一、新城疫病毒B_(95)株的RT-PCR检测（论文文献综述）
李保珍[1]（2019）在《以耐热新城疫病毒为载体的Ⅰ群禽腺病毒（4型、8b型）活疫苗的研制》文中指出禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV）可分为I群、II群、III群,可引起鸡、鸭、鹅等多种家禽或野禽的疾病。其中I群禽腺病毒又可分为12个血清型,我国鸡群中主要流行血清4型（FAdV-4）和血清8b型（FAdV-8b）,分别引起心包积液综合征（Hydropericardium syndrome,HPS）和鸡包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis,IBH）等疾病,给养禽业造成严重的经济损失。纤突蛋白（fiber）是禽腺病毒的重要结构蛋白,含有病毒的中和抗原表位,也与病毒的感染性有关。本研究以耐热新城疫病毒为载体,采用反向遗传技术分别构建表达FAdV-4和FAdV-8b纤突蛋白的重组病毒,并且评价了重组病毒活疫苗的免疫效力。1.以耐热新城疫病毒为载体的I群禽腺病（4型、8b型）重组病毒的构建以FAdV-4（GX2013株）和FAdV-8b（QD2016株）基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增fiber2基因和fiber基因,再将fiber2基因和fiber基因分别插入含有NDV/rAHR09弱毒株全基因组质粒rAHR09-P的P和M基因间隔区,构建rAHR09-P-FAdV-4 fiber2和rAHR09-P-FAdV-8b fiber。将两个重组质粒分别与表达NDVNP、P、L基因的质粒（pCI-NP、pCI-P、pCI-L）共转染BSR-T7/5细胞60 h,收毒后接种9-11日龄SPF鸡胚。经血凝试验证明拯救出重组病毒。通过RT-PCR及测序证明,fiber2基因和fiber基因分别插入了 NDV/rAHR09基因组中。将这两株重组病毒命名为rAHR09-4F2和rAHR09-8bF。Western Blot 试验显示,插入 NDV/rAHR09 中的 fiber2 基因和 fiber 基因均能够表达,两株重组病毒表达的蛋白条带大小与预期一致。耐热性试验结果显示:rAHR09-4F2和rAHR09-8bF经56℃处理70 min仍有HA活性,两株重组病毒与母本病毒均具有较好的耐热性。EID50试验测得rAHR09-4F2、rAHR09-8bF病毒滴度分别为107.42EID50/mL、107EID50/mL,两株重组病毒在鸡胚具有良好的复制能力。MDT 与 ICPI 试验结果显示:rAHR09-4F2 和 rAHR09-8bF MDT 大于 120 h,ICPI 数值均为0.050,两株重组病毒与亲本病毒毒力均无显着差异,仍为弱毒株。2.重组病毒免疫效力评价为了评价重组病毒rAHR09-4F2和rAHR09-8bF免疫效力,分别进行了免疫攻毒保护试验1和试验2。试验1分为rAHR09-4F2组、FAdV-4+FAdV-8b灭活疫苗组、攻毒对照组。7日龄SPF鸡,rAHR09-4F2组试验鸡通过滴鼻点眼接种rAHR09-4F2（106EID50）,灭活苗组经颈部皮下接种FAdV-4+FAdV-8b二价灭活疫苗（0.25 mL/只）。在免疫后第7、14、21、28d对各组试验鸡采血分离血清,通过血清中和试验（SNT）测定血清中FAdV-4和FAdV-8b中和抗体滴度。试验2分为rAHR09-8bF组、FAdV-4+FAdV-8b灭活疫苗组、攻毒对照组。处理方式与试验1一致。试验1的rAHR09-4F2组和灭活苗组试验鸡在接种后21 d中和抗体均达到峰值,产生的针对FAdV-4的抗体滴度分别为102.93和103.23。免疫后第21 d,各组试验鸡经肌肉注射攻FAdV-4（107.5TCID50/mL）,0.2mL/只。攻毒对照组在3d内全部死亡,rAHR09-4F2组在3 d内死亡5只,灭活苗组表现正常。分别于攻毒后3 d、7 d采集各组试验鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子,通过SYBR Green I实时荧光定量PCR的方法测定病毒含量。在攻毒后第3d、7d,rAHR09-4F2组试验鸡呼吸道和消化道排毒量均高于灭活苗组,差异均显着（P≤0.05）。rAHR09-4F2刺激试验鸡产生的抗体水平较低,对FAdV-4具有50%的死亡保护效率,rAHR09-4F2能降低试验鸡的排毒量,但效果不显着。试验2的rAHR09-8bF组和灭活苗组试验鸡在免疫后7d开始产生中和抗体,在免疫后21 d达到峰值,产生的针对FAdV-8b的抗体滴度分别为103.11和103.15。免疫后第21 d,各组攻FAdV-8b（106.5 TCID50/mL）,0.2 mL/只。攻毒后,rAHR09-8bF组和灭活苗组表现正常,攻毒对照组出现拉稀现象。攻毒后第3d、7d,rAHR09-8bF组和灭活苗组呼吸道和消化道排毒量均低于攻毒对照组,且差异极显着（P≤0.01）。rAHR09-8bF组呼吸道和消化道排毒量与灭活苗相比,差异不显着（P>0.05）。rAHR09-8bF能刺激试验鸡产生较高水平的针对FAdV-8b的抗体,并能显着降低试验鸡的排毒量,保护效率可达90%左右。
谢晶,于吉锋,周泷,曹冶,林毅,李兴玉,肖璐,叶勇刚,潘梦,康润敏[2]（2019）在《鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用》文中进行了进一步梳理试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus,ILTV）检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增（loop media-ted isothermal amplification,LAMP）技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV（匈牙利株和王岗株）,不与新城疫病毒（NDV,B株）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV,H52株和H120株）、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。
刘倩[3]（2017）在《新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建》文中研究表明新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是严重危害养禽业的烈性传染病——新城疫（Newcastle disease,ND）的病原。由于V4和1-2等耐热ND弱毒疫苗的贮存和运输不需要依赖冷链,在热带、亚热带国家和地区已经得到广泛应用。我国上世纪90年代引进了 NDV耐热毒株V4,但由于知识产权等的限制,至今未大规模应用于生产。本研究从保存的40多株NDV中筛选到1个耐热强毒株（HR09株）;测定了该毒株的全基因组序列,并分析了其分子生物学特性;建立了该毒株的反向遗传操作系统,并对其F基因进行突变,得到NDV耐热弱毒株。本研究为进一步揭示NDV耐热毒株的耐热机制和创制耐热ND弱毒疫苗奠定了基础。1新城疫病毒耐热株HR09鉴定及全基因组序列测定将本室保存的40多个NDV分离株与V4、LaSota等参考毒株共同进行耐热性试验。以56℃耐热处理30 min时仍具有血凝性作为筛选标准,获得1个耐热毒株——HR09株。HR09株经蚀斑纯化后进行生物学特性鉴定,显示该毒株的MDT为57.6 h,ICPI为1.8,IVPI为1.56,符合NDV强毒株特征。设计10对引物,对HR09株全基因组序列进行扩增、测定和生物信息学分析,结果显示,该毒株基因组全长为15192 nt,推导的F蛋白裂解位点氨基酸序列为112RRQKRF117,HN蛋白长度为571个氨基酸残基,符合NDV强毒株特征。HR09株基因组GC含量为46.27%,与耐热的V4株、1-2株全基因组的核苷酸序列同源性为86.7%和85.4%,6个结构蛋白编码基因的核苷酸序列同源性介于83.1%～95.6%之间、推导的氨基酸序列同源性介于81.6%～98.0%之间。基于F基因全长所构建的进化树显示,HR09株属于基因ⅷ型毒株。2新城疫病毒耐热株HR09反向遗传操作系统的构建设计了多对引物,构建了 HR09株基因组的全长cDNA克隆以及含有该毒株NP、P和L基因的3个真核表达质粒,共转染BSR-T7/5细胞,拯救出病毒NDV/rHR09。对获救病毒的耐热性进行测定,显示其经56℃处理60 min时仍具有血凝活性,说明NDV/rHR09株与亲本株的耐热性相似。NDV/rHR09株的MDT值为60 h,ICPI值为1.625,仍为NDV强毒株。3新城疫病毒耐热弱毒株rAHR09的构建设计两对引物,经Overlap PCR的方法将NDV/rHR09毒株F基因裂解位点的112、115和117位碱性氨基酸突变成弱毒株特征的非碱性氨基酸,构建了转录载体prNDV/HR09,将转录载体与NP、P和L基因的真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞,拯救出病毒NDV/rAHR09。经56。C、45min处理,NDV/rAHR09株仍具有血凝性,MDT值>120h,ICPI值为0.057。结果表明,NDV/rAHR09株具有耐热性,且毒力已明显致弱,可以作为耐热ND弱毒疫苗的候选毒株。
陈林子[4]（2017）在《两株新城疫病毒诱导宿主获得性免疫及天然免疫的差异比较》文中提出本研究在对实验室保存的一新城疫毒株进行鉴定及生物学特性研究的基础上,将其与新城疫Lasota标准毒株对比,探讨两个毒株在诱导宿主获得性免疫及天然免疫方面的差异。结果如下:1.新城疫Lasota.P2M1毒株生物学特性分析为探讨一株血凝价明显高于标准新城疫Lasota毒株的Lasota毒株克隆（命名为Lasota.P2M1）的纯净性及部分生物学特性,本研究用RT-PCR方法排除病毒液中其他常见禽类病毒（尤其是具有血凝特性病毒）的存在;用电子显微镜观察病毒粒子结构;提取RNA,进行全基因组测序并与公布的标准毒株序列进行比较。结果发现:该新城疫病毒均质单一,不含其它常见禽类病毒;病毒粒子呈球形,大小约为200-300nm,有囊膜,囊膜上有纤突,在形态学上符合新城疫病毒特征;与标准Lasota毒株相比,在P蛋白上存在E80G、L327I两个氨基酸突变,在M蛋白上存在一个T124A突变。结果表明:该病毒虽然生物学特性有一定的变化,但从结构及进化上属于典型的新城疫病毒,基因突变可能是其毒株血凝价升高的原因。2两株新城疫Lasota毒株引起宿主获得性免疫反应的差异比较为探讨两株生物学特性不同的新城疫Lasota毒株（标准Lasota毒株;突变株Lasota.P2M1）引起宿主获得性免疫反应的差异,本研究用标准Lasota毒株和Lasota.P2M1分别免疫1周龄SPF鸡,免疫后2周用新城疫病毒强毒株（北京F48E9株）对鸡群攻毒并检测不同毒株免疫及攻毒后的存活率、体内的抗体水平、内脏器官的含毒量及口咽部和泄殖腔的排毒量。结果显示:Lasota.P2M1免疫的鸡群在攻毒后,存活率（60%）显着高于标准Lasota毒株免疫的鸡群（40%）,并能产生更高水平的IgG、SIgA、新城疫病毒特异性血凝抑制（HI）抗体和中和抗体;同时鸡群内脏中病毒含量较低,口咽部与泄殖腔检测到的病毒量降低更为明显。结果表明:与标准Lasota相比,Lasota.P2M1对鸡群具有更好的免疫保护作用,能诱导更高的新城疫病毒特异性抗体水平以及更强体液免疫和黏膜免疫反应,这可能是由于其基因组中的氨基酸突变导致,这种免疫学特性的变化或许能够在新城疫的疫苗开发中得到应用。3两株新城疫Lasota毒株对宿主天然免疫反应的差异比较为探讨两株不同生物学特性的新城疫Lasota毒株（标准Lasota毒株;突变株Lasota.P2M1）引起宿主天然免疫反应的差异,本研究将两种病毒分别感染鸡胚成纤维细胞（DF-1）,Real-time PCR 及 Western b1ot 检测 TLR3、TLR7、MDA5 等受体的mRNA及蛋白表达,ELISA及免疫荧光检测核转录因子IRF3的含量及其磷酸化水平,蛋白芯片检测40种细胞因子的分泌水平并用ELISA验证部分与炎症、抗病毒等相关的细胞因子在细胞上清中的含量差异。结果显示,标准Lasota毒株感染细胞后,诱导产生的TLR3、TLR7、MDA5的mRNA及蛋白含量显着高于突变株Lasota.P2M1（P<0.05）。Lasota感染细胞后12小时,IRF3及其磷酸化水平、细胞上清中大部分细胞因子（31/40）的表达高于Lasota.P2M1感染组。结果说明,两种毒株在诱导DF-1细胞的天然免疫反应方面存在差异,这可能是Lasota.P2M1在鸡胚中更容易增殖的原因。
