一、角膜移植免疫中细胞因子的研究新进展（论文文献综述）
尹文惠[1]（2020）在《移植术后的角膜衰老对角膜移植免疫排斥的影响及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的:通过构建小鼠穿透性角膜移植模型探讨角膜植片细胞衰老对角膜移植免疫排斥反应的影响及机制。方法:1、小鼠角膜移植免疫排斥期间的细胞衰老表型分析。分别以BALB/C或C57BL/6小鼠为角膜供体,BALB/C小鼠为角膜受体构建穿透性角膜移植模型,分为正常组、同系角膜移植组和异系角膜移植组,于移植免疫排斥反应阶段收集角膜样本。通过衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal）染色明确角膜植片的细胞衰老表型,并借助角膜植片冰冻切片分析衰老细胞在角膜中的分布;使用Western Blot分析角膜植片中衰老相关蛋白p16、p21的表达水平。2、供体角膜衰老相关基因p16缺失对小鼠角膜移植免疫排斥反应的影响。分别将野生型和p16缺失型的C57BL/6小鼠作为角膜供体构建异系角膜移植模型,评价角膜供体细胞衰老对角膜移植免疫排斥反应的影响:通过裂隙灯观察角膜移植免疫排斥反应并记录角膜植片存活时间;通过免疫荧光实验评估不同组别角膜植片中炎性细胞的浸润情况。3、抗衰老药物ABT-263清除衰老细胞对小鼠角膜移植免疫排斥反应的影响。建立异系角膜移植组和异系移植并抗衰老药物Navitoclax（ABT-263）干预组,评估药物清除衰老细胞对角膜移植免疫排斥的影响:使用裂隙灯观察抗衰老药物对角膜移植免疫排斥的影响并记录植片存活时间;利用Real-Time PCR检测角膜植片中主要炎性细胞因子（白介素（interleukin,IL）-1β、IL-12、IL-17A、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α以及干扰素（interferon,IFN）-γ）的表达情况;同时借助SA-β-Gal染色以及Real-Time PCR等实验手段评估ABT-263清除角膜植片中衰老细胞的效果。4、细胞衰老对角膜植片以及虹膜-睫状体组织中抗原提呈细胞活化的影响。构建异系小鼠角膜移植模型并结合抗衰老药物ABT-263干预,通过Real-time PCR检测不同组小鼠角膜移植早期（移植术后10天）角膜植片以及虹膜组织中抗原递呈细胞活化的相关指标的表达水平（主要包括IL-1β、TNF-a炎性细胞因子以及CD80/86等共刺激分子）,初步确定细胞衰老对抗原递呈细胞活化的影响。结果:1、免疫排斥过程中,角膜植片中存在细胞衰老表型。与正常小鼠角膜相比,异系移植组和同系移植组角膜植片基质层和内皮层均存在细胞衰老,并且异系移植组的细胞衰老表型重于同系移植组;异系移植组中衰老相关蛋白p16、p21表达量明显高于同系移植组。说明角膜移植术后角膜植片出现了细胞衰老表型,并随免疫排斥反应进展而加重。2、供体角膜缺失衰老相关基因p16可延缓角膜移植免疫排斥反应。与野生型小鼠角膜供体移植相比,p16基因缺失的供体组角膜植片存活时间显着延长,CD45+炎性细胞的浸润明显减少,提示细胞衰老可促进角膜移植免疫排斥反应的发生。3、通过药物干预清除角膜细胞衰老可有效抑制角膜移植排斥反应的发生。相比于未干预组,抗衰老药物ABT-263干预治疗后,角膜移植免疫排斥反应明显减轻,主要表现为:角膜植片更透明,存活时间显着延长;角膜植片中促炎性细胞因子的表达水平降低。此外,我们进一步通过SA-β-Gal染色以及Real-Time PCR证明ABT-263可以减轻角膜植片的衰老表型。以上结果表明清除衰老细胞可有效减轻角膜移植免疫排斥反应。4、细胞衰老可影响角膜移植免疫排斥过程中抗原递呈细胞的活化。与未干预组相比,在移植术后10天左右,抗衰老药物ABT-263的干预治疗可明显下调角膜植片以及虹膜-睫状体组织中与抗原递呈细胞活化相关的炎性细胞因子以及共刺激分子的表达,提示细胞衰老参与了角膜移植免疫排斥过程中抗原递呈细胞的活化。结论:1、角膜移植免疫排斥过程中,角膜植片内皮层和基质层均出现细胞衰老表型;抑制或清除衰老细胞可明显延缓角膜移植免疫排斥反应。2、初步明确衰老细胞可通过刺激抗原递呈细胞的活化促进角膜移植免疫排斥反应。
项敏泓[2]（2019）在《p38介导结膜松驰症的细胞衰老及杞精明目汤的干预研究》文中提出目的:观察p38 MAPK信号通路介导的细胞衰老在结膜松弛症（conjunctivochalasis,CCH）发病中的作用,研究杞精明目汤对p38介导的CCH细胞衰老的保护作用,为CCH发病机制的探索及治疗提供一种新的思路。方法:1.培养CCH结膜成纤维细胞,通过RNA干扰技术构建p38干扰慢病毒载体转染原代分离的CCH成纤维细胞,并用q-PCR和Western blot检测p38α的表达,筛选有效的干扰片段。2.培养CCH和正常人的结膜成纤维细胞,分别用RNA干扰技术和p38抑制剂SB203580处理,分为五组（Control、CCH、CCH+si NC、CCH+siP38、CCH+SB203580）。采用CCK-8检测细胞增殖,β-gal染色检测细胞衰老,流式细胞术检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,分光光度计比色法检测超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活力,q-PCR及Western blot检测p38α、p53、p21、SMP30的表达。3.培养CCH和正常人的结膜成纤维细胞,分别用杞精明目汤颗粒剂和p38抑制剂SB203580处理,分为四组（Control、CCH、CCH+QJMM、CCH+SB203580）,采用CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞内ROS,分光光度计比色法检测SOD活力,q-PCR及Western blot检测p38α、p53、p21、SMP30的表达,并应用双荧光素酶报告基因检测杞精明目汤对p38启动子的影响。4.收集40例80眼ⅡⅢ级肝肾阴虚型CCH患者,随机分为杞精明目汤组和人工泪液组,分别采用杞精明目汤联合人工泪液和单纯人工泪液治疗,观察国际眼表疾病指数（OSDI）、泪膜破裂时间（BUT）、基础泪液分泌试验（SIT）,治疗3个月后比较临床治疗效果。对于CCH分级在Ⅲ级及以上,随访3个月及以上,有手术意愿的CCH患者切除松弛结膜组织,冰冻切片行β-gal染色观察。结果:1.RNA干扰后CCH结膜成纤维细胞中p38αmRNA和蛋白表达均显着下调,成功构建了含有靶向p38目的基因的siRNA慢病毒载体。2.β-gal染色显示CCH组结膜成纤维细胞衰老高于Control组（P=0.001）。CCK-8结果显示培养48小时后,CCH组及CCH+si NC组细胞OD值低于Control组,CCH+siP38组及CCH+SB203580组细胞OD值高于CCH组及CCH+si NC组（P均<0.05）。ROS含量CCH组及CCH+si NC组高于Control组,CCH+siP38组及CCH+SB203580组ROS含量均低于CCH组及CCH+si NC组,但高于Control组（P均<0.05）。SOD活力CCH组及CCH+si NC组均低于Control组,CCH+siP38组及CCH+SB203580组SOD活力均高于CCH组及CCH+si NC组（P均<0.01）。CCH组及CCH+si NC组p38α、p53、p21 mRNA表达较Control组上调,SMP30 mRNA表达下调（P均<0.01）;CCH+siP38组及CCH+SB203580组较CCH组及CCH+si NC组p38α、p53、p21 mRNA表达下调,SMP30 mRNA表达上调（P均<0.05）。p38α、p53、p21蛋白在CCH组及CCH+si NC组较Control组表达上调,SMP30蛋白表达下调（P均<0.01）;CCH+siP38组及CCH+SB203580组p38α、p53、p21蛋白较CCH组及CCH+si NC组表达均下调,SMP30蛋白表达上调（P均<0.01）。3.CCK-8结果显示培养24小时后,CCH组细胞OD值低于Control组（P<0.05）。