一、NAC对大鼠I/R心肌细胞凋亡及bad、bak、bax的影响（论文文献综述）
柴晶美[1]（2021）在《基于线粒体功能探讨二参颗粒对心肌缺血模型的保护作用及相关机制研究》文中研究指明目的:本课题通过体内、外实验,利用病理学、分子生物学等分析方法,主要从氧化应激、凋亡、线粒体能量代谢、线粒体生物发生等方面证实二参颗粒的作用机制。探讨二参颗粒靶向调节SIRT1-PGC-1α-PPARα信号通路在心肌缺血中的作用机制,为二参颗粒治疗冠心病心肌缺血临床推广应用提供了实验依据。方法:1.参照《中国药典》2020版各药材含量测定方法、《香港药典》各药材液相指纹图谱检测方法,对二参颗粒进行高效液相指纹图谱实验,同时利用标准对照品确认有效成分的特征峰。再利用网络药理学通过TCMSP平台探索二参颗粒有效化学成分,在Genen Card数据库中搜索与冠心病心肌缺血的相关基因,构建化学成分-作用靶点网络图、PPI网络图;借助DAVID进行KEGG和GO富集分析,利用Schrodinger Maestro软件和在线工具进行分子对接验证,预测核心靶点。2.采用氯化钴建立心肌细胞缺氧缺血模型,采用酶联免疫法检测LDH,CK含量,SOD、MDA活性,采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况,采用流式细胞术检测胞内活性氧含量和凋亡水平,采用蛋白质印迹分析细胞内Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Bcl-2/Bax的表达水平。3.采用酶联免疫法检测线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ活性,应用Cytation5检测ATP含量,采用流式细胞术检测心肌胞线粒体膜电位（MMP）,采用蛋白质印迹分析细胞内PGC-1α、PPARα、SIRT1的表达水平。采用RT-PCR检测法检测SIRT1、PPARα、PGC-1α基因表达水平。4.通过腹腔注射垂体后叶素形成大鼠心肌缺血模型。检测二参颗粒对心肌缺血大鼠心电图的影响,采用HE染色检测法观察心肌组织病理形态变化,Masson染色检测法观察心肌组织纤维化程度,采用蛋白质印迹分析大鼠心肌组织中SIRT1、PGC-1α、PPARα的表达水平。采用RT-PCR检测法检测大鼠心肌组织中SIRT1、PGC-1α、PPARα基因表达水平。结果:1.采用《药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版》对10批样品指纹图谱进行计算,相似度达0.997以上,具有良好的重现性,成分稳定。网络药理学结果,共筛选出221个化合物与264个靶点蛋白参与网络构建,基因富集分析显示,涉及960个GO条目,涉及KEGG信号通路共726条,分子对接结果表明,核心靶点与化学成分有较强的结合能力。并推断SIRT1-PGC-1α-PPARα信号通路可能是二参颗粒改善冠心病心肌缺血的核心潜在靶点。2.二参颗粒能有效降低细胞LDH、MDA、CK水平（P<0.05）,升高SOD水平（P<0.01或P<0.001）,明显降低胞内ROS含量（P<0.01或P<0.001）,减少凋亡细胞的表达（P<0.01或P<0.001）,下调凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的表达,增加Bcl-2/Bax的表达（P<0.01或P<0.001）。3.二参颗粒能有效增加线粒ComplexⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ活性（P<0.05）,增加ATP含量（P<0.001）,升高线粒体膜电位水平,增加心肌细胞中目的蛋白PGC-1α、PPARα的表达（P<0.01或P<0.001）,增加心肌细胞中目的基因SIRT1、PGC-1α、PPARα的表达（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。