赖隆永[5]（2017）在《ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究》文中研究说明传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由双股核糖核酸病毒科的传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）引起的以感染雏鸡为主的免疫抑制性、高度接触性传染病;新城疫（Newcastle Disease,ND）是由副黏病毒科鸡新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起鸡的急性、高度接触性和致死性传染病,不同年龄、品种以及性别的鸡均能感染ND,但是幼雏的发病率和死亡率明显更高。研究发现国内对ND-IBD二联灭活苗的研发及其对种母鸡免疫效果研究较少,因此,针对这种情况,对ND-IBD二联灭活苗对种母鸡免疫效果研究仍需要进一步研究;同时在生产临床实践中或者科研试验研究中,血清学方法监测雏鸡抗体水平在一定程度上,都会引起雏鸡应激,影响其生长性能和经济效益。通过从鸡蛋中提取ND和IBD卵黄抗体间接预估ND和IBD血清抗体,获取样品方便,减少雏鸡的反复应激,考虑到ND和IBD卵黄抗体与子代雏鸡ND和IBD血清抗体的关系尚不明确,因此通过测定ND和IBD卵黄抗体与ND和IBD血清抗体,进行ND和IBD卵黄抗体与子代ND和IBD血清抗体的相关性分析;另外,研究表明在临床实践中,机体内存在IBDV野毒和苗毒的感染,引起法氏囊病变和免疫失败,因此建立一种高效简便的IBDV野毒与疫苗毒的鉴别诊断方法具有重要意义。本研究拟对100日龄种母鸡进行皮下注射ND-IBD二联灭活苗,对其ND和IBD抗体水平进行检测,观察种母鸡及其子代的免疫效果,此外,对提取的种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平与子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平进行相关性分析,最后建立一种高效简便的IBDV野毒与疫苗毒的鉴别诊断方法。本试验的研究内容及结果如下:1.ND-IBD二联灭活苗对100日龄种母鸡的免疫效果研究。本试验通过对100日龄种母鸡进行皮下注射ND-IBD二联灭活苗,分别于免疫前、免疫后每隔15 d采血分离血清,利用血清学方法检测其ND和IBD抗体水平,并对其抗体水平进行分析,结果表明种母鸡接种ND-IBD二联灭活苗之后产生了较高的ND和IBD抗体水平,种母鸡得到了很好的免疫保护,并且其免疫保护力能够持续120d。可见,种母鸡免疫ND-IBD二联灭活苗,不仅可以有效地提高种母鸡的抗体水平,也可以提高子代的母源抗体水平。2.ND和IBD卵黄抗体与子代ND和IBD血清抗体的相关性分析。本试验通过检测种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平及其子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平,结合SPSS 18.0软件的分析,得到免疫组种蛋ND卵黄抗体与子代ND血清抗体水平关系的最优方程为y=0.923+0.701x;免疫组种蛋IBD卵黄抗体与子代IBD血清抗体水平关系的最优方程为y=2.365+0.7x。3.IBDV强弱毒株鉴别诊断方法的建立。根据NCBI中不同毒株的VP2共保守区段序列比对分析设计两对引物（片段长度为856bp和1356bp）和选择限制性内切酶BamHI和PstI进行RT-PCR扩增,并选择片段长度为856 bp的PCR产物,胶回收其目的基因进行限制性内切酶酶切,最后验证其特异性、敏感性和重复性,建立了IBDV强弱毒株鉴别诊断的RT-PCR-RFLP方法。综上,种母鸡免疫接种ND-IBD二联灭活苗后种母鸡及其子代获得较高抗体水平;此外,分析免疫组种母鸡种蛋的ND和IBD卵黄抗体水平与子代雏鸡的ND和IBD血清抗体水平的相关性,获得了它们之间的最优方程;最后建立了一种高效简便的IBDV野毒与苗毒的鉴别诊断RT-PCR-RFLP方法,为临床和生产实践制定科学的免疫程序提供科学依据和提供高效便利的监测手段;同时,为IBD的流行病学和诊断治疗研究提供了一种新的手段。
刘浩[6]（2014）在《陕西省鸡新城疫流行情况的病原学检测及其免疫效果分析》文中认为鸡新城疫（Newcastle disease，ND），由副粘病毒引起的高度接触性传染病，又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，常呈急性败血症。主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血，死亡率高，对养鸡业危害严重。本病在世界范围内流行并造成巨大的经济损失，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的传染病，我国将其列为一类传染病，《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》也将鸡新城疫列为优先防治和重点防范的动物疫病。通过研究鸡新城疫的病原学流行情况和病原学与免疫抗体之间的流行病学关系，可进一步促进陕西省鸡新城疫的防控，为顺利实现国家中长期动物疫病防控目标提供理论支持。本研究通过对2010年～2013年随机采集的19960份和37040份健康鸡群血清样品分别进行病原学和免疫抗体检测，同时再通过对临床发病鸡病料进行鸡新城疫病原检测，并对检测结果进行相关性分析，获得的研究结果如下：1.2010年～2013年，在陕西省未发病鸡群随机采集了19960份血清，按照RT-PCR检测办法，共检出鸡新城疫阳性样品596份，阳性率为2.98%。检测情况表明，陕西省未发病鸡群中存在鸡新城疫病毒隐性感染情况，且有发生鸡新城疫疫情的潜在风险。2.采集152份临床发病鸡病料，按照实时荧光定量RT-PCR检测办法，对152份病料进行鸡新城疫病原学检测，检测数据显示，发病鸡中鸡新城疫病原检出率达到28.28%，表明鸡新城疫是威胁陕西家禽养殖业的主要疫病之一。3.为进一步评价未发病鸡群鸡新城疫鸡新城疫免疫效果，于2010年～2013年，对随机采集的37040份鸡血清，按照鸡新城疫血凝抑制试验方法开展免疫抗体效果检测，探索免疫效果与病毒感染两者之间的关联性。检测数据显示，陕西鸡新城疫免疫抗体总体合格率为91.22%，基本稳定，但有较强的区域差异，关中四市抗体合格率最高，陕南三市抗体合格率最低，陕南地区发生鸡新城疫疫情的风险较大。免疫效果与病原学感染相关性分析表明，免疫抗体合格率鸡新城疫病原阳性检出率呈负相关。
刘玉秀[7]（2014）在《犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究》文中提出犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）感染引起食肉科动物死亡的急性、高度接触性传染病。近年来，随着全球环境变化、动物栖息地的人为频繁干预及病毒的进化，CDV的自然宿主已由传统的犬科、浣熊科和鼬科扩大到猫科、灵猫科等所有陆地食肉科动物，此外也有偶蹄目、海豹和非人灵长类自然感染CDV的报道。CDV给全球动物养殖业和生物多样性带来极大损失和危害的同时，其社会公共危害性越来越受到人们重视。传代细胞系上缺少CDV病毒受体，人工分离培养病毒十分困难，导致人们对病毒的病原学与免疫研究认知较其它病毒而言发展相对缓慢，特别是在免疫预防方面一直沿用上世纪50年代研制的CDV。因此，当前构建高效分离CDV的敏感细胞系，建立病毒的反向遗传操作平台，分离研究当前流行犬瘟热野毒株的特性，分析野毒株与商业疫苗毒株抗原蛋白分子特性及抗原蛋白差异，开展有效安全成本低廉犬用疫苗或佐剂的研制具有重大意义，对预防控制国内犬瘟热疫情蔓延具有重要现实意义。I表达犬瘟热病毒SLAM受体的敏感细胞系构建及其病毒的分离与鉴定鉴于传统的CDV分离培养方法有分离率低、耗时长、成本高等缺陷，因此尽快建立方便、快捷分离培养CDV的方法显得尤为重要。本试验成功构建了表达犬瘟热病毒受体SLAM的Vero/DogSLAM细胞系，并用该细胞系分离到猴源（Monkey-BJ01-DV）和犬源（SC-CDV）CDV野毒各一株，探索了不同动物来源CDV对不同种属动物SLAM利用情况，比较了同时期猴源和犬源流行犬瘟热毒株的重要蛋白基因序列。结果显示本试验构建的Vero/DogSLAM敏感细胞系在接种病料36-48h后就能出现典型CPE，缩短病毒分离时间，提高CDV分离率，将有力地推动对犬瘟热病毒分子特征的研究。此外，我们还比较了不同种属来源CDV受体病毒病毒分离的敏感性，研究发现猴源和犬源CDV都能高效利用猴和犬SLAM受体，但是猴源CDV更倾向于利用猴SLAM，犬源CDV对犬SLAM亲和力比对猴SLAM高；Monkey-BJ01-DV病毒H蛋白基因与国内同期流行的犬源和狐狸源CDV病毒的同源性最高达98.4％；且与同期流行食肉科源CDV相比，三株猴源CDV-H蛋白有E276V、Q392R、D435Y和I542F4个特异性突变位点。II现行不同疫苗株犬瘟热病毒免疫效果评价及其H蛋白基因特性分析研究虽然减毒活疫苗早已用于犬瘟热的防控，近年来国内家养动物和养殖场的犬科、鼬属经济动物经常暴发犬瘟热疫情。有学者认为是目前疫苗所用毒株与流行野毒株抗原性有所差异，野毒株能逃避现行所用疫苗产生的免疫保护而致病。本实验为了解目前常用犬用疫苗中CDV毒株与国内流行野毒株H基因的差异性，对分别来自法国、俄罗斯、荷兰、韩国及国产的5种犬用疫苗在犬和狐狸上对以上疫苗进行了免疫效果评价；同时对其CDV-H基因进行序列测定，与传统疫苗株和国内野毒株的H基因进行比较。