48小时后CCH组细胞OD值低于Control组,CCH+QJMM组及CCH+SB203580组OD值高于CCH组（P均<0.01）。ROS含量CCH组高于Control组,CCH+QJMM组及CCH+SB203580组低于CCH组（P均<0.05）。SOD活力CCH组低于Control组,CCH+QJMM组及CCH+SB203580组高于CCH组（P均<0.01）。CCH组较Control组p38α、p53、p21 mRNA的表达上调,SMP30 mRNA的表达下调;CCH+QJMM组及CCH+SB203580组较CCH组p38α、p53、p21 mRNA的表达下调,SMP30 mRNA的表达上调（P均<0.05）。CCH组较Control组p38α、p-p38α、p53、p21蛋白表达上调,CCH+QJMM组及CCH+SB203580组较CCH组下调（P均<0.01）。SMP30蛋白CCH组较Control组表达下调,CCH+QJMM组及CCH+SB203580组较CCH组表达上调（P均<0.01）。双荧光素酶报告基因检测显示CCH+QJMM组较CCH组含p38启动子的荧光素酶活性降低（P<0.001）。4.临床研究:杞精明目汤组的OSDI评分、BUT、SIT显着优于人工泪液组。治疗3月后需手术治疗的CCH患者人工泪液组7例7眼,杞精明目汤组4例4眼,且杞精明目汤组衰老细胞染色阳性率低于人工泪液组（P=0.013）。结论:1.成功构建含有靶向p38目的基因的siRNA慢病毒载体,为后续研究提供了实验基础。2.结膜松弛症中出现氧化应激损伤,激活p38 MAPK信号通路及其下游的衰老相关因子,细胞增殖减少,导致细胞衰老。沉默或是抑制p38 MAPK信号通路可以下调p38 MAPK及其下游衰老相关因子的表达,缓解氧化应激损伤,促进细胞增殖,从而延缓细胞衰老。3.杞精明目汤可下调p38 MAPK及其下游的衰老相关因子的表达,下调p38MAPK启动子活性,减轻氧化应激损伤,增强结膜成纤维细胞的抗氧化能力,促进结膜成纤维细胞的增殖,从而治疗结膜松弛症。4.杞精明目汤联合治疗结膜松弛症在缓解眼部症状、改善泪膜、促进泪液分泌方面,较单纯人工泪液治疗更为有效。杞精明目汤联合治疗还可以减少结膜松弛症中出现的细胞衰老,可作为除手术治疗之外安全、有效的治疗方案。
宫玉波,刘勇,赵宏伟,许倩倩,郭惠玲[3]（2018）在《Foxp3,IDO在小鼠角膜移植免疫排斥反应的表达》文中进行了进一步梳理背景:移植免疫反应是导致角膜移植术后失败的主要原因,但其具体发病机制不明确。有研究报道,Foxp3和吲哚胺2,3-二氧化酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）与移植免疫有关。目的:研究Foxp3,IDO在小鼠角膜移植免疫排斥反应中的作用。方法:以C57BL/6小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体建立角膜移植实验模型。将30只BALB/c小鼠随机分为3组,正常组6只;角膜移植组12只;地塞米松治疗组12只。角膜移植组:给予生理盐水;地塞米松治疗组:给予地塞米松注射液10 mg/kg,分别于角膜移植术后0,2,4,6,8,10 d经腹腔注射给药。用裂隙灯观察移植排斥情况,免疫组织化学检测植片γ-干扰素表达,Real-time PCR检测植片内Foxp3 mRNA,IDO mRNA的表达。结果与结论:（1）地塞米松治疗组发生排斥反应时间（20.667±1.033）d,较角膜移植组（14.833±1.472）d明显延迟（P<0.05）;（2）角膜移植组术后第14天角膜植片内γ-干扰素及Foxp3 mRNA,IDO mRNA的表达较地塞米松治疗组明显增强（P<0.05）;（3）结果提示,γ-干扰素及Foxp3,IDO在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用,降低角膜植片γ-干扰素及Foxp3,IDO表达可能有助于诱导耐受。
王昕[4]（2018）在《IL-1β通过调控Th17细胞促进角膜移植免疫排斥反应》文中研究表明目的:研究白介素-1（interleukin-1β,IL-1β）在角膜移植免疫排斥反应中的作用,进一步探讨IL-1β参与角膜移植免疫排斥反应的机制。方法:（1）构建小鼠穿透性角膜移植模型,并随机分为正常对照组、同系移植组、异系移植组、异系移植并IL-1β中和性抗体处理组。在此基础上,通过裂隙灯观察IL-lβ中和性抗体对角膜移植免疫排斥反应的影响;并利用Real-time PCR和Western blot检测各组小鼠角膜植片中IL-lβ及其受体IL-1R1等的表达水平;免疫荧光分析IL-lβ受体IL-1R1的表达水平及其分布情况。（2）分别利用野生型小鼠和NLRP3缺陷小鼠构建穿透性角膜移植模型,并随机分为正常对照组、同系移植组和异系移植组。在此基础上,通过临床观察研究干预NLRP3炎症小体抑制IL-lβ成熟对角膜抑制免疫排斥反应的影响;并进一步利用Western Blot和免疫荧光技术分析角膜移植免疫排斥过程中NLRP3和IL-1β表达水平的变化;使用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测角膜植片中白介素-17（Interleukin-17,IL-17）和干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）的含量。此外,我们还利用NLRP3炎症小体抑制剂Glubide验证阻断NLRP3炎症小体活化对角膜移植免疫排斥反应的影响。（3）体外无菌分离小鼠骨髓,通过巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage-colony stimulating factor,M-SCF）诱导骨髓源巨 噬细胞（Bone marrow derived macrophages,BMDMs）在此基础上,行脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）刺激,并通过Western Blot分析不同组别内巨噬细胞中IL-1β表达水平的变化,ELISA检测各组细胞培养上清中IL-1β的含量。（4）无菌分离脾细胞,并将其分成空白对照组、IL-6+TGFβl处理组以及IL-6+TGFβl+IL-1β 处理组;同时利用 Anti-CD3（15μg/ml）和 anti-CD28（5μg/ml）刺激96h,通过流式细胞术检测不同组别细胞中Th17细胞的相对含量,并采用FLLSA检测不同组别细胞培养上清中IL-17的含量。（5）构建小鼠穿透性角膜移植模型,随机分为异系移植组、异系移植并IL-17抗体治疗组。在此基础上,通过临床观察评估IL-17中和性抗体对角膜移植免疫排斥反应的影响;通过苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）评估不同组别角膜植片的病理改变。结果:（1）与同系移植组相比较,异系移植组小鼠角膜植片中的IL-1β mRNA水平明显着增加;Western blot结果显示:活化形式的IL-1β在异系移植组中的水平明显高于同系移植组。同时,IL-1β受体IL-1R1的表达水平在角膜免疫排斥过程中也显着增强,且广泛表达于发生免疫排斥小鼠角膜植片的上皮层、基质层和内皮层。IL-1β中和实验表明IL-1β中和性抗体可显着延长角膜植片的存活时间。以上结果提示IL-1β可促进角膜移植免疫排斥反应的发生。（2）Western blot结果表明,发生免疫排斥反应的小鼠角膜植片中NLRP3的表达水平显着增加,且主要表达于角膜植片的上皮层、基质层以及内皮层。与对照组相比,利用Glubide抑制NLRP3炎症小体的活性可明显延长角膜植片的存活时间,并有效减轻角膜移植排斥反应。与野生型小鼠模型比较,NLRP3缺陷小鼠角膜植片存活时间明显延长;但向NLRP3缺陷小鼠回输IL-1β则可明显促进角膜移植免疫排斥反应的发生。通过ELISA检测发现,NLRP3缺陷小鼠角膜植片中IL-17的水平显着降低,而IFN-γ的水平则没有显着变化,提示NLRP3炎症小体可能通过影响Th17细胞免疫反应参与角膜移植免疫排斥反应。（3）通过BMDM模型发现,与野生型BMDM比较,NLRP3缺陷的BMDM分泌IL-1β的能力显着下降。通过体外共培养实验发现,与野生型BMDM培养上清处理组相比较,NLRP3缺陷BMDM培养上清刺激Th17细胞分化的能力显着下降;ELISA的结果显示,NLRP3缺陷BMDM培养上清诱导产生的Th17细胞分泌IL-17的能力也明显下降。上述结果表明IL-1β可促进Th17细胞免疫反应。（4）与对照组相比,IL-17中和性抗体可明显延长角膜植片存活时间;病理分析结果显示:IL-17中和性抗体可有效抑制角膜植片炎性细胞浸润。上述结果表明Th17细胞免疫反应参与角膜移植免疫排斥的病理过程。结论:（1）角膜移植免疫排斥过程中,角膜植片中IL-1β的表达水平显着增强,中和IL-1β可延长角膜植片存活时间。（2）角膜移植免疫排斥过程中,角膜植片中的NLRP3表达水平明升高,通过干预NLRP3炎症小体抑制IL-1β的成熟可有效抑制角膜移植免疫排斥反应。（3）IL-1β通过诱导Th17细胞参与角膜移植免疫排斥反应,中和IL-17可延长角膜植片存活时间。