4.二参颗粒能有效改善心肌缺血大鼠的心电图改变。HE染色结果显示,模型组可见心肌细胞脂肪变性,心肌纤维水肿,着色变浅,淋巴细胞和肥大细胞点状浸润,多处心肌纤维溶解出现增生的结缔组织;与模型组比较,低剂量组可见心肌细胞脂肪变性,淋巴细胞和肥大细胞点状浸润,多处心肌纤维溶解出现增生的结缔组织。中剂量组心肌纤维分解清晰,染色均匀,少量水肿和淋巴细胞。高剂量组组织染色均匀,心肌纤维形态结构分界清晰,间质未见明显异常。Masson染色结果显示,模型组心肌组织局部可见胶原纤维增加,心肌纤维形态结构排列紊乱,胶原纤维增多、增粗,心肌纤维化明显。通过不同剂量二参颗粒干预后,二参颗粒低剂量组肌仍可见胶原纤维增多、增粗,心肌纤维化明显。二参颗粒中、高剂量组大鼠心肌组织中仅见轻度胶原纤维增生,纤维化程度明显减轻。二参颗粒能明显增加目的蛋白SIRT1、PGC-1α、PPARα的表达（P<0.01或P<0.001）,增加目的基因SIRT1、PGC-1α、PPARα的表达（P<0.05或P<0.01）。结论:1.初步明确了二参颗粒可以抑制Co Cl2诱导的心肌细胞ROS水平,从而达到降低氧化应激介导的心肌细胞凋亡的作用。2.二参颗粒通过促进SIRT1-PGC-1α-PPARα信号通路的激活,改善心肌缺血大鼠的组织形态变化以及心肌组织纤维化程度,增加线粒体呼吸链复合物的活性,促进ATP的合成,从而达到改善心脏功能的作用。
张洋[2]（2021）在《罗布麻叶总黄酮及异槲皮苷对吡柔比星致心脏损伤的保护作用和机制》文中进行了进一步梳理蒽环类药物,包括多柔比星（Doxorubicin,DOX）、表柔比星（Epirubicin,EPI）、吡柔比星（Pirarubicin,THP）等,广泛用于实体恶性肿瘤和血液系统肿瘤的治疗,但是蒽环类药物的心脏毒性在一定程度上限制了其临床应用。右雷佐生（Dexrazoxane,DZR）是目前FDA唯一批准使用的心脏保护药,但有报道发现DZR可能会加重化疗药物引起的骨髓抑制,并诱发第二癌的发生。因此,寻求一种减轻蒽环类药物所致心脏损伤的药物显得尤为重要。罗布麻叶总黄酮（AVLE）为罗布麻叶的主要活性成分,具有抗高血压、抗焦虑、抗抑郁和保护心脏等药理作用,随着对AVLE研究的不断深入,其对心血管系统疾病的防治作用已成为研究热点。异槲皮苷,又称槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Isoquercitrin,IQC）是一种天然黄酮类化合物,是AVLE中有效成份之一,广泛存在于水果、蔬菜、谷物和多种饮品中,具有抗氧化应激、抗肿瘤、保护心血管、降血糖及抗过敏等多种药理作用。非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）在许多重要生命活动中发挥功能,随着微小RNA（microRNA,miRNA）在人类疾病中的作用逐渐被揭示,深化miRNA的研究对于理解疾病发生发展的分子机制具有现实意义。本研究首先通过体内、外实验探讨IQC和AVLE对THP诱导的心脏损伤的保护作用及机制,然后通过生物信息学分析构建miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路,以此信号通路为切入点,利用AKT阻断剂及miRNA过表达/沉默瞬转细胞,从细胞水平加以验证,以期为开发和利用以IQC和AVLE为药效成分的中药资源提供科学依据。研究分为5部分:（1）AVLE对THP诱导大鼠心脏损伤的保护作用及机制首先预防性灌胃给予大鼠不同剂量的AVLE 1w,然后尾静脉注射THP（3mg/kg/w,6w）建立大鼠慢性心脏损伤模型,同时继续灌胃给予大鼠AVLE。