结果显示证实韩国疫苗使用毒株的免疫原性最好。法国疫苗使用Onderstepoort株；荷兰疫苗使用Vaccine strain JP株；国产疫苗使用的毒株与Snyder Hill同源性最高；俄罗斯疫苗使用的毒株也同属于北美疫苗株，但是于传统的疫苗株亲缘性低，自成一个分支；韩国疫苗使用毒株与野毒株同源性最高。序列分析表明国内流行野毒株与现行使用疫苗毒株H蛋白的同源性只有87－90％，疫苗株H蛋白一般有4－7个糖基化位点，而国内流行野毒株已经进化出9个糖基化位点。韩国疫苗使用毒株H蛋白含有野生株特有的g3（309）糖基化位点。H基因序列的多样性可能对不同毒株H蛋白的中和表位产生重要的影响。为近一步明确犬瘟热病毒强毒株与弱毒株间的抗原性差异，我们分析了决定CDV病毒抗原性的H糖蛋白。本试验利用2株对疫苗株和野生株H蛋白表现不同亲和力的单抗：d-7和JD-7，通过点突变和基因重组方法探索野生株和疫苗株H蛋白抗原性差异位点。最后通过Phyre2软件构建了CDV-H蛋白3D结构模型，比较分析了疫苗株和野生株H蛋白空间结构，发现H蛋白的234－246aa、302－313aa及415-418aa之间野生株和疫苗株存在3处空间构象差异域，初步推断这三处差异导致疫苗株和野生株抗原性差异区域。本试验揭示国内常用疫苗毒株背景，发现其与国内流行野毒株H蛋白同源性较低，对今后CD防治措施制定提供一定指导作用，及对今后犬用疫苗毒株筛选工作提供一定的借鉴意义。III表达IL-18重组犬瘟热病毒感染性克隆构建与初步应用研究犬瘟热疫苗株和野毒株之间抗原性差异，使进化野毒株可能逃避疫苗株产生的免疫保护。因此有必要在增强犬用疫苗刺激机体产生更多细胞免疫反应着手拓展开发新型犬用疫苗或佐剂研究。白细胞介素18（Interleukin-18, IL-18）在诱导机体TH1型细胞产生IFN-γ对抗胞内寄生虫、细菌和病毒感染及抗肿瘤生长中具有重要作用，其作为一种疫苗佐剂或抗癌制剂被广泛研究应用。但IL-18缺乏自身信号肽，借助Caspases-1裂解形成成熟性IL-18发挥其生物学功能。研究显示粘附犬IL-12p40信号肽（cIL12ss）的成熟型IL-18能非依赖caspases-1裂解形成成熟型IL-18。本试验中构建了粘附人IL-2信号肽（hIL2ss）的犬IL-18表达系统，研究发现该表达系统也能非依赖caspases-1裂解形成成熟型犬IL-18，且粘附hIL2ss表达系统表达的IL-18刺激犬免疫细胞分泌IFN-γ量为863pg/ml，而cIL-12ss表达系统为424pg/ml，说明本试验构建IL-18表达系统更成功有效。随后我们构建了粘附hIL2ss的犬/鼠IL-18的重组犬瘟热病毒感染性克隆，成功拯救2株重组病毒rCDV-hIL2ss-cIL18和rCDV-hIL2ss-mIL18。结果显示rCDV-hIL2ss-cIL18感染细胞中即能检测到IL-18前体proIL-18（22kDa）蛋白又能检测到成熟型IL-18（18kDa），而rCDV-hIL2ss-mIL18感染细胞中只能检测到成熟型IL-18。这2株重组病毒保持与母本病毒相似的生长动力学特性；重组病毒感染细胞后能向细胞上清释放有生物学活性的IL-18，能刺激犬或鼠免疫细胞分泌IFN-γ。本实验构建的表达IL-18重组犬瘟热病毒可能是一种新的犬或鼠用疫苗佐剂和抗癌候选制剂。
贺奋义[8]（2012）在《鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究》文中研究指明鸽I型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus1，PPMV-Ⅰ）病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽I型副粘病毒（Avian Paramyxovirus1， PMV-Ⅰ）引起的一种急性、热性、高度性传染病。PPMV-Ⅰ引起鸽群突然发病，迅速蔓延，临床症状上与鸡新城疫嗜神经速发株引起的十分类似，主要临床特点是肠炎、下痢和神经症状，尤以嗜神经速发型为多见，发病率和死亡率都很高。鸽新城疫病其传播迅速、发病率高，发病后死亡率较高，死亡率可达50-80%以上，严重的可高达95%以上，处于孵化期的种胚感染后可全部死亡。给养鸽业造成的影响和危害巨大，是养鸽业重点防控的传染病之一。鸽新城疫病毒编码两种囊膜糖蛋白，融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN），F蛋白位于囊膜外表面，形成纤突，对鸽新城疫的毒力及感染性起决定性作用，是鸽新城疫的主要免疫原性蛋白；F基因还具有较高的遗传稳定性，是新城疫基因分型的主要依据，也是决定鸽新城疫致病力强弱的关键因素；F基因的遗传变异与鸽新城疫的变异和流行密切相关，是鸽新城疫分子流行病学研究的首选基因，因此，F基因是研究鸽新城疫核酸疫苗的首选目的基因。本文通过鸽新城疫种毒PL株在非免疫健康鸡胚上增殖动态的试验研究和病毒的灭活时间、灭活温度以及甲醛浓度的试验研究，确定了鸽新城制苗用病毒最佳制备方法和最佳灭活条件，在此基础上，研制出鸽新城疫油乳剂灭活疫苗和蜂胶佐剂灭活疫苗，经物理性状检验、安全性检验、急性毒性试验、免疫持续期试验、最佳免疫剂量测定，效力试验以及田间应用试验表明，鸽新城疫蜂胶佐剂灭活疫苗不仅均匀度好，粘度低，通针性良好，注射后易被机体吸收，在接种部位不会形成硬结，而且免疫效果好，对鸽群免疫后能起到坚强的保护作用。此外，本文还用RT-PCR方法，从鸽新城疫病毒PL株基因组中克隆、鉴定了融合蛋白基因（F基因），并在大肠杆菌中进行了高效表达，以纯化的F表达产物为抗原，建立了鸽新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法；同时，把鸽新城疫F基因插入酵母表达载体pPic9k和真核表达载体PC-DNA3.1/V5-His中，构建了鸽新城疫F基因毕赤酵母表达系统和F基因真核表达体系，为鸽新城疫F基因生物活性的进一步研究及新型核酸疫苗的研制奠定基础。本项目研究的主要内容包括：1、鸽新城疫种毒增殖规律和灭活方法的研究：采用鸽新城疫PL株为种毒，在鸡胚上连续盲传5代，使其扩大增殖，收获尿囊液做为基础种子毒。通过种子毒在非免疫健康鸡胚上增殖动态的试验研究表明，病毒在羊水、尿囊膜（包含羊膜）、尿囊液中含量较高、增殖动态趋于一致，而在胚体及卵黄中含量较低，接种病毒后72h为最佳收毒时间。经病毒的最佳灭活时间、灭活温度以及甲醛浓度的试验研究，确定了0.05%甲醛在20℃条件下经过48h；70℃的温度条件下经过20min灭活病毒为最佳灭活方法，不仅能有效的完全灭活病毒，而且能使病毒的血凝活性保持在94%以上。2、鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶灭活疫苗的制备：用70℃，20min的灭活方法分别制备尿囊液蜂胶佐剂灭活苗和四元材料（鸡胚尿囊液、羊水、尿囊膜、羊膜）混合蜂胶佐剂灭活苗，用0.05%甲醛在20℃条件下经48h的灭活方法分别制备鸽新城疫尿囊液蜂胶佐剂灭活苗、尿囊液油乳剂灭活苗和四元材料（尿囊液、尿囊膜、羊膜、羊水）混合油乳剂灭活苗。制备的六种疫苗经物理性状检验、安全性检验、急性毒性试验、免疫持续期试验综合分析表明，均具有良好的抗原性和安全性。3.鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶佐剂灭活苗的性能比较试验：用制备的六种鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶佐剂灭活苗分别免疫注射乳鸽，结果表明四种蜂胶佐剂灭活苗免疫抗体消长水平和免疫期基本一致，二种油乳剂苗免疫抗体消长水平和免疫期基本一致，从而证明四元材料的疫苗与尿囊液毒疫苗的性能基本一致；但四元材料蜂胶佐剂灭活苗和油乳剂灭活苗在抗体产生时间及其达到峰值的时间和数值上有差异，蜂胶苗明显优于油苗。蜂胶佐剂灭活苗在免疫后5d抗体开始上升（平均为2.8log2～2.9log2），14d抗体可达到高峰（平均为11.2log2～11.4log2），而油乳剂灭活苗在免疫后9d抗体效价开始上升（平均为3.0log2～3.1log2），21d才达到峰值（平均为9.0log2～9.2log2）。蜂胶佐剂灭活苗180d仍可维持较高水平（平均为6.6log2～6.7log2）；在免疫后30d、90d、180d用200ELD50强毒株攻击，其保护指数均为100%；对1日龄乳鸽接种1个使用剂量进行急性毒性试验观察，15d生长曲线表明，不影响鸽的生长，甚至有提高的趋势；室温保存3个月，4℃-8℃保存6个月，疫苗的物理性状和免疫保护性没有明显变化。4、鸽新城疫F基因的克隆及序列分析：通过设计一对引物，利用RT-PCR扩增以及亚克隆方法，从鸽新城疫病毒PL株中扩增出F基因，将扩增产物克隆进pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定筛选出阳性菌落并进行序列测定。结果表明：F基因为1662bp，编码553个氨基酸，与国内外报道的其他NDV毒株的F基因氨基酸数量相同；通过BLAST法与GenBank中国内外17个鸽源和鸡源部分新城疫毒株进行相似性比较及对照系统进化树的结果分析，表明我们的分离株（PL株）与17个毒株之间的相似性介于76.3-98.6%；对分离的鸽新城疫F融合蛋白的氨基酸序列与国内外8株新城疫氨基酸序列进行对比分析，结果氨基酸同源性为93.6%-96.7%；F0蛋白裂解位点的氨基酸组成为112R-R-R-K-R-F117，符合强毒株的序列。5、鸽新城疫F基因的原核表达及其生物活性研究：用PCR方法获得了缺失F蛋白信号肽、胞质区和跨膜区的F基因片段，将其亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中，与GST蛋白融合表达，经IPTG诱导和SDS-APGE分析，表明目的蛋白在大肠杆菌BL21中得到高效表达，表达产物分子量约为60Kda；以表达的融合蛋白为抗原初步建立了间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，用方阵法确定其最佳反应条件：抗原1∶128稀释即抗原包被量为0.6μg/孔，血清1∶400稀释，与一抗的最佳作用时间为60min，与酶标二抗的最佳作用时间为60min，底物显色的最佳作用时间为15min。6、鸽新城疫F基因在毕赤酵母中表达：根据鸽新城疫F基因序列，设计引物，将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K，用SalI内切酶线性化后电击转化GS115毕赤酵母感受态细胞，用影印法在含G418的YPD平板上筛选高拷贝重组菌，用甲醇诱导表达并进行SDS-APGE分析。7、鸽新城疫F基因的真核表达及其生物活性研究：将鸽新城疫PL株F基因插入到真核表达载体pcDNA3.1V5-Hi中，构建出真核表达质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F；将构建的真核表达重组质粒免疫接种非免疫新城疫的乳鸽，并在免疫后第28d进行攻毒保护试验。结果表明，在免疫后第7d产生抗体，14d抗体水平达到最高，之后抗体水平开始下降；攻毒保护试验结果显示，对鸽新城疫强毒攻击保护率为33.33%（5/15），具有一定的免疫保护作用。