伍志琴[5]（2017）在《IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响及其机制》文中认为视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）是一种眼科非常常见的病理过程,与多种疾病有关,可以导致视网膜神经节细胞（RGCs）变性死亡、视网膜结构紊乱和功能下降,最终导致不可逆的视力损伤,预后较差。RIRI的发病机制非常复杂,目前尚未完全阐明,大量的研究表明RIRI与多种因素综合作用有关,包括氧自由基生成、细胞内钙离子超载、微血管损伤、微循环障碍等。另外,炎症因子介导的免疫炎性反应及白细胞浸润也备受关注。RIR损伤与炎症因子之间有着密切的关系,在RIR损伤的亚急性期,炎症相关基因被激活,可以诱导多种炎性细胞因子生成,如TNF-α、IL-1、IL-6等,同时有大量的细胞因子可以起到保护作用。白细胞介素-33（IL-33）是Schmitz等在2005年新发现的一个多功能细胞因子,可以通过与其特异性受体ST2结合,参与调节机体的炎症反应、感染性疾病、变态性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病及肿瘤等多种疾病的发生发展过程。IL-33/ST2信号途径在炎症反应中起着重要的调节作用,可激活下游的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及核因子-κB（NF-κB）等信号通路,引起机体一系列炎性反应。也有研究表明,IL-33是一把“双刃剑”,在不同的疾病类型及不同的免疫环境中,IL-33发挥的作用大相径庭,既可能是促炎作用又有可能是保护作用。目前已证实,IL-33在多种组织与器官的缺血再灌注损伤中扮演着保护因子的角色,发生机制可能与促进Thl/Th2平衡向Th2偏移、抑制IL-1β、TNF-α等炎性因子释放、抑制细胞凋亡等有关。但IL-33在RIRI中的表达变化及作用目前尚未见相关研究。近些年来随着对视网膜缺血性疾病的研究日益广泛和深入,人们发现炎症和细胞凋亡与RIRI的关系极为密切。在RIRI中,炎症介质的释放和白细胞浸润放大了其炎性损伤,IL-1β、TNF-α是最重要的促炎因子。细胞凋亡是视网膜再灌注后损伤的主要形式之一,可以导致持续的组织损伤及功能丧失,尤其是RGCs。凋亡是一种受到多种基因表达和蛋白调控的特殊的细胞死亡过程。Bcl蛋白家族在细胞凋亡过程中具有重要的调节作用,其中Bcl-2是最重要的抗凋亡蛋白,而Bax蛋白则具有促凋亡的作用。NF-κB是一个多功能核转录因子,激活可导致相关炎症因子的表达上升,并且与细胞凋亡的关系密切。有研究显示NF-κB的激活可能介导RGCs的凋亡,其与RIRI也有着密切的关系。基质金属蛋白酶9（MMP-9）可以降解细胞外基质,破坏血-视网膜屏障,促进视网膜水肿的发生,同样参与了 RIRI后的炎性反应。已有大量研究证实,在RIRI中,通过干扰炎症反应及凋亡通路可以达到保护缺血性视网膜神经细胞的目的。因此,本研究通过建立大鼠RIRI模型,探讨大鼠RIRI过程中IL-33的动态表达与分布,初步揭示IL-33在RIRI中可能存在的意义,但是其发挥促炎作用还是抑炎作用尚不清楚。在缺血前1h采取玻璃体腔内注射外源性的重组IL-33进行预处理的方法,观察外源性IL-33对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响。通过对视网膜功能、组织病理、炎性因子及凋亡蛋白的观察,对IL-33缓解大鼠视网膜缺血再灌注损伤的可能机制进行初步探讨,为治疗视网膜缺血再灌注损伤提供新的理论依据。本课题包括以下三个部分:第一部分大鼠视网膜缺血再灌注损伤中IL-33的动态表达及意义目的通过建立SD大鼠RIRI模型,检测大鼠视网膜组织中IL-33的动态表达及定位,探讨IL-33在RIRI中的可能作用。方法将60只SD大鼠利用随机数字法随机分为正常对照组（NCG）和模型组（MG）,RIRI模型采用前房灌注生理盐水升高眼内压的方法,其中MG组再按缺血再灌注后不同时间点分为6h、12h、24h、72h、144h组,每组10只大鼠。行苏木精-伊红（H-E）染色观察各时间点视网膜的组织结构;免疫组织化学方法检测不同时间点IL-33蛋白在视网膜上的动态表达及定位;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各时间点视网膜组织中IL-33以及IL-1β、TNF-α的表达水平和变化规律,并分析几种细胞因子之间的相关性。结果成功建立了 RIRI模型。HE染色可见NCG组视网膜各层结构与层次清楚,排列整齐,极少数炎性细胞浸润,MG组不同时间点的视网膜组织均出现不同程度的组织水肿,细胞排列疏松,结构较为紊乱,神经纤维层及内丛状层尤其明显,并伴有较多炎性细胞浸润聚集;免疫组织化学染色显示IL-33在NCG组视网膜即有低度表达,MG组中的表达明显增强,主要表达于视网膜神经节细胞层和内核层,在细胞核和细胞浆中均有表达;ELISA结果显示6h、12h、24h、72h、144h视网膜组织中IL-33的表达水平较NCG组均明显升高,差异具有显着统计学意义（P<0.01）,24h达高峰,同时IL-33表达的变化水平与IL-1β、TNF-α的表达水平呈正相关（r=0.845、0.895,P=0.034、0.016）。结论IL-33在大鼠RIRI视网膜组织中的表达明显增强,并且与促炎因子IL-1β、TNF-α有着近似的变化规律,提示IL-33有可能在视网膜缺血再灌注损伤后的炎症反应中起着重要的作用。第二部分IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜功能和结构的影响目的观察IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜功能和结构的影响。方法采用随机数字法将60只SD大鼠随机分为4组,每组15只:（1）正常对照组（NCG组）;（2）单纯缺血再灌注组（MG组）;（3）IL-33预处理组（IL-33组）:于造模前1h使用微量注射器玻璃体腔内注射重组IL-33 2μg（5μl）;（4）PBS对照组（PBS组）:于造模前1h玻璃体腔内注入等量的PBS溶液（5μl）。每只大鼠取右眼进行造模,再灌注24h后行以下检测:（1）视网膜电图（ERG）检测;（2）HE病理切片染色光镜下观察各组视网膜组织结构变化、炎性细胞浸润情况、视网膜各层厚度及视网膜神经节细胞数量等;（3）核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口标记（Tunel）法检测视网膜各层细胞凋亡情况。结果ERG结果显示,与NCG组相比,MG组b波振幅明显降低（t=5.765,P=0.000）,说明缺血再灌注可以明显损伤视网膜内层细胞的生理功能,而IL-33组b波振幅显着高于MG组及PBS组（t=2.420、3.024,P=0.022、0.005）,且b波比值与MG组及PBS组比较差异也有统计学意义（t=9.144、9.597,P=0.000、0.000）。