观察大鼠心电图和大鼠心脏组织形态变化,并对血液动力学、血清BNP、CK-MB、CTn T和LDH水平、氧化应激相关指标、心肌线粒体膜m RNA水平及AKT/Bcl-2信号通路相关蛋白进行检测,探讨AVLE对THP诱导大鼠心肌损伤的保护作用及其可能的分子机制。结果如下:（1）AVLE中、高剂量组可提高THP所致心脏损伤大鼠的心率,减轻QRS波群改变,降低LVEDP,提高LVSP和±dp/dtmax水平;降低血清BNP、CK-MB、CTn T和LDH水平,提高SOD活性,降低MDA含量;改善THP所致的心肌病理学改变;降低心脏组织内线粒体膜VDAC1、ANT1和CYPD m RNA的表达,改善线粒体膜通透性。AVLE低剂量组对上述指标改善不明显。（2）AVLE抑制Cyt c由线粒体向胞浆的释放;提高pro-caspase-9、pro-caspase-3、p-AKT和Bcl-2蛋白的表达,降低Bax、cleaved-caspase-3的蛋白水平,减轻THP诱导心脏组织细胞凋亡的发生。（2）AVLE的制备及成份分析采用醇提法制备AVL提取物,大孔树脂进行纯化,富集其中黄酮类化合物。利用液相色谱-质谱串联法（HPLC-ESI-MS/MS）和高效液相色谱法（HPLC）分析技术对AVLE进行定性和定量分析。结果如下:AVLE中含有7个黄酮类化合物,随后对其中4个主要单体化合物进行定量分析,确定IQC为AVLE中含量最多的化合物。（3）AKT在AVLE和IQC保护THP诱导H9c2细胞损伤中的作用以THP诱导H9c2细胞损伤,加入IQC/AVLE及AKT inhibitor,应用MTT、DCFH-DA荧光探针、ELISA、Mito-Tracker Red CMXRos探针、JC-1探针、TUNEL、RT-qPCR、Western blot等方法,探讨AKT在AVLE和IQC保护THP诱导H9c2细胞损伤中的作用。结果如下:（1）IQC（5～500μM）和AVLE（5～400μg/ml）在不同时间点（6、12、24及36h）对H9c2细胞无毒性作用;以5μM THP处理H9c2细胞24h,可使细胞发生凋亡,存活率降低;而IQC和AVLE均可抑制THP诱导的H9c2细胞损伤,最佳给药浓度及时间为70μM及70μg/ml,24h。IQC或AVLE均可降低THP处理H9c2细胞内ROS含量,提高SOD活性,降低MDA含量;提高H9c2细胞内线粒体活力,改善细胞线粒体膜电位,降低线粒体膜相关基因的表达。（2）IQC和AVLE提高H9c2细胞内pAKT的蛋白表达,抑制Cyt c由细胞线粒体向胞浆释放,降低细胞凋亡率,同时降低胞浆内cleaved-caspase-3蛋白表达水平,提高pro-caspase-9和procaspase-3的蛋白水平和Bcl-2/Bax的蛋白比值;应用AKT inhibitor可阻断IQC或AVLE对THP诱导细胞损伤的保护作用,说明AKT为IQC或AVLE发挥心脏保护作用的节点分子。（4）THP诱导大鼠心脏损伤miRNA芯片生物信息学分析及miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路的构建和验证对课题组前期构建THP所致大鼠心脏损伤的miRNA表达谱进行分析,最终确定miR-190a-5p作为研究对象。通过对miR-190a-5p靶基因预测和KEGG富集分析,发现在Phlpp1 m RNA的3’UTR处有miR-190a-5p的潜在结合位点,靶向性较好,且Phlpp1位于AKT上游调控分子中;同时搜索AVL靶基因并对其进行KEGG富集分析,结果发现AVL可参与调控AKT及其下游Bcl-2家族蛋白。因此,构建出miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路。采用RT-qPCR和Western blot法对预测得到的miR-190a-5p及其靶基因Phlpp1在THP所致大鼠心脏损伤组织/H9c2细胞中进行初步验证,结果发现IQC和AVLE可提高miR-190a-5p的表达,抑制Phlpp1基因和蛋白表达。