商雨[9]（2012）在《新城疫病毒TS09-C株全长cDNA克隆的构建及荧光定量RT-PCR检测方法的建立》文中研究说明新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）为副粘病毒科副粘病毒属成员,其引起的新城疫（Newcastle Disease, ND）是一种高传染性高破坏性的疾病,被国际兽医局认定为两种A类禽病之一。当前,新城疫的防控以免疫预防为主,以NDV V4耐热株为代表的耐热活疫苗具有耐热、冷链要求低、使用方便、毒力低、免疫效果好和可同居感染等优点,在我国及其他发展中国家有着广阔的应用前景。现已有的NDV耐热毒株有V4、1-2、HB92、B95和TS09等,其中TS09株是我课题组经过对V4株的鸡胚耐热选育、纯化获得的。如能够采用反向遗传操作技术将NDV耐热毒株改造为耐热载体,插入其他禽类疫病的主要免疫源性基因,研发出禽类主要疫病的多联（多价）耐热活疫苗,将对禽病的防控带来深远的影响。但是,关于NDV耐热毒株反向遗传操作系统的成功构建至今仍未见报道。因此,本研究以TS09耐热株为研究对象,开展了NDV耐热毒株反向遗传操作系统的构建工作。一、新城疫病毒耐热株的细胞适应培养现有的反向遗传操作系统大多是在细胞上建立的,而TS09株为鸡胚适应株,不能在细胞上高效增殖。首先开展了TS09株的BHK细胞适应性培养及纯化工作。细胞培养条件的优化结果表明,0.2μg/mL的TPCK胰酶浓度为最大无毒浓度。连续17代传代培养及3次极限稀释法纯化,获得了一株新的、纯化的、适应BHK细胞的NDV耐热株,命名为TS09-C株。TS09-C株的生物学特性测定结果表明：TS09-C株的EID50值由原有的108.6/mL下降至1057/mL,但TCID50值由原有的103.3/mL上升至1079/mL,表明TS09-C株为细胞适应毒,且保持了亲本株的弱毒和耐热的特性,成功选育了新城疫耐热株细胞适应毒株。此外,序列分析结果表明：TS09、TS09-C和V4株仍保持着较近的遗传进化关系。二、TS09-C株的全基因组序列测定与分析设计了10对PCR引物对TS09-C株的全基因组进行了序列测定与分析。测序结果经序列拼接后获得TS09-C全基因组序列,全长15186nt。序列分析表明TS09-C和Ⅰ-2、I-2progenitor、Ulster-67共处在Ⅰ型分支上,编码6个结构蛋白（NP、P、M、F、HN和L）和两个非结构蛋白（V和W）；通过比对TS09-C株和V4株各基因的氨基酸同源性,发现M基因的同源性最低,为92.3%；F和HN的同源性较高,均大于99%。HN蛋白糖基化位点分析表明,TS09-C株HN蛋白仅含有4个糖基化位点,缺失119位和508位糖基化位点。采用生物信息学技术对TS09-C株的耐热机理进行了初步探讨。比较包括TS09-C株在内的4株耐热株和非耐热株氨基酸序列时,共发现23个耐热株特有的氨基酸差异,其中大部分为保守性突变,非保守性突变仅发现在P和W蛋白上。蛋白质二级结构比较分析表明耐热株和非耐热株的二级结构上的差异主要在HN蛋白的α螺旋区。这些耐热株特有位点（或结构）的发现为我们进一步研究其耐热提供了思路。三、TS09-C株全长感染性cDNA克隆的构建参考已经获得的TS09-C株全基因组序列,并进行酶切位点分析,设计出了TS09-C株全长感染性cDNA克隆的构建策略。共设计了8对引物用于全长cDNA克隆的构建。通过高保真RT-PCR,扩增出了8个片段（A、B、C、D、E、F、G1和G2）,G1和G2通过融合PCR形成G片段。在A片段的上游引入了T7RNA聚合酶的启动子,G片段通过融合PCR在其下游引入了T7RNA聚合酶的终止子和丁型肝炎病毒核酶序列。通过酶切连接的方法构建出三个中间质粒：pBR-ABC, pBR-DE和pBR-FG。再通过酶切连接的方法将ABC和DE插入pBR-FG中形成pBR-TS09-C全长质粒。经测序分析,与TS09-C株全基因组序列相比,全长质粒上有6处突变,其中4处同义突变,仅两处突变引起了氨基酸的改变,分析表明：这两处氨基酸突变在NDV其他毒株中也同样存在,不会影响到后续病毒的拯救恢复。四、新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用为给后续的新城疫研究提供快捷的定量检测方法,本研究建立了新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法。经对部分发表在NCBI里的新城疫病毒序列进行比对,在其F基因上找到一个相对保守序列,根据保守序列设计一对引物和一条TaqMan探针。以新城疫Ⅰ系疫苗株（Mukteswar株）作为标准品,通过系列条件优化、特异性、灵敏性和重复性实验,建立了一种灵敏度高、特异性强和重复性好的荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法。该方法能检测最低初始病毒浓度为1022ELD50/mL,且在108.2-102.2ELD50/mL范围内Ct值与病毒的浓度的对数值（1gELD50/mL）呈很好的线性关系,R2达到0.9975；该方法与禽流感病毒、禽痘病毒和禽大肠杆菌等禽病病原核酸无交叉反应；批间和批内重复性良好；临床样品检测中荧光RT-PCR与鸡胚分毒的符合率、诊断灵敏度和诊断特异性分别为98.5%、50%和98.4%。因此,荧光RT-PCR检测方法的建立为新城疫病毒检测提供了一种快速有效的方法,为新城疫病毒的研究提供了技术平台。综上所述,本论文主要完成了新城疫病毒耐热株细胞适应培养、TS09-C株全基因组的测序与分析和TS09-C株全长感染性cDNA克隆的构建等研究,为新城疫耐热株反向遗传操作系统的建立打下了良好的工作基础。新城疫荧光RT-PCR检测方法的建立为后续的新城疫研究提供了技术平台。
李彤彤[10]（2011）在《鹅副粘病毒E01株HN蛋白的表达及其相关免疫效果的初步研究》文中指出本研究主要将本实验室分离、鉴定并纯化的鹅源副粘病毒E01株进行了基因组RNA的提取,参考GenBank收录的ZJ1株鹅源副粘病毒全基因组核苷酸序列,在HN基因的ORF上下游设计1对特异性引物HNF1/HNR1,通过RT-PCR方法扩增得到HN基因片段。并将其连接至克隆载体pMD-18T上,得到克隆质粒,命名为T-HN。将编码HN蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别与13株国内外NDV毒株进行同源性比较,并绘制系统发育树。结果显示,同源性分别在65.7%-99.0%和84.6%-99.0%。属于基因Ⅶ型NDV。在HNF1/HNR1的5’端进行修饰,分别加入EcoRI和SalI限制性酶切位点得到用于扩增HN基因ORF的第二对引物HNF2/HNR2,以质粒T-HN为模板,PCR扩增得到用于原核表达的HN ORF片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a上,构建了原核表达质粒pET-HN,并转化表达菌BL21（DE3）中,通过IPTG的诱导表达,将表达蛋白进行SDS-PAGE检测,用全病毒高免血清进行Western blot检测,出现特异性条带。依照相同方法重新修饰HNF1/HNR1的5’端,分别加入EcoRI和Not I限制性酶切位点得到用于扩增HN基因ORF的第三对引物HNF3/HNR3,以质粒T-HN为模板,PCR扩增得到用于真核表达的HN ORF片段,将其克隆至真核表达载体pVAXl上’构建了真核表达质粒pVAX-HN,将其转染Vero田胞72h后,进行间接免疫荧光试验,出现特异性绿色荧光,提取阳性转染细胞总RNA,进行RT-PCR扩增,可见一条大小约1.7kb的条带,说明真核表达质粒能够表达HN蛋白。GPMV HN蛋白在原核和真核系统中的成功表达为高效的亚单位基因工程疫苗的研制、新型诊断方法的建立及鹅源副粘病毒基因融合功能的研究奠定基础。为验证HN蛋白与HN基因的DNA疫苗pVAX-HN的免疫效果,本研究还将原核表达的HN蛋白复性产物与重组质粒pVAX-HN同时免疫7日龄SPF鸡,每次免疫前采血,用间接ELISA测定血清中抗体水平。同时设生理盐水对照组和pVAXl空质粒对照组为阴性对照组,减毒活疫苗Lasota为阳性对照组。试验结果表明,两个免疫组三次免疫后产生的血清抗体显着高于阴性对照组。说明表达产物及DNA疫苗能够刺激机体免疫系统产生免疫反应,该项结果为后续制备鹅源新城疫基因工程疫苗奠定了基础。
二、新城疫病毒B_(95)株的RT-PCR检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新城疫病毒B_(95)株的RT-PCR检测（论文提纲范文）
（1）以耐热新城疫病毒为载体的Ⅰ群禽腺病毒（4型、8b型）活疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1. Ⅰ群禽腺病毒的病原学特性 |
| 1.1 Ⅰ群禽腺病毒的血清分型 |
| 1.2 Ⅰ群禽腺病毒形态结构及理化特性 |
| 2. Ⅰ群禽腺病毒的主要蛋白质 |
| 3. Ⅰ群禽腺病毒流行现状 |
| 4. Ⅰ群禽腺病毒疫苗研究进展与防控 |
| 4.1 Ⅰ群禽腺病毒疫苗研究进展 |
| 4.1.1 全病毒灭活疫苗 |
| 4.1.2 弱毒活疫苗 |
| 4.1.3 基因工程疫苗: 亚单位疫苗与DNA疫苗 |
| 4.2 Ⅰ群禽腺病毒防控 |
| 5. 新城疫病毒作为疫苗载体的发展 |
| 6. 耐热新城疫病毒研究进展 |
| 研究目的及意义 |
| 第一章 以耐热新城疫病毒为载体的Ⅰ群禽腺病(4型、8b型)重组病毒的构建及生物学特性测定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、菌株及病毒 |
| 1.1.2 细胞及鸡胚 |
| 1.1.3 主要实验试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 病毒DNA的提取及目的基因的扩增 |
| 1.2.3 rAHR09-P质粒的酶切 |
| 1.2.4 FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber基因的克隆与测序 |
| 1.2.4.1 序列测定与分析 |
| 1.2.5 病毒的拯救与鉴定 |
| 1.2.5.1 细胞与辅助质粒的准备 |
| 1.2.5.2 共转染 |
| 1.2.5.3 重组病毒的鉴定 |
| 1.2.6 重组病毒耐热性测定 |
| 1.2.7 重组病毒生物学特性测定 |
| 1.2.7.1 重组病毒EID_(50)测定 |
| 1.2.7.2 重组病毒MDT测定 |
| 1.2.7.3 重组病毒ICPI测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber基因的扩增 |
| 2.2 rAHR09-P质粒的酶切 |
| 2.3 重组质粒鉴定 |
| 2.4 病毒的拯救与鉴定 |
| 2.5 重组病毒的耐热性测定 |
| 2.6 重组病毒的生物学特性测定 |
| 2.6.1 重组病毒EID_(50)测定 |
| 2.6.2 重组病毒MDT和ICPI测定 |
| 3 小结与讨论 |