通过HE染色可发现,IL-33组视网膜水肿较MG组及PBS组减轻,细胞排列也较为整齐,少许炎性细胞浸润,与MG及PBS组相比差异有统计学意义（t=3.697、4.715,P=0.0017、0.0002）,视网膜神经节细胞计数与MG及PBS组相比差异有统计学意义（t=2.807、3.188,P=0.012、0.005）。Tunel法证实:IL-33预处理组中,凋亡细胞呈低度阳性表达,凋亡指数与MG组及PBS组比较明显降低,差异有统计学意义（t=4.560、5.225,P=0.0002、0.0001）。结论IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜的功能及组织结构均具有保护作用,并抑制炎性细胞浸润及视网膜细胞凋亡。第三部分IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤作用机制的初步探讨目的初步探讨IL-33预处理在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中对视网膜起保护作用的可能机制,为RIR损伤提供新的临床治疗方法及理论基础。方法采用随机数字法将100只SD大鼠随机分为4组,每组25只:（1）正常对照组（NCG组）;（2）单纯缺血再灌注组（MG组）;（3）IL-33预处理组（IL-33组）:于造模前1h使用微量注射器玻璃体腔内注射重组IL-33 2μg（5μ1）;（4）PBS对照组（PBS组）:于造模前1h玻璃体腔内注入等量的PBS溶液（5μl）。再灌注24h后行:（1）免疫组织化学方法检测视网膜组织Bcl-2及Bax表达变化;（2）Western-blot检测视网膜组织中Bcl-2、Bax及NF-κB活化 P65（p-P65）的表达;（3）Real-time PCR 检测了 Bcl-2、Bax 及 MMP-9 的mRNA的表达;（4）提取视网膜组织,ELISA检测IL-1β、TNF-α的表达变化;（5）采用明胶酶谱法检测MMP-9的活性。结果免疫组织化学方法证实IL-33预处理后,Bcl-2表达水平均高于MG组和PBS组（t=2.334、2.388,P=0.0479、0.0440）,而Bax的表达水平明显低于 MG 组和 PBS 组（t=4.794、5.190,P=0.0014、0.0008）。Western blot 显示 IL-33预处理后,Bcl-2的表达水平较MG组及PBS组升高（t=3.339、2.686,P=0.0102、0.0277）,而 Bax 表达水平较型组及 PBS 组降低（t=4.010、4.406,P=0.0039、0.0023）,同时发现IL-33组NF-κB p65的表达水平低于MG组及PBS组（t=3.404、3.721,P=0.0093、0.0059）。Real-time PCR 提示,IL-33 组 Bax mRNA 的表达低于 MG 及 PBS 组（t=5.911、5.793,P=0.0004、0.0004）,而 Bcl-2 mRNA 的表达高于 MG 及 PBS 组（t=9.195、9.887,P=0.000、0.000）,同时 IL-33 组 MMP-9 mRNA 的表达水平较 MG 组及 PBS 组下降（t=5.175、6.152,P=0.0008、0.0003）。明胶酶谱法显示IL-33组MMP-9的活性较MG及PBS组明显降低（t=5.781、7.023,P=0.0004、0.0001）。ELISA 检测 IL-33 组中 IL-1β、TNF-α的含量较 MG组明显降低（t=10.349、7.200,P=0.000、0.0001）。结论IL-33预处理可以提高视网膜组织中Bcl-2的表达,抑制Bax的表达,阻止视网膜细胞凋亡;抑制NF-κB p65活化,抑制TNF-α,IL-1β等炎性因子的释放,并降低MMP-9的表达和活性。这些结果表明,IL-33可以通过减轻炎症反应和抑制细胞凋亡来减轻视网膜缺血再灌注损伤。本课题第一部分通过建立SD大鼠RIRI模型,首次观察了 IL-33这一新发现的多功能细胞因子在大鼠RIRI中的动态表达变化,结果提示IL-33在RIRI中表达增强,24h达高峰,并与促炎因子IL-1β、TNF-α具有近似的变化规律,提示IL-33有可能在视网膜缺血再灌注损伤后的炎症反应中起着重要的作用,参与了RIRI的病理损伤过程。IL-33是一种“预警分子”,在机体受到炎性因子和物理化学因素的刺激时,能由受损或坏死的上皮及内皮细胞分泌到细胞外。但IL-33在RIRI病理过程中究竟起着促炎还是抑炎的作用尚未明了,因此本课题第二部分采取玻璃体腔内注射外源性的重组IL-33的方法,在建模前对SD大鼠进行预处理,结果显示IL-33可以保护RIR损伤后视网膜的功能及组织结构,抑制炎性细胞浸润,减少视网膜细胞的凋亡。第三部分进一步初步探索其可能机制,发现IL-33预处理后,可以减少炎性因子释放,并调节相关凋亡蛋白的表达,降低视网膜神经元细胞的凋亡。因此,IL-33在大鼠RIRI模型中,很有可能是一种抑炎因子及抑制凋亡的因子,与促炎因子共同释放参与了 RIRI的发生发展过程,并且与促炎因子之间存在一个动态的相互平衡的关系。但IL-33及IL-33/ST2在视网膜缺血再灌注损伤中的具体传导通路有待进一步研究。
易锐文[6]（2017）在《RelA修饰的树突状细胞诱导大鼠角膜移植免疫耐受的实验研究》文中指出研究背景角膜移植手术是目前治疗角膜盲最主要、最有效的复明手段,但术后发生免疫排斥反应仍然是导致移植失败的最主要原因。虽然免疫抑制剂可以抑制免疫排斥反应,但价格昂贵且毒副作用大,限制了它的长期使用。因此近年来对角膜移植免疫排斥反应的研究方向主要集中在诱导受体产生针对移植角膜的特异性免疫耐受。已知树突状细胞（dendritic cells,DC）具有诱导移植免疫耐受的作用,同时研究表明,核因子-κB（NF-κB）与DC发育成熟及抗原呈递功能的关键性调控基因的转录密切相关,p50/RelA是NF-κB最常见的二聚体,是其发挥生物学功能的最主要形式。因此,本研究欲通过低表达RelA基因从而下调NF-κB的转录活性,阻断DC的成熟,并经尾静脉注射该DC回输给受体,通过建立大鼠同种异体角膜移植模型,观察其在角膜移植免疫反应中的作用,以期为角膜移植免疫耐受提供新的理论和实验依据。目的探讨低表达RelA基因的树突状细胞在大鼠角膜移植免疫反应中的作用。方法（1）应用GM-CSF和IL-4体外培养、诱导分化供体大鼠骨髓源性DC,结合细胞形态、表型及功能加以鉴定。（2）应用高效抑制RelA表达的shRNA序列,行慢病毒包装并感染未成熟DC（命名为RelA-DC）,同时设立阴性对照病毒感染DC组（命名为SiNC-DC）及未感染慢病毒DC组（命名为Control-DC）,分别给予1μg/ml的脂多糖刺激,利用RT-qPCR、Western Blot检测DC中RelA基因表达;流式细胞仪分析DC表型;ELISA检测DC上清IL-12和IFN-γ含量;MLR检测DC刺激T淋巴细胞增殖的能力。（3）以SD大鼠为供体、Wistar大鼠为受体,建立大鼠同种异体角膜移植模型60例,随机分成PBS组、mDC组、imDC组和RelA-DC组（n=15）,分别于移植前7天经尾静脉注射1ml PBS、mDC（5×106个）、imDC（5×106个）和 RelA-DC（5×106个）;术后观察角膜植片的存活时间并评分;第14天取角膜植片行HE切片观察、通过RT-qPCR检测Th1型细胞因子（IL-2、IFN-γ）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）的mRNA表达水平,取脾脏通过流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg、CD4+FoxP3+Treg的阳性表达率及通过MLR观察受体脾脏T细胞对供体抗原刺激的反应能力。结果（1）经形态学、表型和功能学鉴定,证实所培养细胞为DC。（2）RelA-DC的RelA基因转录水平和蛋白表达水平明显低于SiNC-DC、Control-DC（P<0.01）;其表面分子（MHC Ⅱ、CD80、CD86）的表达水平、刺激 T淋巴细胞增殖能力及上清液细胞因子IL-12、IFN-y水平亦低于SiNC-DC、Control-DC（P<0.05）。（3）RelA-DC组大鼠受体脾脏T细胞对供体抗原刺激的反应能力、Th1型细胞因子水平低于PBS组,mDC组和imDC组（P<0.05）,而角膜植片的存活时间、Th2型细胞因子水平、CD4+CD25+Treg及CD4+FoxP3+Treg阳性表达率高于PBS组,mDC组和imDC组（P<0.05）。结论输注低表达RelA基因的DC能抑制大鼠角膜移植术后免疫排斥反应,明显延长角膜植片的存活时间,可能主要通过抑制T细胞增殖反应、诱导Th1/Th2偏移以及CD4+CD25+Treg和CD4+FoxP3+Treg的扩增参与免疫耐受的形成。