采用双荧光素酶报告基因实验证实,miR-190-5p可直接调控Phlpp1,且只有唯一一个结合位点。（5）miR-190a-5p在THP诱导H9c2细胞损伤中的作用及机制通过构建miR-190a-5p过表达/沉默瞬转H9c2细胞,采用DCFH-DA探针、ELISA、Mito-Tracker Red CMXRos探针、JC-1探针、RT-qPCR、TUNEL和Western blot实验方法,探讨miR-190a-5p在THP处理H9c2细胞损伤中的作用及机制。结果如下:（1）miR-190a-5p mimics降低H9c2细胞内ROS的含量,提高SOD活性,降低MDA含量;同时提高H9c2细胞线粒体活力和膜电位,降低线粒体膜基因的表达;而转染miR-190a-5p inhibitor对THP处理H9c2细胞无改善作用。（2）miR-190a-5p mimics升高H9c2细胞内miR-190a-5p的表达,抑制Phlpp1基因及蛋白,升高p-AKT蛋白表达,并抑制Cyt c由线粒体向胞浆释放,降低细胞凋亡率,同时降低胞浆内cleaved-caspase-3蛋白表达,提高procaspase-9和pro-caspase-3的蛋白水平和Bcl-2/Bax蛋白比值;而转染miR-190a-5p inhibitor对THP处理的H9c2细胞中上述基因及蛋白无改善作用。综上所述:本研究分别从整体动物水平和细胞水平探讨IQC和AVLE对THP诱导大鼠心脏组织/H9c2细胞损伤的保护作用及其机制,所得结论如下:1.在体内研究中,AVLE对THP所致大鼠心肌损伤具有保护作用。2.通过对AVLE进行定性和定量分析,推测出7个黄酮类化合物,其中IQC是含量最多的化合物,为16.7%。3.在体外研究中,IQC和AVLE对THP诱导的H9c2细胞的损伤具有保护作用,且二者的保护作用相等。4.IQC和AVLE对THP诱导心脏/心肌细胞损伤的保护作用是通过调控miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路实现的,且AKT为二者发挥心脏保护作用的节点分子。
张铭珺[3]（2021）在《PHLPP1及达格列净在糖尿病心肌病中的作用及其机制研究》文中研究说明研究背景糖尿病心肌病（Diabeticcardiomyopathy,DCM）是糖尿病患者的严重并发症,为糖尿病患者排除高血压、冠心病等疾病,出现心脏结构及功能损害。研究表明,慢性高糖血症是DCM发生发展的病生基础。高糖血症引起细胞内晚期糖化终产物集聚、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）生成增加,并引发氧化应激反应和慢性低度炎症反应,从而影响细胞正常的生理功能及细胞周期。心脏含心肌细胞及非心肌细胞,其中非心肌细胞主要为心脏成纤维细胞。在细胞间,胶原蛋白及纤维连接蛋白等大分子物质组成细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）。糖尿病状态下,慢性高糖血症引起心肌细胞凋亡、心脏成纤维细胞胶原合成增加、ECM成分发生变化,导致心肌间质纤维化、心室重构,并最终发生心力衰竭。自DCM提出的四十多年中,尽管已有众多专家学者研究过DCM,但由于其病理生理变化独特、复杂,且尚缺乏有效的检测指标及诊断方法,因此,仍需更进一步研究其具体发病机制及分子治疗靶点。PH结构域富含亮氨酸重复序列的蛋白磷酸酶1（Pleckstrin homology domain leucine-rich repeatprotein phosphatase 1,PHLPP1）属于金属依赖蛋白磷酸酶（Protein phosphatase metal-dependent,PPM）家族中的一员,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在调节细胞存活中发挥重要作用。