| 第二章 以耐热新城疫病毒为载体的Ⅰ群禽腺病毒(4型、8b型)重组病毒免疫效力评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒及细胞 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要实验试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 血清4型+8b型禽腺病毒二价油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.2.2 重组病毒的免疫攻毒试验 |
| 1.2.2.1 重组病毒的免疫试验 |
| 1.2.2.2 免疫后抗体水平监测 |
| 1.2.2.3 攻毒试验 |
| 1.2.2.4 攻毒后排毒量检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 试验1 |
| 2.1.1 免疫后抗体水平监测 |
| 2.1.2 攻毒试验 |
| 2.1.3 排毒量检测 |
| 2.2 试验2 |
| 2.2.1 免疫后抗体水平监测 |
| 2.2.2 攻毒试验 |
| 2.2.3 排毒量检测 |
| 3 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要毒株和临床样本 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒DNA、RNA和细菌DNA的提取 |
| 1.2.2 LAMP引物设计及合成 |
| 1.2.3 ILTV LAMP方法的建立 |
| 1.2.4 LAMP反应引物的筛选 |
| 1.2.5 LAMP反应温度的筛选 |
| 1.2.6 LAMP反应特异性检测 |
| 1.2.7 LAMP反应敏感度检测 |
| 1.2.8 ILTV临床样本检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 LAMP反应最佳引物的筛选 |
| 2.2 LAMP反应最佳温度的筛选 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 敏感性检测 |
| 2.5 临床样本检测 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（3）新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒耐热株HR09鉴定及其全基因组序列测定 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 细胞及鸡胚 |
| 1.1.3 主要实验试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 耐热性测定 |
| 1.2.2 病毒纯化 |
| 1.2.3 HR09株全基因组序列测定及分析 |
| 1.2.3.1 引物设计与合成 |
| 1.2.3.2 病毒RNA的提取及RT-PCR |
| 1.2.3.3 目的片段的克隆与鉴定 |
| 1.2.3.4 5'RACE和3'RACE |
| 1.2.3.5 序列测定与分析 |
| 1.2.4 生物学特性的研究 |
| 1.2.4.1 1CPI的测定 |
| 1.2.4.2 IVPI的测定 |
| 1.2.4.3 MDT的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 耐热性测定 |
| 1.3.2 病毒纯化 |
| 1.3.3 HR09株生物学特性 |
| 1.3.4 HR09株全基因组序列测定 |
| 1.3.5 HR09株全基因组序列分析 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 第二章 HR09耐热株反向遗传操作系统的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 细胞及鸡胚 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 HR09全基因组cDNA各片段的克隆与测序 |
| 2.2.3 HR09全基因组cDNA转录载体的构建 |
| 2.2.3.1 HR09全基因组各片段重组质粒的提取 |
| 2.2.3.2 HR09基因组5'端及3'端的连接 |
| 2.2.3.3 中间质粒TM (2296nt-13048nt)的构建 |
| 2.2.3.4 含HR09株全基因组cDNA的转录载体的构建 |
| 2.2.3.5 HR09株全基因组cDNA的转录载体的鉴定 |
| 2.2.4 辅助质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.4.1 辅助质粒pCI-NP、pCI-P的构建 |
| 2.2.4.2 辅助质粒pCI-L的构建 |
| 2.2.4.4 辅助质粒的鉴定 |
| 2.2.5 病毒的拯救和鉴定 |
| 2.2.5.1 细胞和转染用质粒的准备 |
| 2.2.5.2 共转染 |
| 2.2.5.3 获救病毒的鉴定 |
| 2.2.6 获救病毒的耐热测定 |
| 2.2.7 MDT和ICPI的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HR09全长基因组cDNA各片段的扩增结果 |
| 2.3.2 HR09全基因组cDNA转录载体的鉴定 |
| 2.3.3 辅助质粒的构建和鉴定结果 |
| 2.3.4 获救病毒的鉴定 |
| 2.3.5 获救病毒耐热性测定结果 |
| 2.3.6 获救病毒MDT和ICPI测定结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 HR09耐热株致弱拯救研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 细胞及鸡胚 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 片段Rr1和片段Rr2的克隆与测序 |
| 3.2.3 prNDV/HR09全基因组cDNA转录载体的构建 |
| 3.2.3.1 片段Rr1和片段Rr2重组质粒的提取 |
| 3.2.3.2 重组质粒T-Rr12的构建 |
| 3.2.4 病毒的拯救和鉴定 |
| 3.2.4.1 细胞和转染用质粒的准备 |
| 3.2.4.2 共转染 |
| 3.2.4.3 鉴定 |
| 3.2.5 获救病毒的耐热试验 |
| 3.2.6 获救病毒的生物学特性的测定 |
| 3.2.7 获救病毒的感染性试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 片段Rr1和片段Rr2的扩增结果 |
| 3.3.2 片段Rr12的扩增结果 |
| 3.3.3 获救病毒的鉴定 |
| 3.3.4 获救病毒的耐热试验结果 |
| 3.3.5 获救病毒的生物学试验结果 |
| 3.3.6 获救病毒的细胞感染性试验结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）两株新城疫病毒诱导宿主获得性免疫及天然免疫的差异比较（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文部分缩写中英文对照 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新城疫及新城疫病毒的研究进展 |
| 1 致病性 |
| 2 临床症状和病理变化 |
| 2.1 速发嗜内脏型新城疫(VVND) |
| 2.2 速发嗜神经型新城疫(VNND) |
| 2.3 中致病性新城疫 |
| 2.4 低致病性新城疫 |
| 3 病毒结构 |
| 4 病毒分型 |
| 5 病毒基因组 |
| 5.1 NP蛋白 |
| 5.2 P、V、W蛋白 |
| 5.3 M蛋白 |
| 5.4 F蛋白 |
| 5.5 HN蛋白 |
| 5.6 L蛋白 |
| 6 流行病学 |
| 7 防治措施 |
| 参考文献 |
| 第二章 新城疫疫苗的研究进展 |
| 1 弱毒疫苗 |
| 2 灭活疫苗 |
| 3 基因工程疫苗 |
| 3.1 基因工程疫苗的作用原理 |
| 3.2 基因工程亚单位疫苗 |
| 3.3 重组活载体疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 3.5 转基因植物疫苗 |
| 3.6 提高免疫原性的方法 |
| 3.7 基因工程疫苗的安全性 |
| 参考文献 |
| 第三章 抗病毒天然免疫应答的研究进展 |
| 1 天然免疫概述 |
| 2 模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs) |
| 2.1 TLRs |
| 2.2 RLRs |
| 2.3 NLRs |
| 2.4 DNA受体 |
| 3 Ⅰ型干扰素(Interferon, IFN)调控机制 |
| 3.1 IRF家族 |
| 3.2 NF-κB家族 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 新城疫Lasota.P2M1毒株生物学特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 RNA提取及RT PCR |
| 1.3 电子显微镜分析 |
| 1.4 全基因组测序 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR |
| 2.2 病毒粒子形态学观察 |
| 2.3 全基因组测序 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 两株新城疫Lasota毒株诱导宿主获得性免疫反应的差异比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 动物免疫及攻毒 |
| 1.3 血清学检测 |
| 1.4 ELISA检测气管及十二指肠灌洗液中SIgA |
| 1.5 病毒复制情况及排毒量 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 生存曲线 |
| 2.2 血清抗体水平 |
| 2.3 气管及十二指肠SIgA |
| 2.4 组织含毒量与排毒量 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 两株新城疫Lasota毒株诱导宿主天然免疫反应的差异比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 细胞培养与处理 |
| 1.3 Real-time PCR检测天然免疫相关基因的表达 |
| 1.4 Western blotting检测天然免疫相关基因的表达 |
| 1.5 ELISA检测细胞因子表达 |
| 1.6 蛋白芯片技术检测炎症因子和趋化因子 |
| 1.7 免疫荧光检测内源性IRF3及其磷酸化表达 |
