种不同协同方式的CTs和CSCs治疗对心梗治疗的疗效比较:心功能指标,4种不同协同方式的CTs和CSCs治疗组中只有CTs+CSCs-co治疗组的射血分数和缩短分数分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.01）,左心室收缩末期直径分别显着小于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.05）,左心室收舒张期直径分别显着小于单独移植CTs组和MSCs组（P<0.05）,但与CSCs组的差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;梗死面积,4种不同协同方式的CTs组和CSCs治疗组中只有CTs+CSCs-co治疗组的梗死面积分别显着小于单独移植CTs、CSCs和MSCs组（P<0.05）;心脏纤维化指标,CTs+CSCs-co治疗组的梗死区胶原面积分别显着小于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.05）,梗死对侧区血管周边胶原面积分别显着小于单独移植CSCs组和MSCs组（P<0.01）,但与CTs组的差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;左心室重构指标,CTs+CSCs-co治疗组的梗死边缘厚度与CTs组、CSCs组和MSCs组差异均无显着性统计学意义（P>0.05）,而梗死区最小厚度分别显着大于CSCs组和MSCs组（P<0.05）,但与CTs组差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;血管新生,CTs+CSCs-co治疗组的梗死区和梗死边缘区的血管密度均分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.01）;梗死区和边缘区心肌增殖,CTs+CSCs-co治疗组的PH3阳性心肌或Ki67阳性的心肌数均分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.05）;梗死区CSCs和CTs的存活,CTs+CSCs-co治疗组的梗死区CTs密度和CSCs密度均分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.05）。（3）通过透射电镜在大鼠心肌层观察到典型形态的CTs及其分泌的外泌体;心肌注射CTs外泌体对心梗治疗的疗效:心功能指标,CTs外泌体治疗组的射血分数和缩短分数分别显着大于PBS对照组（P<0.05）,左心室收缩末期直径显着小于PBS组（P<0.01）,左心室舒张末期直径与PBS组的差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;梗死面积,CTs外泌体治疗组的梗死面积显着小于PBS组（P<0.05）;心脏纤维化指标,CTs外泌体治疗组的梗死区胶原面积、梗死对侧区的血管周边胶原面积以及梗死区成肌成纤维细胞密度均显着小于PBS组（P<0.01）;左心室重构指标,CTs外泌体治疗组的梗死边缘厚度显着大于PBS对照组（P<0.05）,但最小厚度与PBS组的差异没有统计学意义（P>0.05）,梗死区的MMP2的表达量显着低于PBS对照组（P<0.01）;血管新生,CTs外泌体治疗组的梗死区血管密度显着大于PBS对照组（P<0.05）,但梗死边缘区血管密度与PBS对照组相比差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;梗死区和边缘区心肌增殖,CTs外泌体治疗组的Ki67阳性的心肌数显着大于PBS组（P<0.01）;梗死区CSCs的存活,CTs外泌体治疗组的CSCs密度显着大于PBS组（P<0.01）;经Di I染色的CTs外泌体能被CSCs摄取,并且发现CSCs经CTs外泌体预处理2 h后相比PBS对照组能显着减少缺血缺氧环境中CSCs的凋亡率和显着提高CSCs的存活率（P<0.05）。（4）与CTs共培养48 h后CSCs的miR-21-5p的表达量显着升高（P<0.01）;心肌注射miR-21-5p对心梗治疗的疗效:心功能指标,miR-21-5p治疗组的射血分数和缩短分数均显着大于无关序列对照组（P<0.05）,左心室收缩和舒张末期直径均显着小于无关序列对照组（P<0.05）;梗死面积,miR-21-5p治疗组的梗死面积显着小于无关序列对照组（P<0.05）;梗死区和边缘区的心肌增殖,miR-21-5p治疗组的Ki67阳性的心肌数显着大于无关序列对照组（P<0.05）;梗死区CSCs存活,miR-21-5p治疗组的CSCs密度均显着大于无关序列对照组（P<0.05）;CSCs过表达miR-21-5p后能显着减小在缺血缺氧环境中的凋亡率（P<0.05）。