研究表明,PHLPP1在哺乳动物细胞内广泛表达,并主要分布于细胞的膜、质、核结构中。肿瘤相关研究中发现,癌细胞中PHLPP1表达减少或缺失,而提高PHLPP1表达可直接使Akt（Ser473）去磷酸化,通过抑制该激酶活性进而诱导肿瘤细胞凋亡,发挥抑癌作用。还有研究表明,缺血/再灌注损伤动物模型中PHLPP1表达增加。此外,胰岛素作用受损可能会增加肥胖患者脂肪和肌肉组织中的PHLPP1表达。然而,PHLPP1在DCM心肌组织中的表达水平尚未见报道。PI3K/Akt/mTOR信号通路在调控细胞转录、代谢、存活和炎症反应中起重要作用。糖尿病状态下,胰岛素信号受损下调了 PI3K活性,导致PI3K/Akt/mTOR信号通路失活。虽有实验证明,PHLPP1对Akt的调控与肿瘤细胞存活密切相关。然而,PHLPP1在DCM中的作用以及PHLPP1与PI3K/Akt/mTOR信号通路对DCM中心肌细胞凋亡的作用尚不清楚。本实验通过构建DCM大鼠模型以及高糖处理原代心肌细胞和H9c2细胞,利用慢病毒或小干扰RNA调控PHLPP1表达,以探究PHLPP1在DCM中的作用及分子生物学机制。研究目的体内实验通过建立DCM大鼠模型,利用PHLPP1-shRNA慢病毒下调其心肌组织中PHLPP1的表达,以探究PHLPP1在DCM中的作用及机制。体外实验利用糖刺激处理原代心肌细胞及H9c2细胞,探究糖刺激对心肌细胞PHLPP1表达的影响。随后利用PHLPP1-siRNA下调心肌细胞中PHLPP1表达,通过LY294002抑制PI3 K/Akt/mTOR通路活性,以探究PHLPP1对高糖刺激下心肌细胞凋亡的作用及分子机制。研究方法体外实验取4周龄大小,体重约100g-120g的SD大鼠,随机分为:对照组（Control组,n=15）,糖尿病模型组（DM组,n=45）。模型鼠腹腔注射0.5mL的STZ缓冲液（60mg/kg）,对照大鼠注射等体积的柠檬酸缓冲液。造模成功12周后,模型组随机分为:DM组,病毒空载体组（DM+shN.C组）,shPHLPP1 慢病毒组（DM+shPHLPP1）,每组各 1 5 只。DM+shPHLPP1 组大鼠施以颈静脉注射1*108UT的shPHLPP1慢病毒,同时DM+shN.C组注射等体积空载体。慢病毒干预4周后,行心脏超声评估各组大鼠的心脏功能。而后将所有大鼠安乐死,取材称重以计算各组大鼠的心脏质量与体重之比。通过实时定量RT-PCR检测心脏重构因子β-MHC和BNP的mRNA表达水平,用于评估各组大鼠的心室重构程度。通过组织学染色、蛋白质印迹等分子生物学实验方法,检测各组大鼠心肌组织中的心肌细胞凋亡及纤维化水平。体外实验通过差速贴壁分离法提取NRCMs,传代培养H9c2细胞。通过时间梯度糖刺激,利用蛋白质印迹检测及免疫荧光染色,探究高糖刺激对心肌细胞中PHLPP1表达水平及分布的影响。随后利用PHLPP1-siRNA下调心肌细胞中PHLPP1的表达,通过TUNEL染色及蛋白质印迹检测,探究PHLPP1在高糖刺激下心肌细胞凋亡中的作用,以及PHLPP1对PI3K/Akt/mTOR通路的影响。为进一步探究抑制PHLPP1表达在心肌细胞凋亡中的机制,利用LY294002（25μmol/L）预处理 H9c2 细胞,以抑制 PI3K/Akt/mTOR 通路活性。通过TUNEL染色及蛋白质印迹检测,验抑制PHLPP1表达在高糖刺激下心肌细胞凋亡中的具体作用机制。研究结果1.糖尿病大鼠心肌组织PHLPP1表达增加,抑制PHLPP1延缓糖尿病大鼠心室重构免疫组化及蛋白质印迹检测显示,DM大鼠心肌组织的PHLLP1表达量显着高于对照组。此外,DM大鼠的心身比较正常对照大鼠显着增加。同时,与对照组相比,DM大鼠的心肌组织明显肥大。HE染色还显示,DM大鼠的心脏呈向心性肥厚,其心肌细胞的直径明显高于Control组。与Control组相比,心脏重构因子β-MHC和BNP的mRNA表达水平在DM大鼠体内也显着上升。