王启明,赵心悦,王智,宋蔚[7]（2016）在《未成熟树突状细胞诱导辅助型T细胞偏移抑制大鼠高危角膜移植排斥反应的研究》文中研究表明目的探讨未成熟树突状细胞（immatuere dendritic cell,im DC）诱导辅助型T细胞偏移在大鼠高危角膜移植排斥反应的的抑制作用及其机制。方法本研究im DC来源于小骨骨髓,受体选择SD大鼠48只,供体选择Wistar大鼠30只,采取碱烧伤的方式建立同种异体高危角膜移植模型。随机将受体SD大鼠分为成熟树突状细胞（matuere dendritic cell,m DC）组、im DC组及对照组,每组均为16只。m DC组和im DC组:术前7 d将体外培养的供体骨髓来源的m DC或im DC经尾静脉注射,且细胞悬浮于0.1 m L的体外培养液中;对照组:术前7 d将0.1 m L体外培养液经尾静脉注射。术后每天对大鼠角膜植皮进行裂隙灯检查,对各组大鼠角膜植皮存活情况进行准确评估;分别于术后3 d、7 d、14 d每组各将入组的4只大鼠处死并取角膜植皮组织进行HE染色,对各组大鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞表面的Scurfin蛋白表达进行Western blot检测分析。结果 im DC组角膜植片存活时间为（18.67±2.46）d,均较m DC组（6.78±0.56）d、对照组（9.28±1.24）d明显延长,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;im DC组角膜新生血管评分为（4.54±1.02）分,低于m DC组（8.67±2.11）分、对照组（14.87±3.24）分,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;im DC组术后3 d、7 d、14 d Scurfin蛋白表达水平分别为2.16±0.74、2.35±0.83、2.28±0.76,均高于m DC组（1.42±0.17、1.56±0.42、1.48±0.12）及对照组（1.39±0.21、1.42±0.26、1.69±0.28）,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论 im DC可抑制角膜移植免疫排斥反应发生,而诱导CD4+CD25+调节性T细胞的产生,进而促进免疫耐受的形成。
周琨[8]（2014）在《CCR7基因修饰未成熟树突状细胞诱导大鼠高危角膜移植免疫耐受的研究》文中进行了进一步梳理目的：体外培养和诱导供体大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（immature dendritic cell，imDC），使用趋化因子受体7（chemokine receptor7，CCR7）基因重组腺病毒体外转染imDC，研究其对大鼠同种异体高危角膜移植免疫排斥反应的影响，探讨其诱导免疫耐受的机制。方法：通过联合应用重组大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colonystimulating factor，GM-CSF）和白细胞介素（Interleukin，IL）-4体外培养、诱导、扩增大量的imDC，通过细胞形态及表型对其加以鉴定；将携带大鼠CCR7基因的重组腺病毒通过增强离心法转染imDC，对转染后的imDC再次进行形态及表型鉴定，并通过细胞免疫荧光检测CCR7的表达；以60只SD大鼠作为受体，30只Wistar大鼠作为供体，通过碱烧伤建立高危角膜移植模型；采用随机数字表法将受体SD大鼠分为空白对照组、未修饰imDC组（imDC组）、 imDC+空载体腺病毒组（imDC+Ad组）和imDC+CCR7腺病毒组（imDC+Ad-CCR7组），每组各15只；各组受体术前7d和术后3d分别经尾静脉注入PBS液、供体来源的未修饰imDC、空载体腺病毒转染后的imDC和携带CCR7基因的腺病毒转染后的imDC（1×107个/只，细胞悬浮于0.1ml PBS液中，空白对照组只注入等量PBS液）；术后每日在裂隙灯下观察角膜植片的存活情况并评分，术后14d每组随机处死6只受体大鼠，取角膜植片行HE切片观察以及通过RT-PCR检测Th1型细胞因子IL-2、干扰素-（γinterferonγ，IFN-γ）和Th2型细胞因子IL-4、IL-10的mRNA表达水平。结果：培养的imDC经过倒置相差显微镜及扫描电镜的形态学观察、流式细胞仪进行的免疫学表型检测，可证实为实验所需的imDC；细胞免疫荧光显示imDC不表达CCR7，imDC经空载体腺病毒转染后不表达CCR7,经CCR7腺病毒转染后CCR7表达增加；角膜移植术后，imDC+Ad-CCR7组大鼠角膜植片的混浊、水肿及新生血管程度评分较其他组均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；角膜植片平均存活时间（MST）：imDC+Ad-CCR7组较对照组、imDC组和imDC+Ad组显着延长，差异有统计学意义（P<0.05）；角膜HE切片显示，imDC+Ad-CCR7组植片轻度水肿、基质层板层纤维排列有序，imDC组和imDC+Ad组呈不同程度水肿，基质层板层纤维排列轻度紊乱、有少量的炎性细胞；空白对照组的植片高度水肿、角膜基质板层纤维紊乱，出现大量炎性细胞和新生血管；RT-PCR显示：imDC+Ad-CCR7组Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2mRNA的表达较对照组、imDC组和imDC+Ad组明显降低；Th2型细胞因子IL-4、IL-10mRNA的表达明显升高，差异有统计学意义（均为P<0.05）。结论：通过腺病毒增强离心法转染imDC可使CCR7基因有效转入imDC并表达CCR7蛋白；通过静脉输注供体骨髓来源的经CCR7基因修饰的imDC可以有效抑制高危角膜移植免疫排斥反应，诱导免疫耐受，延长植片的存活时间；经CCR7基因修饰的imDC可能主要通过诱导Th1/Th2偏移参与诱导高危角膜移植免疫耐受。
蔡涛[9]（2009）在《角膜移植免疫排斥反应的诱发因素及免疫抑制药物治疗》文中指出目的:探讨角膜免疫排斥反应的诱发因素,比较不同免疫抑制药物的治疗作用。方法:以角膜移植,免疫排斥,实验,细胞因子,药物为检索词,检索中国期刊全文数据库（1999-01/2009-06）,文献检索语种限制为中文。以角膜植片存活时间评价指标。纳入角膜移植免疫排斥反应的动物实验和临床研究,排除角膜移植以外治疗角膜病的其他方法。结果:计算机初检得到570篇文献,根据纳入排除标准,对角膜免疫排斥反应的动物实验和药物治疗研究进行分析。当前用于防治角膜移植免疫排斥反应的治疗药物主要有糖皮质激素及环孢素等,然而长期应用这些药物会产生严重的并发症。白细胞介素1受体拮抗剂可以通过多种机制抑制角膜排斥反应,它可代替环孢素A发挥更大的作用,并避免环孢素A带来的不良反应,而使角膜植片的存活时间延长。雷帕霉素是一种疗效好、低毒、无肾毒性及神经毒性的新型免疫抑制剂,在不同种类的器官移植动物模型上显示出显着的抗排斥反应活性,现已将其作为器官移植抗排斥作用新药正在进行Ⅲ期临床试验。他克莫司药物缓释系统能够长时间维持房水内的他克莫司药物浓度,抑制角膜植片内白细胞介素2受体α、单核细胞趋化蛋白1、Fas及FasL mRNA的表达,可长期有效地抑制高危角膜移植后免疫排斥反应的发生。结论:了解角膜移植排斥反应的诱发因素、促进因素及发生发展机制能够在移植前和移植后有效地预防并减轻排斥反应的发生,提高角膜移植反应的成功率。