通过生物信息学预测、q-PCR和双荧光素酶报告细胞验证Cdip1是miR-21-5p的靶基因,通过Cdip1的siRNA沉默CSCs中Cdip1的表达能显着减少CSCs在缺血缺氧环境中的凋亡（P<0.05）。（5）通过比较不同细胞治疗、CT外泌体治疗和miR-21-5p治疗三种疗法对心梗大鼠的心功能和梗死面积,发现所有的细胞治疗组与注射CTs外泌体及注射miR-21-5p治疗组的射血分数、缩短分数相比PBS对照组均显着增加（P<0.05）,而梗死面积显着减小（P<0.05）。而三种治疗心肌梗死的疗法中CTs+CSCs-co组的射血分数和缩短分数最大,梗死面积最小。（6）蛋白质非标记定量质谱技术在常氧和低氧CTs分泌的外泌体中检测到450种和454个蛋白,通过IPA分析揭示这些蛋白可能参与血管新生、心脏纤维化、细胞增殖和细胞死亡与存活等去影响心肌梗死进程。（7）通过比较分析老年CTs与年青CTs的表达芯片,发现老年CTs相比年青CTs表达量上调有注释的基因有1948个,表达量下调有注释的基因有1407个,IPA分析揭示老年CTs相比年青CTs表达有显着性差异的基因和显着性差异在5倍以上的基因都与Cardiovascular system development and function和Cardiovascular disease高度相关。结论:（1）移植CTs治疗心肌梗死,在减少梗死面积和心脏纤维化与促进血管新生方面略优于单独移植CSCs和MSCs;（2）4种CTs与CSCs协同治疗方式中CTs+CSCs-co对心肌梗死的疗效最佳,并且在改善心功能,减小梗死面积和心脏纤维化,促进血管新生、心肌增殖、CTs网络重构及CSCs的存活方面优于单独移植CTs、CSCs和MSCs治疗;（3）使用CTs分泌的外泌体对心梗进行治疗能显着改善心梗心脏的心功能,减小梗死面积和心脏纤维化,改善左心室重构,促进血管新生、心肌增殖以及CSCs的存活;（4）心肌内注射miR-21-5p对心梗进行治疗能显着减小梗死面积,促进心肌增殖和CSCs存活,miR-21-5p保护CSCs的机制之于是通过下调靶基因Cdip1的表达减少缺血缺氧环境中CSCs的凋亡;（5）三种治法（细胞、CTs外泌体和miR-21-5p）对心梗的治疗中,CTs+CSCs-co组治疗的疗效相对最佳;（6）CTs分泌外泌体所含的蛋白因子可能参与梗死心肌的再生;（7）老年CTs相比年青CTs表达差异的基因可能参与心脏衰老和心血管疾病的发生。
唐劲草[9]（2017）在《间充质干细胞介导TGF-β1减轻移植肝急性排斥反应》文中认为众所周知,作为肝炎高发国,终末期肝病在我国有很高的发病率。肝移植作为治疗终末期肝病的唯一有效途径。移植肝的免疫排斥一直是不可回避和亟待解决的问题,应用免疫抑制剂虽能减少排斥反应的发生,但是它带来的并发症不可忽视。因此如何能够诱导移植物的自发免疫耐受,少用或者不用免疫抑制剂,成为移植免疫学研究的热点之一。自然发生调节性T细胞Tregs（naive Treg,nTreg）,具有很强的免疫抑制作用,在诱导同种异体器官移植中免疫耐受的作用已得到证实。Tregs能够被TGF-β在体内及体外诱导。由T细胞诱导生成的调节性T细胞（iTreg）与nTreg具有相似的表型和功能特性,抵抗向Thl、Th17细胞的分化,抑制Th17细胞的分化和发育,可以弥补nTreg的不足,在移植免疫中更具应用价值和前景。诱导移植肝产生iTreg,主要需要两个条件:1.足够的T细胞,2.能够稳定表达TGF-β基因的合适载体。移植肝在术中受到缺血再灌注损伤,移植后也会因排斥或其它因素导致移植肝损伤,移植肝内部大量T细胞聚集,满足了 iTreg生成的第一个条件;间充质干细胞（MSCs）的两个特点使其成为携带TGF-β基因的绝佳载体:①MSCs易于被外源基因感染,是携带外源基因的良好载体。②MSCs具有向损伤组织趋化、迁移的特性,因此在肝移植引起的组织损伤微环境中,能够携带TGF-β1靶向性、高浓度地聚集于移植肝,从而满足了 iTreg生成的第二个条件。本研究中以MSCs介导TGF-[β 1诱导iTreg生成减轻移植肝急性排斥反应。第一部分:TGF/MSCs体系构建及体外实验研究TGF/MSCs对iTreg生成的影响目的:在体外分离培养大鼠骨髓MSCs,并进行鉴定,构建携带人转化生长因子-β1（TGF-[β 1）基因的慢病毒并感染MSCs,观察表达TGF-β 1 的MSCs（TGF/MSCs）的特性,体外检测TGF/MSCs的免疫抑制作用,并观察其诱导iTreg的生成效率。方法:利用贴壁加酶消化法培养大鼠MSCs,并进一步传代扩增,并利用显微镜观察其生长特性。同时对细胞绘制生长曲线。利用流式细胞仪检测细胞表面标志。构建hTGF-β 1慢病毒表达质粒,以GFP为标记。转染293T细胞,PCR测定其滴度。将慢病毒感染MSC细胞,检测其感染效率,利用ELISA法检测细胞培养上清hTGF-β 1、大鼠TGF-β 1（rTGF-β 1）分泌水平。同时再利用大鼠脾脏细胞构建体外混合淋巴细胞反应（MLR）,检测TGF/MSCs细胞对T细胞增殖及IFN-y表达的抑制作用,同时用流式细胞仪测定iTreg的生成。