而利用shPHLPP1下调DM大鼠PHLPP1的体内表达后,上述变化明显改善。2.抑制PHLPP1表达可改善糖尿病大鼠的心功能障碍心脏彩超显示,DM大鼠出现左室功能异常,主要变现为LVEDd较Control组增大,而FS、LVEF及二尖瓣E/A、二尖瓣e’/a’均显着低于Control组。利用PHLPP1慢病毒抑制PHLPP1表达后,上述左室功能指标的变化有所逆转。3.抑制PHLPP1可改善糖尿病诱导的心肌纤维化马森染色及天狼星红染色结果显示,DM大鼠心肌组织胶原沉积及纤维化的程度显着高于正常大鼠。免疫组化染色及蛋白质印迹结果还显示,DM大鼠心肌中Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的含量显着高于Control组,且MMP2及MMP9的表达水平较Control组也明显增高。而抑制DM大鼠PHLPP1的表达可显着改善糖尿病引起的上述心肌纤维化改变。4.抑制PHLPP1可降低糖尿病引起的心肌细胞凋亡TUNEL检测及凋亡指标的蛋白质印迹结果显示,DM大鼠心肌细胞的凋亡水平较Control组显着增高,抑制PHLPP1表达可降低糖尿病引起的心肌细胞凋亡。5.高糖刺激增加心肌细胞中PHLPP1表达免疫荧光结果提示,PHLPP1在心肌细胞的膜、质、核均有表达。Western bolt检测分析提示,NRCMs及H9c2细胞中PHLPP1的表达水平随糖刺激时间的延长而显着增加。高糖刺激48小时后,心肌细胞中PHLPP1的表达水平显着高于低糖组。6.HG通过促进心肌细胞中ROS的生成增加PHLPP1表达ROS检测显示,高糖处理促进心肌细胞中ROS生成。同时,Western blot结果还显示,高糖组PHLPP1的表达水平也显着升高。NAC预处理可减少高糖诱导的心肌细胞ROS生成增加,并抑制高糖诱导的心肌细胞PHLPP1表达增加。7.抑制PHLPP1表达可抑制HG诱导的心肌细胞凋亡TUNEL染色显示,高糖处理后心肌细胞凋亡率显着高于正常糖浓度（NG）组。同时,蛋白质印迹结果显示高糖组的凋亡指标（cleaved caspase3、Bax/Bcl-2）显着增加。利用PHLPP1-siRNA下调心肌细胞PHLPP1表达后,上述指标的表达显着低于空载体对照组。8.PHLPP1通过Pl3K/Akt通路,参与HG诱导的心肌细胞凋亡Western blot结果显示,高糖处理导致H9c2细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路活性降低。利用PHLPP1-siRNA下调PHLPP1蛋白表达后,心肌细胞PI3K、Akt及mTOR的磷酸化水平增加。随后将H9c2细胞分为4组:HG+siN.C、HG+siN.C+LY294002、HG+siPHLPP1 及 HG+siPHLPP1+LY294002。利用LY294002（25μmol/L）预处理心肌细胞,以抑制PI3K/Akt/mTOR通路活性。TUNEL染色及Western blot实验结果显示,高糖条件下沉默PHLPP1表达,可抑制糖刺下心肌细胞凋亡。蛋白质印迹证明,高糖下,LY294002的使用可部分逆转抑制PHLPP1产生的抗凋亡作用。研究结论（1）PHLPP1在糖尿病大鼠心肌组织中的表达水平显着升高。（2）糖尿病大鼠发生心室重构及心功能障碍,沉默PHLPP1表达可显着改善糖尿病引起的心室重构及心功能异常。（3）糖尿病大鼠存在心肌间质纤维化及心肌细胞凋亡等病理变化,沉默PHLPP1表达可抑制糖尿病诱导的心肌细胞凋亡及间质纤维化。（4）PHLPP1在原代心肌细胞及H9c2细胞的膜、质、核结构中均有表达。高糖刺激可通过促进心肌细胞ROS生成,显着提高PHLPP1的表达。（5）沉默PHLPP1表达可通过激活PI3K/Akt/mTOR通路,抑制高糖刺激下的心肌细胞凋亡。研究背景糖尿病（Diabetes mellitus,DM）作为一种代谢相关疾病,可导致包括心血管系统在内的多器官、多系统损害及功能障碍。