王欣[10]（2009）在《CD4+CD25+与CD8+CD103+调节性T细胞在小鼠角膜移植中的效应研究》文中研究说明免疫排斥反应仍然是目前造成同种异体角膜移植手术失败的最主要原因。高效系统免疫抑制剂的发现及其联合应用使临床组织/器官移植的急性排斥反应大大降低,移植物的存活时间明显延长。但明显的毒副作用（如对重要脏器的损伤、降低抗肿瘤及抗感染免疫力等）及对治疗慢性排斥反应效果较差等问题,均限制了免疫抑制剂的临床应用。因此,相关学者尝试通过诱导移植免疫耐受来避免免疫抑制剂的长期应用及克服移植免疫排斥反应。目前国内外许多研究均证实,前房相关免疫偏离（chamber associated immune deviation,ACAID）与角膜植片的存活息息相关。近几年的研究发现,在外周免疫赦免和诱导ACAID的过程中,CD4+CD25+和CD8+CD103+T淋巴细胞起着相当重要的作用,它们作为调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）,参与抑制迟发性超敏反应（delayed-type hypersensitivity,DTH）和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocyte,CTL）的活动。目前对于调节性T细胞在诱导ACAID过程中作用的研究主要集中在葡萄膜炎方面,在角膜移植领域的研究甚少。本研究拟对参与ACAID的调节性T细胞在同种异基因角膜移植术中的效应进行研究。研究分为两部分:第一部分拟从小鼠角膜移植模型入手,了解CD4+CD25+T淋巴细胞与CD8+CD103+T淋巴细胞及其下游细胞因子在小鼠同基因与异基因角膜移植中的作用与表达变化情况;第二部分拟通过不同品系小鼠的异基因角膜移植模型,了解CD4+CD25+T淋巴细胞与CD8+CD103+T淋巴细胞及其下游细胞因子在不同品系小鼠角膜移植免疫排斥中的效应以及表达变化情况是否相似,以进一步验证CD4+CD25+T淋巴细胞与CD8+CD103+T淋巴细胞在角膜移植与免疫赦免中的效应。第一部分CD4+CD25+与CD8+CD103+调节性T细胞在小鼠同基因与异基因角膜移植中的效应研究目的:研究CD4+CD25+和CD8+CD103+调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）在小鼠同基因与异基因角膜移植中的表达变化及其下游细胞因子的含量改变。方法:实验组以BALB/c（H-2d）小鼠为受体、C3H/He（H-2k）小鼠为供体,建立同种异基因角膜移植模型;对照组受体及供体均为BALB/c小鼠,观察术后植片的存活率、排斥反应时间;组织病理学检查术后3天、7天、4周及8周各时间点角膜植片中炎症细胞浸润与角膜新生血管生成;流式细胞仪检测术前、术后3天、7天、4周及8周各时间点受体外周血和脾脏中CD4+CD25+Treg及CD103+CD8+Treg的表达变化;同时ELISA检测血清与房水中IL-10、IL-4、IFN-γ及IL-1β的表达变化。结果:实验组角膜植片免疫排斥发生时间为7天～4周,平均存活时间为（14.79±1.02）天,对照组植片术后保持透明,观察期（8周）内未发生排斥反应,存活时间显着长于实验组（x2=46.934,P=0.000）差异有统计学意义。流式细胞仪检测显示对照组外周血CD4+CD25+Treg术后各时间点的表达分别为（3.36±0.29）%、（4.09±0.44）%、（5.44±0.35）%、（5.73±0.53）%,显着高于实验组的（2.50±0.39）%、（3.24±0.25）%、（4.20±0.45）%、（4.18±0.14）%,（t=3.828、2.898、3.780、4.892,P均＜0.05）差异有统计学意义,两组脾脏中CD4+CD25+Treg的表达上调先于外周血;术后各时间点实验组外周血内CD8+CD103+Treg的表达分别为（2.20±0.33）%、（2.79±0.57）%、（4.55±1.03）%、（4.31±0.07）%,显着高于对照组的（0.73±0.12）%、（1.10±0.19）%、（1.43±0.14）%、（2.10±0.14）%,（t=7.133、4.876、5.196、19.96,P均＜0.05）差异有统计学意义,两组脾脏CD8+CD103+Treg的表达上调先于外周血。实验组术后各时间点血清内IL-10与IL-4水平均显着低于对照组（t=3.203、3.141、3.012、2.869与2.340、6.681、8.839、8.574,P=0.011、0.012、0.013、0.019与0.053、0.000、0.000、0.000）差异有统计学意义;实验组术后血清内IFN-γ与IL-1β含量上调,各时间点的表达水平均高于对照组,（t=3.508、3.265、4.402、5.539与3.630、5.796、1.728、0.660,P=0.006、0.011、0.002、0.000与0.005、0.000、0.115、0.524）,除术后4周、8周的IL-1β,余差异有统计学意义。房水中各细胞因子的表达改变与血清中变化相似。结论:CD4+CD25+Treg表达上调并伴随血清与房水中IL-10、IL-4表达上调,对于角膜植片的存活具有保护意义,而CD8+CD103+Treg的表达上调伴随IFN-γ、IL-1β的含量增加,则参与异基因角膜移植免疫排斥反应的过程。第二部分CD4+CD25+与CD8+CD103+调节性T细胞在不同品系小鼠异基因角膜移植中的效应研究目的:研究CD4+CD25+和CD8+CD103+调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）在不同品系小鼠异基因角膜移植免疫排斥中的表达变化及其下游细胞因子的含量改变。方法:实验A组以C57BL/6（H-2b）小鼠为受体,BALB/c（H-2d）小鼠为供体;实验B组以C3H/He（H-2k）小鼠为受体,C57BL/6（H-2b）小鼠为为供体;实验C组以BALB/c（H-2d）小鼠为受体、C3H/He（H-2k）小鼠为供体,建立同种异基因角膜移植模型。观察术后植片的存活率、免疫排斥反应时间;组织病理学检查术后3天、7天、4周及8周各时间点角膜植片中炎症细胞浸润与角膜新生血管生成;流式细胞仪检测术前、术后3天、7天、4周及8周各时间点受体外周血和脾脏中CD4+CD25+Treg及CD103+CD8+Treg的表达变化;同时ELISA检测血清中IL-10及IFN-γ的表达变化。结果:术后角膜植片免疫排斥发生时间分别为:实验A组C57BL/6受体小鼠7天～21天,平均存活（12.38±0.81）天;实验B组C3H/He受体小鼠7天～24天,平均存活（13.63±0.91）天;实验C组BALB/c受体小鼠7天～28天,平均存活（14.79±1.02）天,三组间植片存活时间差异无统计学意义（x2=3.668,P=0.055）。流式细胞仪检测显示:实验A组外周血CD4+CD25+Treg术前与术后各时间点的表达分别为（1.59±0.66）%、（1.22±0.33）%、（2.39±0.53）%、（1.37±0.28）%、（1.82±0.22）%,低于实验B组的（3.03±0.82）%、（4.62±0.12）%、（2.70±0.16）%、（5.05±0.84）%、（4.64±0.51）%,与实验C组的（3.60±0.99）%、（2.50±0.39）%、（3.24±0.25）%、（4.20±0.45）%、（4.18±0.14）%,三组表达水平的差异有统计学意义（P分别=0.025、0.005、0.388、0.000、0.000）,三组脾脏中CD4+CD25+Treg的表达上调先于外周血,但三组表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）;实验A组与实验B组的外周血CD8+CD103+Treg表达上调早于实验C组,同时,各组的脾脏CD8+CD103+Treg表达上调先于外周血,但三组表达水平相似,差异无统计学意义（P＞0.05）。各组术后各时间点血清内IL-10水平均较术前显着下调,三组个别时间点的表达存在差异（P=0.025、0.001、0.009、0.484、0.750）;各组术后血清内IFN-γ含量不同程度上调,三组个别时间点的表达水平组间存在差异（P=0.097、0.029、0.063、0.539、0.012）。结论:异基因角膜移植术后外周血与脾脏CD4+CD25+Treg低水平表达、血清与房水中抗炎因子IL-10含量显着减少影响植片存活时间,CD8+CD103+Treg的表达伴随IFN-γ的含量增加,共同参与了异基因角膜移植免疫排斥反应的过程。不同品系的小鼠异基因角膜移植植片存活时间相似,Treg与细胞因子的表达水平存在一定的品系差异。