| 1.8 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 TLR3,TLR7和MDA5的mRNA在DF-1细胞中的表达 |
| 2.2 TLR3,TLR7和MDA5蛋白的表达 |
| 2.3 细胞上清、细胞内源性及磷酸化IRF3表达 |
| 2.4 细胞培养上清液中细胞因子/分子的表达谱 |
| 2.5 ELISA检测细胞因子表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 总体讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 IBD研究进展 |
| 1.1 IBD流行病学特点 |
| 1.2 IBD病原学特征 |
| 1.3 IBDV基因组结构与VP2蛋白 |
| 1.4 IBDV毒株 |
| 1.5 IBDV的诊断 |
| 1.6 IBD的防治 |
| 2 ND研究进展 |
| 2.1 ND流行病学特点 |
| 2.2 ND病原学特征 |
| 2.3 ND的诊断 |
| 2.4 ND的防制 |
| 3 ND和IBD疫苗的研究进展 |
| 3.1 IBD疫苗研究进展 |
| 3.2 ND疫苗研究进展 |
| 3.3 疫苗的基本要求 |
| 3.4 免疫失败的原因 |
| 4 疫苗免疫监测方法 |
| 5 PCR-RFLP研究进展 |
| 5.1 PCR-RFLP的基本原理 |
| 5.2 PCR-RFLP技术的应用 |
| 6 本研究目的和意义 |
| 第二章 ND-IBD二联灭活苗对100日龄种母鸡的免疫效果研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验分组 |
| 2.2 免前抗体水平检测 |
| 2.2.1 HA试验(微量法) |
| 2.2.2 HI试验(微量法) |
| 2.2.3 TCVN(固定病毒稀释血清) |
| 2.3 免后抗体水平检测 |
| 2.4 种蛋的收集 |
| 2.5 子代雏鸡抗体水平检测 |
| 2.6 攻毒保护试验 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 ND-IBD二联灭活苗对种母鸡ND抗体水平的影响 |
| 3.2 ND-IBD二联灭活苗对种母鸡IBD抗体水平的影响 |
| 3.3 四批次孵化雏鸡ND抗体水平的分析 |
| 3.4 四批次孵化雏鸡IBD抗体水平的分析 |
| 3.5 攻毒保护结果 |
| 3.6 中和试验中DF-1细胞病变观察 |
| 4 讨论 |
| 第三章 ND和IBD卵黄抗体与子代血清抗体的相关性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验分组 |
| 2.2 氯仿法提取卵黄抗体 |
| 2.3 HI试验和ELISA试验 |
| 2.4 数据处理 |
| 2.5 结果的比对 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 种蛋ND卵黄抗体与子代血清抗体水平几何均值 |
| 3.2 种蛋IBD卵黄抗体与子代血清抗体水平几何均值 |
| 3.3 免疫组种蛋ND卵黄抗体与子代血清ND抗体水平相关性分析 |
| 3.4 免疫组种蛋IBD卵黄抗体与子代血清抗体水平相关性分析 |
| 3.5 血清抗体水平与卵黄抗体水平比对结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 IBDV强弱毒株鉴别诊断方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 病毒RNA提取 |
| 2.3 RT-PCR以及PCR扩增 |
| 2.4 PCR产物测序 |
| 2.5 琼脂糖凝胶回收目的基因 |
| 2.6 限制性内切酶BamHI和PstI进行酶切 |
| 2.7 特异性试验 |
| 2.8 敏感性试验 |
| 2.9 重复性试验 |
| 2.10 病料检测 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 BC6-85和B87 VP2基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 BC6-85和B87酶切结果 |
| 3.3 特异性试验结果 |
| 3.4 敏感性试验结果 |
| 3.5 重复性试验结果 |
| 3.6 病料PCR-RFLP检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（6）陕西省鸡新城疫流行情况的病原学检测及其免疫效果分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 新城疫病毒 |
| 1.2 NDV 病原学特点 |
| 1.3 ND 流行特点 |
| 1.4 NDV 实验室检测 |
| 1.4.1 病毒分离与鉴定 |
| 1.4.2 血凝试验（HA） |
| 1.4.3 血凝抑制试验（HI） |
| 1.4.4 NDV 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR） |
| 1.4.5 NDV 实时荧光 RT-PCR |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 第二章 陕西省未发病鸡群新城疫病原学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 诊断试剂 |
| 2.1.2 主要器材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 监测点选择 |
| 2.2.2 样品采集原则 |
| 2.2.3 监测样品采集与保存 |
| 2.2.4 鸡新城疫病毒抗原检测 |
| 2.2.5 结果统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.4.1 NDV 病原检出率结果 |
| 2.4.2 不同区域 NDV 病原学阳性检出率 |
| 2.4.3 陕西省 NDV 病原学阳性样品分布特点 |
| 第三章 陕西省发病鸡群新城疫病原学调查及与免疫抗体相关性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要器材 |
| 3.1.3 病料来源 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病料采集 |
| 3.2.2 组织样品中新城疫病毒抗原检测 |
| 3.2.3 新城疫病毒抗体检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 组织样品中新城疫病毒抗原检测结果 |
| 3.3.2 鸡新城疫病毒抗体结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 陕西省鸡新城疫免疫效果评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 诊断试剂 |
| 4.1.2 主要器材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 监测点选择 |
| 4.2.2 监测样品采集保存 |
| 4.2.3 新城疫抗体血凝抑制试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论与分析 |
| 4.4.1 陕西省 NDV 抗体合格率变化趋势 |
| 4.4.2 不同区域 NDV 抗体合格率分析 |
| 4.4.3 对新城疫免疫失败的原因探讨 |
| 4.4.4 建议采取的防控措施 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 在读期间发表文章 |
| 在读期间参与编写的书籍 |
（7）犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一篇 绪论 |
| 1.1 犬瘟热概述 |
| 1.1.1 犬瘟热病毒 |
| 1.1.2 病毒分离培养 |
| 1.1.3 病毒蛋白 |
| 1.1.4 致病机理和临床特征 |
| 1.1.5 流行病学 |
| 1.1.6 犬瘟热疫苗研究现状 |
| 1.1.7 犬瘟热病毒感染性克隆研究现状 |
| 1.2 犬瘟热病毒受体研究进展 |
| 1.2.1 信号淋巴细胞激活分子 |
| 1.2.2 Nectin-4 |
| 1.2.3 其他受体 |
| 1.2.4 总结 |
| 1.3 白细胞介素 18 研究进展 |
| 1.3.1 IL-18 的发现 |
| 1.3.2 IL-18 分子结构 |
| 1.3.3 IL-18 基因及基因调节 |
| 1.3.4 IL-18 产生和递呈 |
| 1.3.5 IL-18 的生物学功能 |
| 1.3.6 IL-18 对宿主免疫保护作用 |
| 1.3.7 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 表达犬瘟热病毒 SLAM 受体的敏感细胞系构建及病毒分离与鉴定 |
| 1.1 材料方法 |
| 1.1.1 病料、质粒和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 引物的设计与合成 |
| 1.1.4 真核表达载体构建 |
| 1.1.5 表达 SLAM 蛋白 Vero 细胞系的构建 |
| 1.1.6 RT-PCR 方法鉴定 SLAM/Vero 细胞系 |
| 1.1.7 间接免疫荧光方法鉴定 |
| 1.1.8 流式细胞检测 SLAM/Vero 细胞系 |
| 1.1.9 猴源和犬源 CDV 的分离与鉴定 |
| 1.1.10 病毒在 SLAM／Vero 细胞生长特性研究 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 真核表达载体的构建 |
| 1.2.2 SLAM/Vero 细胞系的构建与鉴定 |
| 1.2.3 利用 Vero/DogSLAM 细胞系分离犬瘟热病毒 |
| 1.2.4 犬源 CDV 和猴源 CDV 对不同动物 SLAM 受体利用比较分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 现行不同疫苗株犬瘟热病毒免疫效果评价及其 H 蛋白基因特性分析研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 疫苗毒株、细胞和动物细胞、质粒与单克隆抗体 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 不同疫苗株 CDV 在犬和狐狸体内免疫效果评价 |
| 2.1.4 引物的设计与合成 |
| 2.1.5 RT-PCR 克隆 4 株疫苗株 CDV 的 H 基因 |
| 2.1.6 CDV H 基因序列分析 |
| 2.1.7 真核表达载体构建 |
| 2.1.8 细胞转染 |
| 2.1.9 间接免疫荧光检测 |