结果:成功获得MSCs细胞,并能够再传代培养中得以进一步纯化。获取的MSCs,具有纯度高,生长良好,细胞增殖能力强的特点。5-6d左右传代,能在体外传代18代以上,增殖能力强大。检测了第3代的MSCs表面标志CD44为98.12%,呈阳性高表达。同时成功构建携带hTGF-β 1基因的慢病毒。MSCs感染携带hTGF-β 1基因的病毒上清后（细胞命名为TGF/MSC）,RT-PCR可以检测出TGF-β 1 mRNA表达,ELISA和western Blot能够检测到TGF-β 1因子,相比于MSCs组TGF/MSCs组显着抑制IFN-γ的表达和淋巴细胞增殖。同时TGF/MSCs和MSCs在体外都能诱导iTreg的生成,而TGF/MSCs诱导生成更多,两者具有统计学差异。结论:贴壁加酶消化法分离培养MSCs简单易行,可以得到高纯度的MSCs,有稳定的生物学特征。通过慢病毒载体感染MSCs细胞,使其能够介导hTGF-β 1基因,表达hTGF-β 1基因的MSCs组相对于MSCs组有更强的免疫抑制作用,说明TGF-β 1和MSC两者在体外免疫抑制具有协同作用。第二部分:体内实验验证TGF/MSCs对iTreg生成的影响目的:观察表达hTGF-β 1基因的MSCs（TGF/MSCs）在大鼠体内对同种异体移植肝的急性排斥反应的抑制作用,探讨其诱导免疫耐受的机制。方法:建立稳定的DA-LEWIS大鼠同种异体肝移植急性排斥模型,供肝植入、肝脏复苏后立即经门静脉注入1mLPS,1*109 TU LV-TGF,5*106 MSCs或者TGF/MSCs。记录生存时间;另建立4组模型,分别于术后1,3,5,7天处死大鼠,3,5,7天观察肝功能,第7天行肝脏病理切片,绘制生存曲线,进行Banff评分,ELISA方法检测受体肝组织和血清中hTGF-β 1、IL-1(β、IL-6、IL-10、IFN-γ等细胞因子的水平。RT-PCR检测肝组织中hTGF-β 1、rTGF-β 1、IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-y mRNA表达,检测MSCs在肝脏内表达,ELISA法检测MSCs、上调因子CCR1、CXCR4、SDF-1的表达。流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+Tregs表达及在组织中的分布、Treg表面因子Helios表达,RT-PCR检测Il-17mRNA表达,流式细胞仪检测T细胞向Th-17细胞及iTreg转化。结果:RT-PCR证实TGF/MSCs组肝组织内有hTGF-β 1基因转录。生存曲线显示,TGF-[β/MSCs组明显好于其他各组。TGF/MSCs组、LV-TGF和MSCs组均能减轻移植肝的急性排斥反应,使受体状况得到改善。对比MSCs组和LV-TGF组,TGF/MSCs组使肝功能得到明显改善,病理学仅能看到轻度急性排斥反应。TGF/MSCs、LV-TGF及MSCs都能抑制T细胞增殖,而且TGF/MSCs组明显低于LV-TGF组及MSCs组。无论是在组织还是血清中,TGF/MSCs组、LV-TGF组及MSCs组促炎症因子IL-1,IL-6及IFN-y表达低于PS组,TGF/MSCs组明显低于TGF组及MSC组。而抑制炎症因子IL-10则正好相反。移植前我们用CM-DIL作为标记MSC,发现在术后第7天TGF/MSCs组CM-DIL标记细胞显着多于MSCs组,同样我们可以看到TGF/MSCs组MSC上调因子CCR1,SDF-1,CXCR4表达显着高于MSCs组,而PS组及LV-TGF组未见有上述表达,说明TGF-β 1促进MSCs向肝内聚集。由于携带有外源性hTGF-[β 1,第1天总TGF-β 1在TGF/MSCs组表达明显增高,同时我们观察到TGF-β 1在7天时TGF/MSCs组表达最低。与之对应的,术后第1天各组Tregs减少,以TGF/MSCs组减少最多,但是随着炎症反应的降低,各组的Treg逐步上升,而TGF/MSCs组的增加幅度最大,术后第5天开始与PS组有统计学意义,第7天该组CD4+Foxp3+细胞达到峰值。nTreg表达Hellos+,而iTregs则为Helios阴性,可以作为区别nTreg和iTreg的标记。我们进一步研究发现,在术后第7天Helios阴性之iTreg在各组明显增多,而以TGF/MSCs组最多,说明在经历了移植后第1天nTregs的大量丢失之后,又生成了新的iTreg;在TGF/MSCs组外周血、脾脏和肝脏组织内,又以肝脏内iTreg最多。结论:TGF/MSCs能有效减少肝移植术后免疫排斥反应并能提高生存时间。TGF/MSCs可通过抑制T细胞增殖及炎性因子的释放起作用。TGF/MSCs能有效诱导iTreg的产生及抑制Th17细胞的生成。TGF/MSCs组早期高水平的TGF-β1表达促进nTreg凋亡和iTreg生成,有效抑制免疫反应。TGF-β 1和MSCs在体内协同作用,效果好于单独使用。TGF/MSCs诱导的iTreg主要局限于移植肝内。