二、角膜移植免疫中细胞因子的研究新进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、角膜移植免疫中细胞因子的研究新进展（论文提纲范文）
（1）移植术后的角膜衰老对角膜移植免疫排斥的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验器械 |
| 1.3 实验仪器与设备 |
| 1.4 实验试剂与耗材 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 构建小鼠穿透性角膜移植模型 |
| 2.2 WESTERN BLOT检测角膜样品蛋白表达 |
| 2.3 提取角膜、虹膜组织RNA及Real-timePCR检测 |
| 2.4 免疫荧光染色检测角膜组织炎性细胞 |
| 2.5 β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老表型（CST试剂盒：#9860） |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1、免疫排斥过程中,角膜植片存在明显的衰老表型 |
| 2、角膜供体p16缺失可缓解角膜移植免疫排斥反应 |
| 3、通过药物干预角膜细胞衰老可有效抑制角膜移植排斥反应的发生 |
| 4、ABT-263干预可抑制早期与抗原递呈细胞活化相关细胞因子的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）p38介导结膜松驰症的细胞衰老及杞精明目汤的干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 RNA干扰技术构建p38α干扰慢病毒载体 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 溶液配制 |
| 1.1.3 主要仪器及耗材 |
| 1.1.4 载体及细胞 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 标本的采集与保存 |
| 1.2.2 细胞培养和传代 |
| 1.2.3 实验分组 |
| 1.2.4 慢病毒转染技术 |
| 1.2.5 重组干扰慢病毒包装 |
| 1.2.6 实时荧光定量 PCR 检测(Quantitiative Real-time PCR,q-PCR) |
| 1.2.7 Western blot检测 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RNA干扰质粒的构建 |
| 2.1.1 干扰靶点设计结果 |
| 2.1.2 测序 |
| 2.2 RNA干扰有效靶点的筛选 |
| 2.2.1 RNA干扰后CCH成纤维细胞p38α基因的表达 |
| 2.2.2 RNA干扰后CCH成纤维细胞中p38α蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 p38介导结膜松弛症细胞衰老的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 溶液配制 |
| 1.1.3 主要仪器及耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 标本的采集与保存 |
| 1.2.2 细胞培养和传代 |
| 1.2.3 实验分组 |
| 1.2.4 细胞活性试剂盒(Cell counting kit-8, CCK-8)检测 |
| 1.2.5 β-半乳糖苷酶((β-galactosidase,β-gal)染色 |
| 1.2.6 活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测 |
| 1.2.7 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力测定 |
| 1.2.8 实时荧光定量PCR检测 |
| 1.2.9 Western blot检测 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 结膜成纤维细胞生长情况 |
| 2.2 结膜松弛症中细胞衰老的情况 |
| 2.3 p38对结膜成纤维细胞增殖的影响 |
| 2.4 p38对结膜成纤维细胞ROS的影响 |
| 2.5 p38对结膜成纤维细胞SOD的影响 |
| 2.6 p38对结膜成纤维细胞衰老相关基因表达的影响 |
| 2.7 p38对结膜成纤维细胞衰老相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 杞精明目汤对p38介导的结膜松弛症成纤维细胞衰老的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 溶液配制 |
| 1.1.3 主要仪器及耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 标本的采集与保存 |
| 1.2.2 细胞培养和传代 |
| 1.2.3 杞精明目汤颗粒剂的制备 |
| 1.2.4 实验分组 |
| 1.2.5 CCK-8检测 |
| 1.2.6 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)含量检测 |
| 1.2.7 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活力测定 |
| 1.2.8 实时荧光定量PCR检测 |
| 1.2.9 Western blot检测 |
| 1.2.10 质粒构建 |
| 1.2.11 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 杞精明目汤干预后结膜成纤维细胞的增殖情况 |
| 2.2 杞精明目汤对结膜成纤维细胞ROS的影响 |
| 2.3 杞精明目汤对结膜成纤维细胞SOD的影响 |
| 2.4 杞精明目汤对结膜成纤维细胞衰老相关基因表达的影响 |
| 2.5 杞精明目汤对结膜成纤维细胞衰老相关蛋白表达的影响 |
| 2.6 杞精明目汤对p38启动子活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 杞精明目汤对结膜松弛症细胞衰老的临床研究 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 结膜松弛症诊断与分级标准 |
| 1.2.1 诊断标准 |
| 1.2.2 临床分级标准 |
| 1.3 病例入选相关标准 |
| 1.3.1 纳入标准 |
| 1.3.2 排除标准 |
| 1.3.3 剔除标准 |
| 1.3.4 病例脱落及处理 |
| 1.4 材料与仪器 |
| 1.4.1 中药方剂和西药 |
| 1.4.2 主要试验材料与仪器 |
| 1.5 治疗方法 |
| 1.6 分组及随机方法 |
| 1.6.1 样本量的估算及其计算的依据 |
| 1.6.2 随机分组方法 |
| 1.6.3 盲法和对照 |
| 1.7 观察指标 |
| 1.7.1 裂隙灯显微镜检查 |
| 1.7.2 国际眼表疾病指数量表(OSDI) |
| 1.7.3 泪膜破裂时间(BUT) |
| 1.7.4 基础泪液分泌试验(SIT) |
| 1.8 手术方法 |
| 1.9 标本处理及细胞衰老染色 |
| 1.9.1 取材与固定 |
| 1.9.2 切片 |
| 1.9.3 冰冻切片细胞衰老染色 |
| 1.10 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 两组CCH患者治疗前后OSDI评分 |