研究表明,糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy,DCM）是糖尿病患者的一种严重靶器官损害。DCM是指无潜在冠心病、高血压等病变基础上发生的原发性心脏功能障碍。近年来,由于糖尿病的发病率逐年上升,且DCM患者发生心力衰竭及全因死亡的风险显着升高,因此,防治糖尿病及其并发症,尤其是防治糖尿病心肌病已成为当前全球范围内的研究热点。在代谢障碍、氧化应激及慢性炎症等多种机制作用下,DCM早期主要表现为无症状的心肌纤维化。随病程进展,其心脏功能由代偿进入失代偿,并出现左室肥厚、心室重构及心功能障碍等病理改变。然而截至目前,DCM仍缺乏有效的检测指标及诊治方案,其治疗措施仍以控制血糖为主。达格列净是我国上市最早的钠-葡萄糖共转运蛋白2（Sodium-glucose co-transpoter 2,SGLT2）抑制剂类药物,可降低葡萄糖重吸收,从而降低血糖。目前,达格列净主要用于2型糖尿病患者的血糖控制。多项临床研究及荟萃分析结果显示,达格列净治疗有助于DM患者减轻体重,还可降低糖尿病合并高血压患者的血压水平,并通过抗炎、降血脂,进而降低血栓形成的风险。此外,达格列净还可优化心脏的能量代谢、改善糖超载及胰岛素抵抗,从而改善2型糖尿病患者的心脏功能,减少其心力衰竭的发生。由于其显着而独特的心血管保护效应,使得达格列净在心血管界受到广泛关注。虽然已有众多研究学者证明达格列净可通过发挥降糖、抗炎、抗氧化、减少细胞凋亡等作用,延缓糖尿病心肌病的发生发展,但目前其具体分子生物学机制仍未明确。研究表明,Wnt/β-catenin通路在多种组织的纤维化病变过程中发挥重要作用。致纤维化刺激使得糖蛋白Wnt3与Frizzled受体结合形成复合物,引起丝氨酸/苏氨酸激酶GSK-3β磷酸化。当GSK-3β磷酸化失活,便无法降解β-catenin,引起β-catenin在细胞质中过度积聚,并易位入核,结合到下游因子的转录区域,增加下游因子的表达。研究报道,达格列净可通过抑制Nlrp3/ACS炎症小体活化,发挥抗DCM的作用。另有专家证实,达格列净能通过调节Zn2+转运蛋白的表达,抑制氧化应激,从而延缓DCM的病程。此外还有研究表明,恩格列净能通过降低Wnt的蛋白表达,抑制肾脏纤维化。卡格列净能通过降低肝癌细胞中β-catenin的蛋白表达,发挥抗肝细胞癌的作用。因此,我们推测,达格列净也可作用于Wnt/β-catenin信号通路,并借此抑制DCM的纤维化进程。本实验通过为期6周的高糖高脂饮食（High-sugar-fat diet,HSFD）联合腹腔注射适当剂量的链脲佐霉素（STZ）,构建DCM大鼠模型;提取原代心脏成纤维细胞（Cardiac fibroblasts,CFs）并进行高糖处理。通过达格列净药物干预DCM大鼠及高糖处理的CFs,以探究达格列净在DCM纤维化病变过程中的作用及分子机制。研究目的体内实验通过建立2型糖尿病大鼠模型,并给予达格列净药物治疗,探究达格列净治疗对糖尿病大鼠心肌间质纤维化的作用及机制。体外实验通过提取原代心脏成纤维细胞,利用高糖刺激联合达格列净干预,探究达格列净对高糖刺激下CFs胶原合成的作用及分子机制。研究方法体内实验取4周龄大小,体重约100g-120g的SD实验大鼠,随机分为3组:对照（Control）组,糖尿病（DM）组和糖尿病+达格列净（DM+DAPA）治疗组。糖尿病模型组进行高糖高脂饮食（HSFD）。6周后,所有大鼠行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）及胰岛素耐量试验（IPITT）。对出现胰岛素抵抗的大鼠腹腔注射35mg/kg剂量的STZ缓冲液。造模8周后,DM+DAPA组随饮水给予1mg/（kg·d）的达格列净治疗。药物干预8周后再次实施IPITT、IPGTT。通过心脏超声检测以评估各组大鼠的心脏功能。