华菲[10]（2016）在《干细胞调控CD45RB+调节性树突状细胞在同种异体心脏移植中的作用》文中研究表明第一部分大鼠BMSCs对DCs表型的影响及CD45RB+DCs免疫功能的检测目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cell,BMSCs）对同种异体骨髓来源的树突状细胞（Dendritic cells,DCs）表型的影响,以及受影响显着的CD45RB+DC亚细胞群的免疫状态。方法:Wistar大鼠的BMSCs和同种异体骨髓来源的树突状细胞（DCs）在体外按等比例进行5d的共培养。根据是否加入BMSCs共同培养,我们将实验分为对照组和实验组两个组别:A组:内毒素脂多糖（LPS）与DCs共培养组,B组:在A组基础上加入BMSCs与DCs共培养组（细胞数量1:1）。对两组DC细胞表面的主要免疫标志物分子的变化情况应用流式细胞仪进行测定和分析,同时观察DCs在光镜下形态学上的改变。利用流式细胞技术分离出大鼠BMSCs诱导的CD45RB+DC细胞群,实验组共分三组:A组:未成熟DC组,B组:CD45RB+DC组,C组:成熟DC组。检测各组细胞表面主要共刺激分子（CD80、CD86、MHC-II）的表达,各组DC摄取抗原的能力（对bead-OVA复合物的摄取）、qPCR方法测各组DC细胞中FOXP3 mRNA的表达,Western Bloting检测各组Foxp3蛋白的表达。结果:和对照组相比,CD45RB、lLT4的表达在BMSCs共培组中DCs表面表达发生上升,而CD86、MHC-II的表达出现下降;同时,CD45RB+组低表达共刺激分子CD80、CD86和MHC-II,呈现出未成熟DC的表征;与此同时CD45RB+组与未成熟DC组的摄取能力也要强于成熟DC组（P<0.05）,CD45RB+DC组与imDC组FOXP3 mRNA及Foxp3蛋白的表达均明显多于mDC组（P<0.05）。结论:BMSCs体外诱导下可以使DCs表面CD45RB与ILT4的表达上调,并导致cd86与mhc2的表达下调,尤其以cd45rb的改变最为明显。经bmscs诱导的cd45rb+dcs摄取抗原的能力明显增强,其foxp3mrna及foxp3蛋白的表达出现上调,呈现出imdc的免疫行为特征。第二部分cd45rb+dcs对t细胞功能影响的体外实验研究目的:通过体外dcs细胞和t淋巴细胞的共培养,分别检测不同dcs细胞对t淋巴细胞增殖能力的影响和其对t淋巴细胞亚群的影响。方法:用wistar大鼠的dcs和sd大鼠的cd4+t细胞进行共培养,包括以下几组。a组:con组为阴性对照组,即sd大鼠的cd4+t细胞,b组:cona为阳性控制组,即sd大鼠分选后的cd4+t细胞给予cona刺激（浓度10ng/ml）,c组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠未成熟dcs进行细胞共培养（dc:t=1:10）,d组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠cd45rb+dcs进行细胞共培养（dc:t=1:10）,e组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠成熟dcs进行细胞共培养（dc:t=1:10）。共培养72h后,取各组cd4+t细胞进行功能检测,包括以cck-8法测定t淋巴细胞的扩增情况;初始th细胞向th1、th2、th17、treg的分化:提取rna之后采用qpcr分别测定相应的特异转录因子t-bet、gata-3、rorγt、foxp3的表达。流式细胞仪检测各组cd4+foxp3+t细胞数量。流式cba法检测培养上清中的il-2、ll-4、il-10、ll-17a、lfn-γ、tnf-α和ll-6等细胞因子表达水平。结果:细胞共培养后,cd45rb+dcs组t细胞增殖能力明显下降,组间有显着差异;同时cd45rb+dcs组cd4+foxp3+t细胞的数量增加,与对照组间有统计学差异（p<0.05）;cd45rb+dcs组和imdcs组特异性转录因子foxp3和t-bet表达上升,gata-3和r0rγ表达下降,ll-2和lfn-γ水平降低,ll-4、ll-10以及tgf-β1水平升高,与对照组间存在明显差别（p<0.05）。结论:大鼠cd45rb+dcs在体外明显抑制反应性t淋巴细胞的增殖,促进初始th0细胞向th2的方向分化倾斜,并能提升调节性t细胞的比例,进而增强t细胞的免疫抑制能力。第三部分cd45rb+dcs静脉输注诱导同种移植免疫耐受的实验研究目的:研究大鼠cd45rb+dcs移植预处理方法诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的作用。方法:首先建立wistar大鼠幼鼠至sd大鼠同种异体颈部心脏移植模型。在移植的5天前,对受体大鼠进行相应的细胞静脉注射。