| 2.2 两组CCH患者治疗前后BUT |
| 2.3 两组CCH患者治疗前后SIT |
| 2.4 两组CCH患者细胞衰老染色 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 :文献综述 衰老在祖国医学的认识及其中药研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 :在校期间科研成果 |
| 附录三 :参加科研和学术活动 |
| 附件 |
（3）Foxp3,IDO在小鼠角膜移植免疫排斥反应的表达（论文提纲范文）
| 文章快速阅读: |
| 文题释义: |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 时间及地点 |
| 1.3 材料 |
| 1.3.1 实验动物 |
| 1.3.2 实验用试剂 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 实验分组 |
| 1.4.2 小鼠同种异体角膜移植动物模型的建立 |
| 1.4.3 小鼠同种异体角膜移植术后实验观察 |
| 1.4.4 组织病理和免疫组织化学检查 |
| 1.4.5 移植角膜组织Foxp3 |
| 1.5 主要观察指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果Results |
| 2.1 实验动物数量分析 |
| 2.2 裂隙灯显微镜观察及发生角膜移植排斥时间比较 |
| 2.3 免疫组织化学检查 |
| 2.4 Real-time PCR检测角膜移植术后角膜植片Foxp3, IDO m RNA表达 |
| 3 讨论Discussion |
（4）IL-1β通过调控Th17细胞促进角膜移植免疫排斥反应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验器材 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 1.6 Real-time PCR引物信息 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小鼠穿透性角膜移植模型的建立和观察 |
| 2.2 Western blot检测 |
| 2.3 石蜡切片苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色 |
| 2.4 免疫荧光染色 |
| 2.5 小鼠取材、原代培养、细胞处理 |
| 2.6 Real-time PCR |
| 2.7 鼠尾鉴定 |
| 2.8 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 促炎细胞因子IL-1β促进小鼠角膜移植免疫排斥反应 |
| 2 通过干预NLRP3炎症小体抑制IL-β的成熟可有效延长角膜植片的免疫排斥反应的发生 |
| 3 IL-1β可诱导Th17细胞免疫反应 |
| 4 抑制Th17细胞免疫反应可显着抑制角膜移植免疫排斥反应 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（5）IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠视网膜缺血再灌注损伤中IL-33的动态表达及意义 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜结构和功能的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤作用机制的初步探讨 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）RelA修饰的树突状细胞诱导大鼠角膜移植免疫耐受的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养及鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 构建低表达RelA基因的树突状细胞及对其免疫生物学特性和功能的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 低表达RelA基因的树突状细胞诱导大鼠角膜移植免疫耐受的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）未成熟树突状细胞诱导辅助型T细胞偏移抑制大鼠高危角膜移植排斥反应的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 仪器及试剂选择 |
| 1.2.2 大鼠骨髓来源DC培养 |
| 1.2.3 动物分组及相关处理 |
| 1.2.4 高危角膜移植动物模型的建立 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.3.1 术后观察 |
| 1.3.2 组织病理学观察 |
| 1.3.3 Scurfin蛋白表达检测 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组角膜植皮存活时间分析 |
| 2.2 HE染色结果分析 |
| 2.3 各组角膜新生血管评分分析 |
| 2.4 Scurfin蛋白表达结果分析 |
| 3 讨论 |
（8）CCR7基因修饰未成熟树突状细胞诱导大鼠高危角膜移植免疫耐受的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（10）CD4+CD25+与CD8+CD103+调节性T细胞在小鼠角膜移植中的效应研究（论文提纲范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、前言 |
| 四、正文 |
| 第一部分 CD4~+CD25~+与CD8~+CD103~+调节性T细胞在小鼠同基因与异基因角膜移植中的效应研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 CD4~+CD25~+与CD8~+CD103~+调节性T细胞在不同品系小鼠异基因角膜移植免疫排斥中的效应研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 五、总结 |
| 六、参考文献 |
| 七、综述 |
| 八、在读硕士学位期间发表的文章 |
| 九、致谢 |
四、角膜移植免疫中细胞因子的研究新进展（论文参考文献）
- [1]移植术后的角膜衰老对角膜移植免疫排斥的影响及其机制研究[D]. 尹文惠. 青岛大学, 2020(01)
- [2]p38介导结膜松驰症的细胞衰老及杞精明目汤的干预研究[D]. 项敏泓. 上海中医药大学, 2019(02)
- [3]Foxp3,IDO在小鼠角膜移植免疫排斥反应的表达[J]. 宫玉波,刘勇,赵宏伟,许倩倩,郭惠玲. 中国组织工程研究, 2018(28)
- [4]IL-1β通过调控Th17细胞促进角膜移植免疫排斥反应[D]. 王昕. 青岛大学, 2018(12)
- [5]IL-33预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响及其机制[D]. 伍志琴. 武汉大学, 2017(05)
- [6]RelA修饰的树突状细胞诱导大鼠角膜移植免疫耐受的实验研究[D]. 易锐文. 南方医科大学, 2017(01)
- [7]未成熟树突状细胞诱导辅助型T细胞偏移抑制大鼠高危角膜移植排斥反应的研究[J]. 王启明,赵心悦,王智,宋蔚. 眼科新进展, 2016(10)
- [8]CCR7基因修饰未成熟树突状细胞诱导大鼠高危角膜移植免疫耐受的研究[D]. 周琨. 石河子大学, 2014(03)
- [9]角膜移植免疫排斥反应的诱发因素及免疫抑制药物治疗[J]. 蔡涛. 中国组织工程研究与临床康复, 2009(44)
- [10]CD4+CD25+与CD8+CD103+调节性T细胞在小鼠角膜移植中的效应研究[D]. 王欣. 复旦大学, 2009(12)