| 2.1.10 犬瘟热病毒 H 蛋白三维构象建立 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同疫苗株 CDV 在犬和狐狸体内免疫效果评估 |
| 2.2.2 PCR 扩增结果 |
| 2.2.3 不同毒株 H 基因核苷酸及其对应的氨基酸同源性比较 |
| 2.2.4 H 基因系统发生进化树分析 |
| 2.2.5 H 基因氨基酸序列分析结果 |
| 2.2.6 犬瘟热病毒 H 蛋白糖基化位点分析 |
| 2.2.7 野生株和疫苗株犬瘟热病毒 H 蛋白同源模型构建及比较 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达白细胞介素 18 的重组犬瘟热病毒感染性克隆构建与初步应用 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 病毒株，质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 引物的设计与合成 |
| 3.1.4 感染性克隆载体的构建 |
| 3.1.5 病毒的拯救 |
| 3.1.6 RT-PCR 及测序鉴定 |
| 3.1.7 Western blotting 鉴定 |
| 3.1.8 重组病毒的培养与滴定 |
| 3.1.9 重组病毒生长动力学研究 |
| 3.1.10 IL-18 的生物活性评估 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 表达犬 IL-18 基因的重组真核表达载体构建 |
| 3.2.2 不同载体体系表达的 IL-18 活性评定 |
| 3.2.3 粘附人 IL-2 信号肽的犬或鼠 IL-18 的重组犬瘟热病毒载体构建 |
| 3.2.4 重组病毒的拯救及其鉴定 |
| 3.2.5 Western blotting 鉴定重组病毒 |
| 3.2.6 重组病毒生长动力学研究 |
| 3.2.7 重组病毒分泌 IL-18 的生物活性能力检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间所得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸽新城疫的研究概况 |
| 1.1.1 病原学特性 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 临床症状和剖检病变 |
| 1.1.4 诊断 |
| 1.1.5 防治 |
| 1.2 新城疫分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 新城疫病毒的形态和分子结构蛋白及功能 |
| 1.2.2 新城疫病毒致病力的分子基础 |
| 1.2.3 新城疫的分子流行病学研究 |
| 1.2.4 鸽新城疫基因工程疫苗研究 |
| 第二章 鸽新城疫疫苗的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 制苗用毒株 |
| 2.1.1.2 试验动物 |
| 2.1.1.3 试剂药品 |
| 2.1.1.4 仪器设备 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 种毒的制备 |
| 2.1.2.2 病毒的灭活 |
| 2.1.2.3 油乳剂灭活疫苗的制备 |
| 2.1.2.4 蜂胶苗的配制 |
| 2.1.2.5 油乳剂灭活苗物理性状检验 |
| 2.1.2.6 蜂胶佐剂灭活苗物理性状检验 |
| 2.1.2.7 疫苗免疫抗体产生时间的测定 |
| 2.1.2.8 疫苗最佳免疫剂量测定 |
| 2.1.2.9 疫苗免疫持续期的测定 |
| 2.1.2.10 疫苗保存期试验 |
| 2.1.2.11 对比试验 |
| 2.1.2.12 区域试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 制苗用毒在鸡胚上增殖 |
| 2.2.2 病毒的灭活 |
| 2.2.2.1 温度对病毒灭活 |
| 2.2.2.2 甲醛对病毒灭活 |
| 2.2.2.3 安全性检查 |
| 2.2.3 油乳剂灭活疫苗物理性状检验 |
| 2.2.3.1 外观检查 |
| 2.2.3.2 粘度检验 |
| 2.2.3.3 均匀度检验 |
| 2.2.3.4 剂型检验 |
| 2.2.3.5 稳定性检验 |
| 2.2.4 蜂胶佐剂灭活疫苗物理性状检验 |
| 2.2.4.1 外观检查 |
| 2.2.4.2 无菌检验 |
| 2.2.4.3 安全性检验 |
| 2.2.4.4 急性毒性试验 |
| 2.2.5 疫苗免疫效力对比试验 |
| 2.2.6 疫苗免疫持续期试验 |
| 2.2.7 疫苗保存期试验 |
| 2.2.8 鸽源和鸡源油乳剂灭活苗对比试验 |
| 2.2.9 区域试验 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 鸽新城疫 F 基因的克隆及序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 病毒 |
| 3.1.1.2 菌株、载体 |
| 3.1.1.3 主要试剂 |
| 3.1.1.4 主要仪器 |
| 3.1.1.5 培养基与溶液配制 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 引物设计与合成 |
| 3.1.2.2 病毒 RNA 的提取 |
| 3.1.2.3 RT-PCR 扩增 |
| 3.1.2.4 基因的克隆与鉴定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 F 基因的克隆鉴定 |
| 3.2.2 F 基因 DNA 序列测定结果 |
| 3.2.3 核苷酸相似性分析 |
| 3.2.4 氨基酸序列分析 |
| 3.2.5 裂解位点的氨基酸序列分析 |
| 3.2.6 系统发育树的建立 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 鸽新城疫 F 基因的原核表达分析及其生物活性研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种、载体 |
| 4.1.2 酶与试剂 |
| 4.1.3 培养基与溶液配制 |
| 4.1.4 仪器与设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸽新城疫 F 基因原核表达载体的构建 |
| 4.2.1.1 表达引物的设计 |
| 4.2.1.2 目的片段的 PCR 扩增 |
| 4.2.1.3 进行 PCR 产物凝胶回收与纯化 |
| 4.2.1.4 目的片段和载体的酶切与回收 |
| 4.2.1.5 目的片段与载体的连接 |
| 4.2.1.6 感受态细胞的制备 |
| 4.2.1.7 连接产物的转化 |
| 4.2.1.8 重组质粒的提取 |
| 4.2.1.9 重组质粒的鉴定 |
| 4.2.2 重组菌的诱导表达与表达条件的优化 |
| 4.2.2.1 重组菌的诱导表达 |
| 4.2.2.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.2.2.3 表达条件的优化 |
| 4.2.2.4 包涵体蛋白的提取 |
| 4.2.3 ELISA 方法的初步建立 |
| 4.2.3.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 4.2.3.2 间接 ELISA 各工作条件的摸索 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.2 融合蛋白的可溶性鉴定 |
| 4.3.2.1 最佳诱导时间的确定 |
| 4.3.2.2 最佳诱导温度的确定 |
| 4.3.2.3 纯化蛋白的浓度 |
| 4.3.3 ELISA 筛选方法的建立 |
| 4.3.3.1 最佳抗原及抗体工作浓度的确定 |
| 4.3.3.2 一抗作用时间的确定 |
| 4.3.3.3 二抗作用时间的确定 |
| 4.3.3.4 底物显色液作用时间的确定 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 鸽新城疫 F 基因在毕赤酵母中的表达 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌种和载体 |
| 5.1.2 试剂和培养基 |
| 5.1.3 培养基 |
| 5.1.4 仪器与设备 |
| 5.2 重组表达载体 pPIC9K- PPMV-1-的构建 |
| 5.2.1 引物的设计与合成 |
| 5.2.1.1 目的基因的扩增 |
| 5.2.1.2 胶回收目的基因 |
| 5.2.1.3 目的基因与 pPIC9K 空载体的双酶切 |
| 5.2.1.4 双酶切目的片段与 pPIC9K 空载体的电泳回收 |
| 5.2.1.5 JM109 感受态细胞的制备 |
| 5.2.1.6 目的基因与 pPIC9K 空载体的连接 |
| 5.2.1.7 连接产物的转化 |
| 5.2.1.8 重组表达质粒的提取与鉴定 |
| 5.2.2 重组表达载体 pPIC9K- PPMV-1-F 电转化毕赤酵母 GS115 |
| 5.2.2.1 重组表达载体的线性化 |
| 5.2.2.2 毕赤酵母感受态细胞的制备 |
| 5.2.2.3 电激法转化 |
| 5.2.3 高拷贝重组酵母菌株的筛选鉴定 |
| 5.2.3.1 影印接种法筛选 G418 抗性菌株 |
| 5.2.3.2 PCR 法鉴定重组菌株 |
| 5.2.4 重组酵母菌株的诱导表达 |
| 5.2.5 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组表达质粒 pPIC9K- PPMV-1-F 的 PCR 与双酶切鉴定 |
| 5.3.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 鸽新城疫 F 基因的真核表达分析及其生物活性研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌种和载体 |
| 6.1.2 试剂和培养基 |
| 6.1.3 培养基 |
| 6.1.4 仪器与设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 鸽新城疫真核表达载体的构建 |
| 6.2.1.1 表达引物的设计 |
| 6.2.1.2 目的片段的 PCR 扩增 |
| 6.2.1.3 进行 PCR 产物凝胶回收与纯化 |
| 6.2.1.4 目的片段和载体的酶切与回收 |
| 6.2.1.5 目的片段与载体的连接 |
| 6.2.1.6 感受态细胞的制备 |
| 6.2.1.7 连接产物的转化 |
| 6.2.1.8 重组质粒的提取 |
| 6.2.1.9 重组质粒的鉴定 |
| 6.2.2 鸽新城疫真核表达质粒免疫原性研究 |
| 6.2.2.1 免疫用重组质粒的制备与纯化 |