分组:a组（对照组）:只行颈部同种异位心脏移植;b组（imdcs注射组）:受体大鼠经静脉注射供体大鼠未成熟dc细胞1×106/0.2ml;c组（cd45rb+dcs注射组）:受体大鼠经静脉注射供体大鼠cd45rb+dc细胞1×106/0.2ml;d组（mdcs注射组）:受体大鼠经静脉注射供体大鼠成熟dc细胞1×106/0.2ml。用触诊法监测移植心脏的存活时间。分别在移植后的第1、3、5d将移植物中的淋巴细胞进行分离并提取rna,对microrna-182、microrna-183、microrna-7a、microrna-155、microrna-434、ll-2、lfn-γ、ll-4、ll-10的表达水平用定量rt-pcr进行测定。另外分别取受体血清,流式细胞技术测定cd4+foxp3+t淋巴细胞的比值。结果:同种异体心脏移植之后,cd45rb+dcs组和未成熟dcs组移植物存活时间延长明显,与对照组相比差异显着（p<0.05）,随着时间的推移,cd4+foxp3+t淋巴细胞比率呈现逐渐升高趋势,在术后第5d改变明显（p<0.05）。随着心脏移植后时间的推移,microrna-7a、microrna-182以及microrna-183水平逐渐升高,mir-434表达水平则逐渐降低,在移植后的不同时间点上均有统计学差异,但同一天各组间未见明显差别。第3、5dcd45rb+dcs组和imdcs组microrna-155表达增加,和对照组之间有统计学差异（p<0.05）。心脏移植后得第5d,ll-4水平在cd45rb+dcs组和未成熟dcs组中的表达均上升,ll-2和lfn-γ水平则呈现下降趋势,与对照组相比统计学差异显着（p<0.01）;同时il-10水平在cd45rb+dcs组升高明显,与对照相比有明显差异（p<0.01）。结论:cd45rb+dcs通过上调体内cd4+foxp3+调节性t细胞的数量,下调移植受体大鼠microrna-155的表达,增加移植物内淋巴细胞ll-10和ll-4水平,并降低lfn-γ和ll-2水平,从而显着延长移植心脏的存活时间。
二、同种异体骨髓间充质干细胞在大鼠心脏的迁移及分化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、同种异体骨髓间充质干细胞在大鼠心脏的迁移及分化（论文提纲范文）
（1）人羊膜间充质干细胞抑制同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用microRNA表达初步探究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞在心脏移植免疫耐受诱导中的重要作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）间充质干细胞在心脏移植免疫耐受诱导中的重要作用（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 入选标准 |
| 1.3 质量评估 |
| 2 结果Results |
| 2.1 间充质干细胞对免疫系统的影响 |
| 2.1.1 T细胞 |
| 2.1.2 树突状细胞 |
| 2.1.3 B细胞 |
| 2.1.4 巨噬细胞 |
| 2.1.5 微环境 |
| 2.1.6 体外共培养及细胞毒性T细胞 |
| 2.1.7 旁分泌(胞外囊泡) |
| 2.2 间充质干细胞移植改善心脏移植预后 |
| 2.3 心脏移植免疫耐受诱导的探索 |
| 2.3.1 心脏移植免疫耐受与免疫细胞凋亡 |
| 2.3.2 心脏移植免疫耐受与T细胞 |
| 2.3.3 阻断激活信号 |
| 2.3.4 心脏移植免疫耐受与树突状细胞 |
| 2.3.5 嵌合现象的诱导 |
| 2.3.6 儿童ABO血型不合的心脏移植 |
| 2.3.7 其他 |
| 3 总结与展望Summary and prospects |
（3）使用杂交移植物重建前交叉韧带的临床与基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 杂交移植物与自体移植物用于前交叉韧带重建在患者主观评价、膝关节稳定性与失败率方面的临床研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 杂交移植物与自体移植物在大鼠前交叉韧带损伤模型中的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 杂交移植物与自体移植物用于前交叉韧带重建在患者主观评价、膝关节稳定性与失败率方面的meta-分析研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 肌腱干细胞条件培养基对小鼠成纤维细胞的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 前交叉韧带移植物选择的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）microRNA-149/SDF-1轴刺激骨髓间充质干细胞成骨分化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨缺损 |
| 1.1.1 骨缺损 |
| 1.1.2 骨缺损的治疗 |
| 1.2 间充质干细胞 |
| 1.2.1 间充质干细胞的定义 |
| 1.2.2 间充质干细胞的发现 |
| 1.2.3 间充质干细胞的主要来源 |
| 1.2.4 间充质干细胞对骨缺损的治疗 |
| 1.3 microRNAs |
| 1.3.1 microRNAs的定义 |
| 1.3.2 microRNAs的作用 |
| 1.3.3 microRNAs在骨生物活动的作用 |
| 1.3.4 microRNAs对骨分化的调控 |
| 1.4 lncRNA |
| 1.4.1 lncRNA的定义 |
| 1.4.2 lncRNA的功能 |
| 1.5 SDF-1 |
| 1.5.1 SDF-1的定义 |
| 1.5.2 SDF的作用 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 microRNA-149/SDF-1 轴刺激骨髓间充质干细胞成骨分化的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物使用伦理说明 |
| 2.2.2 实验动物分组 |
| 2.2.3 大鼠成骨分化模型的建立 |
| 2.2.4 STRO-1的免疫组织化学染色检查 |
| 2.2.5 骨髓间充质干细胞的提取 |
| 2.2.6 间充质干细胞的分组、成骨分化和诱导 |
| 2.2.7 Von Kossa染色和茜素红S染色 |
| 2.2.8 ALP和 OCN蛋白水平的测定 |
| 2.2.9 双荧光素酶报告基因测定 |
| 2.2.10 RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP) |
| 2.2.11 亚硫酸氢盐测序PCR |
| 2.2.12 RT-qPCR检测mRNA的表达 |
| 2.2.13 Western blot分析 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 大鼠成骨分化模型的建立 |
| 2.3.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 |
| 2.3.3 SDF‐1是miR‐149 的直接靶基因 |
| 2.3.4 miR-149抑制骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 2.3.5 miR‐149 的甲基化水平在BMMSCs成骨分化过程中上调 |
| 2.3.6 miR‐149 通过SDF‐1/CXCR4 途径抑制MSC成骨分化 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 IncRNA-H19 通过microRNA-149/SDF-1 轴刺激骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 伦理声明 |
| 3.2.2 膜诱导成骨分化模型建立 |
| 3.2.3 BMMSCs的分离、培养及鉴定 |
| 3.2.4 细胞转染 |
| 3.2.5 Von Kossa染色和ARS染色 |
| 3.2.6 RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP) |
| 3.2.7 RT-qPCR检测miRNA的表达 |
| 3.2.8 测定ALP和 OCN |
| 3.2.9 流式细胞术 |
| 3.2.10 双荧光素酶报告基因测定 |
| 3.2.11 荧光原位杂交(FISH) |
| 3.2.12 Western blot分析 |
| 3.2.13 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 H19与miR-149竞争性结合 |
| 3.3.2 H19促进骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 3.3.3 H19通过下调miR-149促进骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 3.3.4 上调的H19 通过与miR-149 结合上调SDF-1,刺激骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）间充质干细胞在急性移植物抗宿主病和异体皮片移植排斥反应中对B细胞的免疫调节作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩写表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 