| 6.2.2.2 动物基因免疫 |
| 6.2.2.3 攻毒保护试验 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 6.3.2 动物基因免疫 |
| 6.3.3 攻毒保护试验 |
| 6.4 分析与讨论 |
| 6.5 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（9）新城疫病毒TS09-C株全长cDNA克隆的构建及荧光定量RT-PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 略缩词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 新城疫研究现状 |
| 1.1 基因组 |
| 1.2 病毒蛋白研究现状 |
| 1.2.1 核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,NP) |
| 1.2.2 磷蛋白(Phosphoprotein,P) |
| 1.2.3 基质蛋白(Matrixprotein,M) |
| 1.2.4 融合蛋白(Fusionprotein,F) |
| 1.2.5 血凝素-神经氨酸酶蛋白(Haemagglutinin-neuraminidase,HN) |
| 1.2.6 大聚合酶蛋白(Large-protein,L) |
| 1.3 新城疫病毒培养特性 |
| 1.4 新城疫病毒耐热特性研究 |
| 2 新城疫病毒反向遗传技术研究进展 |
| 2.1 反向遗传技术应用于病毒蛋白功能的研究 |
| 2.2 新城疫病毒反向遗传技术在肿瘤治疗中的应用 |
| 2.3 反向遗传技术制备基因工程疫苗 |
| 3 荧光定量技术研究进展 |
| 3.1 染料法荧光定量技术 |
| 3.2 探针法荧光定量技术 |
| 3.2.1 TaqMan探针法 |
| 3.2.2 分子信标技术 |
| 3.2.3 杂交探针法 |
| 3.2.4 复合探针法 |
| 4 目的和意义 |
| 第二章 新城疫病毒耐热株的细胞适应培养 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 细胞及试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 红细胞的制备 |
| 1.5 BHK细胞培养 |
| 1.6 TPCK-胰酶浓度的优化 |
| 1.7 NDV TS09株在BHK细胞上的传代 |
| 1.8 NDV毒株的生物学特性测定 |
| 1.8.1 血凝活性效价(HA)测定 |
| 1.8.2 鸡胚平均致死时间(MDT)测定 |
| 1.8.3 脑内致病指数(ICPI) |
| 1.8.4 半数细胞感染剂量(TCID50)和半数鸡胚感染剂量(EID50) |
| 1.9 NDV毒株F、HN基因的扩增与测序 |
| 1.10 NDV毒株F、HN基因的序列分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 胰蛋白酶最适浓度的优化 |
| 2.2 TS09株在BHK细胞中的传代培养 |
| 2.3 TS09-C株F、HN基因的序列测定与分析 |
| 2.4 NDV毒株F基因的同源性分析 |
| 2.5 NDV毒株的遗传进化分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 NDV TS09-C株全基因组序列的测定与分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 酶和试剂 |
| 1.3 引物设计和合成 |
| 1.4 基因组全长的分段扩增和测序 |
| 1.5 NDV TS09-C株全基因组序列的分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增结果 |
| 2.2 序列分析 |
| 2.2.1 全基因组基因结构特点分析 |
| 2.2.2 同源性分析 |
| 2.2.3 系统进化分析 |
| 2.2.4 HN蛋白糖基化位点分析 |
| 2.3 耐热分析 |
| 2.3.1 氨基酸差异性分析 |
| 2.3.2 二级结构分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 引物设计 |
| 3.2 序列分析 |
| 3.3 耐热分析 |
| 第四章 NDV TS09-C株全长cDNA克隆的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 酶和试剂 |
| 1.2 引物设计 |
| 1.3 NDV TS09-C株全长cDNA克隆构建策略 |
| 1.3.1 pBR-ABC质粒的构建方案 |
| 1.3.2 pBR-DE和pBR-FG质粒的构建方案 |
| 1.3.3 全长质粒pBR-TS09-C的构建方案 |
| 1.4 病毒RNA的提取、反转录及PCR |
| 1.5 引物自延伸反应 |
| 1.6 融合PCR |
| 1.7 酶切反应 |
| 1.8 连接反应 |
| 1.9 DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.10 转化实验 |
| 1.11 测序分析 |
| 1.12 质粒稳定性测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的片段的扩增 |
| 2.2 构建各质粒的酶切鉴定 |
| 2.3 测序分析 |
| 2.4 质粒稳定性试验 |
| 3 讨论 |
| 3.1 全长cDNA克隆的构建思路 |
| 3.2 PCR扩增以及产物的连接 |
| 3.3 质粒的酶切鉴定及测序 |
| 第五章 新城疫荧光定量检测的建立 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病毒和样品 |
| 1.2 试剂和主要仪器 |
| 1.3 引物及探针的设计合成 |
| 1.4 病毒、细菌核酸提取 |
| 1.5 荧光RT-PCR方法的建立 |
| 1.6 标准品的制备 |
| 1.7 灵敏性试验及标准曲线的绘制 |
| 1.8 临床应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 荧光反应条件的优化 |
| 2.2 灵敏性实验 |
| 2.3 特异性实验 |
| 2.4 重复性实验 |
| 2.5 临床样品检测结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 硕士期间发表文情况 |
（10）鹅副粘病毒E01株HN蛋白的表达及其相关免疫效果的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 动物副粘病毒病的国内外研究进展 |
| 1 动物副粘病毒病概述 |
| 1.1 禽副粘病毒病的发展史 |
| 1.2 其它副粘病毒病的发展史 |
| 1.3 鹅副粘病毒病研究现状 |
| 2 NDV HN蛋白概述 |
| 2.1 NDV HN蛋白的结构特点 |
| 2.2 NDV HN蛋白的基本性质功能 |
| 3 GPMV E01株研究进展 |
| 4 NDV疫苗研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 活疫苗 |
| 4.3 基因工程疫苗 |
| 5 DNA疫苗 |
| 5.1 DNA疫苗的研究历史 |
| 5.2 AMPVI病的DNA疫苗研究现状 |
| 6 研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验部分 |
| 第二章 鹅副粘病毒E01株HN蛋白基因的克隆及序列分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 酶切鉴定结果 |
| 2.3 序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 鹅副粘病毒E01株HN蛋白的原核表达 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HN基因的扩增 |
| 2.2 HN基因重组原核表达载体的鉴定 |
| 2.3 HN蛋白时间梯度诱导表达分析 |
| 2.4 表达蛋白存在位置 |
| 2.5 Western blot检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第四章 鹅副粘病毒E01株HN基因真核表达载体的构建及其在vero细胞中的瞬时表达 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HN基因重组真核表达载体的鉴定 |
| 2.2 间接免疫荧光结果 |
| 2.3 RT-PCR反应结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第五章 鹅副粘病毒E01株HN基因DNA疫苗与HN蛋白免疫效果的初步研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫病毒特异的血清IgG抗体的ELISA检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、新城疫病毒B_(95)株的RT-PCR检测（论文参考文献）
- [1]以耐热新城疫病毒为载体的Ⅰ群禽腺病毒（4型、8b型）活疫苗的研制[D]. 李保珍. 扬州大学, 2019(06)
- [2]鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用[J]. 谢晶,于吉锋,周泷,曹冶,林毅,李兴玉,肖璐,叶勇刚,潘梦,康润敏. 中国畜牧兽医, 2019(02)
- [3]新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建[D]. 刘倩. 扬州大学, 2017(02)
- [4]两株新城疫病毒诱导宿主获得性免疫及天然免疫的差异比较[D]. 陈林子. 南京农业大学, 2017(07)
- [5]ND-IBD二联灭活苗对种母鸡的免疫效果及IBDV强弱毒株鉴别诊断研究[D]. 赖隆永. 福建农林大学, 2017(01)
- [6]陕西省鸡新城疫流行情况的病原学检测及其免疫效果分析[D]. 刘浩. 西北农林科技大学, 2014(03)
- [7]犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究[D]. 刘玉秀. 吉林大学, 2014(01)
- [8]鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究[D]. 贺奋义. 甘肃农业大学, 2012(07)
- [9]新城疫病毒TS09-C株全长cDNA克隆的构建及荧光定量RT-PCR检测方法的建立[D]. 商雨. 华中农业大学, 2012(02)
- [10]鹅副粘病毒E01株HN蛋白的表达及其相关免疫效果的初步研究[D]. 李彤彤. 南京农业大学, 2011(01)