小鼠骨髓MSC生物学特性鉴定 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MSC在小鼠aGVHD模型中对B细胞的影响的研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MSC在缺失B细胞的小鼠aGVHD模型中的作用 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 细胞膜表达CCR7的MSC生物学特性鉴定 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 静脉输注MSC-CCR7对大鼠异体皮片移植排斥反应的影响机制 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足之处 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 博士在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）苯甲酸钠调控DJ-1对创伤性脊髓损伤的神经保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DJ-1对大鼠t-SCI的神经保护作用研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.2.1 动物 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要器材 |
| 1.2.4 主要试剂配制 |
| 1.2.5 实验设计及分组 |
| 1.2.6 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 一般生理数据 |
| 1.3.2 脊髓显微结构的变化 |
| 1.3.3 DJ-1的表达变化 |
| 1.3.4 DJ-1在脊髓灰质神经元中的表达及变化 |
| 1.3.5 DJ-1 siRNA对DJ-1及凋亡的作用 |
| 1.3.6 NaB对DJ-1及凋亡的作用 |
| 1.3.7 NaB对SCWC的作用 |
| 1.3.8 NaB对EB渗出量的作用 |
| 1.3.9 NaB对BSCB相关蛋白的作用 |
| 1.3.10 NaB对大鼠运动功能的作用 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DJ-1减轻t-SCI后神经元凋亡的机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 动物 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要器材 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.2.5 实验设计及分组 |
| 2.2.6 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 一般生理数据 |
| 2.3.2 p-Akt的表达变化 |
| 2.3.3 DJ-1 siRNA对p-Akt的作用 |
| 2.3.4 NaB对p-Akt的作用 |
| 2.3.5 MK2206的作用 |
| 2.3.6 体外实验结果 |
| 2.3.7 流程图 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（7）低免疫排斥性的间充质干细胞及其外泌体在心肌梗死修复中的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞及其外泌体对心肌梗死的修复作用研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 低免疫排斥性的间充质干细胞的制备及其心梗修复效果的研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 间充质干细胞来源的外泌体通过MIR-24/BIM通路抑制心肌细胞凋亡 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述：外泌体在心肌梗死诊疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（8）心脏Telocytes协同心脏干细胞治疗缺血性心肌梗死及其机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词注释表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 心血管疾病的现状 |
| 1.2 心肌梗死 |
| 1.3 心肌梗死的治疗 |
| 1.4 细胞治疗 |
| 1.5 细胞外泌体(exosome)治疗 |
| 1.6 MicroRNA治疗 |
| 1.7 心脏Telocyte与心脏再生 |
| 1.8 本论文的主要研究内容 |
| 1.9 本论文的创新点 |
| 第二章 心脏Telocytes协同心脏干细胞对缺血性心肌梗死的疗效优于单独细胞移植 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 心脏Telocytes分泌外泌体对缺血性心肌梗死的疗效研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 心脏Telocytes外泌体内所含的miRNA-21-5p对缺血性心肌梗死的疗效研究. |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 细胞、外泌体及miRNA对缺血梗死心肌疗效的相互比较 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 心脏Telocytes分泌外泌体的蛋白组学研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.3 方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 老年心脏 Telocytes与年青心脏 Telocytes基因表达芯片的比较与分析 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料 |
| 7.3 方法 |
| 7.4 结果 |
| 7.5 讨论 |
| 第八章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 特别鸣谢 |
| 硕博士期间发表论文清单 |
| 致谢 |
（9）间充质干细胞介导TGF-β1减轻移植肝急性排斥反应（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 |
| —、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 间充质干细胞对免疫的调节作用 |
| 参考文献 |
| 间充质干细胞分泌物的治疗效果和不同培养方法诱导其分泌修饰的方法 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（10）干细胞调控CD45RB+调节性树突状细胞在同种异体心脏移植中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠BMSCs对DC细胞表型的影响及CD45RB~+ DCs免疫功能的检测 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分CD45RB~+DCs对T细胞功能影响的体外实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分CD45RB~+DCs细胞静脉输注诱导同种移植免疫耐受的实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表论文和科研情况 |
| 致谢 |
四、同种异体骨髓间充质干细胞在大鼠心脏的迁移及分化（论文参考文献）
- [1]人羊膜间充质干细胞抑制同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用microRNA表达初步探究[D]. 毛鑫. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]间充质干细胞在心脏移植免疫耐受诱导中的重要作用[J]. 毛鑫,余丽梅,王峰. 中国组织工程研究, 2021(13)
- [3]使用杂交移植物重建前交叉韧带的临床与基础研究[D]. 王弘德. 河北医科大学, 2020(01)
- [4]microRNA-149/SDF-1轴刺激骨髓间充质干细胞成骨分化的研究[D]. 李广杰. 兰州大学, 2020(01)
- [5]间充质干细胞在急性移植物抗宿主病和异体皮片移植排斥反应中对B细胞的免疫调节作用研究[D]. 芦笛. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [6]苯甲酸钠调控DJ-1对创伤性脊髓损伤的神经保护作用及机制研究[D]. 高连升. 浙江大学, 2019(03)
- [7]低免疫排斥性的间充质干细胞及其外泌体在心肌梗死修复中的机制研究[D]. 邵联波. 苏州大学, 2018(01)
- [8]心脏Telocytes协同心脏干细胞治疗缺血性心肌梗死及其机理的研究[D]. 廖肇福. 暨南大学, 2019
- [9]间充质干细胞介导TGF-β1减轻移植肝急性排斥反应[D]. 唐劲草. 南京医科大学, 2017(05)
- [10]干细胞调控CD45RB+调节性树突状细胞在同种异体心脏移植中的作用[D]. 华菲. 苏州大学, 2016(11)