随后安乐死所有大鼠,留取心尖血用于血清学检测,以评估达格列净对DM大鼠血清学指标的影响。留取心肌组织并制备石蜡切片,行组织学检测评估心肌间质的胶原沉积和纤维化水平。留取大鼠心尖组织以提取左室组织蛋白,运用蛋白质印迹实验进行Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、β-catenin、p-GSK-3β、GSK-3β 等蛋白的表达情况检测。体外实验取2-3天的SD大鼠新生鼠,差速贴壁分离法留取CFs。鉴定所提CFs的细胞纯度后,取第4-8代的CFs进行糖刺激或糖刺激联合不同浓度的达格列净干预。随后提取细胞总蛋白,进行蛋白质印迹检测细胞中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、β-catenin、p-GSK-3β、GSK-3β 的蛋白表达水平。研究结果1.高糖高脂饮食6周后模型组大鼠出现胰岛素抵抗对照组和模型组分别给予普通饮食和高糖高脂肪饮食（HSFD）。差别饮食6周后,IPGTT结果显示,HSFD组的血糖增幅显着高于Control组,其曲线下面积（Area under curve,AUC）也显着高于Control组。IPITT结果显示HSFD组血糖下降幅度小于正常饮食组,且AUC较Control组显着增加。以上结果提示,6周HSFD后模型大鼠出现胰岛素抵抗。2.达格列净治疗改善糖尿病大鼠的糖、脂代谢实验末期,DM大鼠出现多饮、多食、多尿等特征性表现。模型组进行高糖高脂饮食22周后,再次对各组大鼠进行了 IPGTT及IPITT.IPGTT结果显示,DM大鼠的血糖曲线达峰延迟,各检测时间点的血糖水平均高于正常大鼠。且DM组IPGTT及IPITT检测的曲线下面积（Area under curve,AUC）较Control组显着增加,达格列净治疗组的AUC较未治疗组显着降低。血清学指标检测结果显示,DM组的FBG、TG、TC均显着高于Control组。1mg/（kg·d）达格列净治疗8周可显着降低DM大鼠的FBG、TG,但本实验中达格列净治疗对TC的影响尚未具统计学意义。3.达格列净治疗缓解糖尿病诱导的心室重构及心脏功能受损实验末,DM大鼠的心身比显着高于Control组。心脏图片及HE染色显示,DM大鼠的心脏增大且其心肌细胞直径显着高于正常大鼠。达格列净治疗可显着缓解上述改变。心脏超声结果显示,与Control组相比,DM大鼠的FS、LVEF及二尖瓣E/A、e’/a’显着降低,LVEDd显着增大;8周达格列净治疗可在一定程度上逆转上述指标的变化。4.达格列净治疗改善糖尿病大鼠的心脏纤维化Masson及天狼星红染色结果显示,对比Control组,DM大鼠出现心肌间质纤维化,细胞外基质含量增加等改变。达格列净治疗后,DM+DAPA组的纤维化程度显着低于DM组。免疫组化及蛋白质印迹结果显示,DM组I、Ⅲ型胶原的表达水平显着高于Control组,达格列净治疗可降低上述指标的变化。5.达格列净通过Wnt/β-catenin通路抑制糖尿病诱导的心脏胶原沉积提取大鼠心肌组织蛋白,BCA法测蛋白浓度后进行Western blot检测。Image J 灰度值分析显示 DM 组大鼠的 Wnt3、β-catenin 及 p-GSK-3β/GSK-3β显着高于Control组,DM+DAPA组Wnt3、β-catenin的表达水平及p-GSK-3β/GSK-3β比值显着低于DM组。6.达格列净干预可降低高糖处理下CFs胶原合成增加将CFs随机分为4组:LG组、HG组以及HG+不同浓度达格列净处理组。甘露醇平衡渗透压。Western blot结果显示,相比LG组,HG组 CollagenI、CollagenⅢ的表达水平显着增高。达格列净处理后,高糖环境下CFs的胶原合成水平显着低于未处理组,且浓度为10μmol/L时,达格列净降低CFs胶原合成的效果最佳。7.达格列净通过Wnt/β-catenin通路影响心脏成纤维细胞胶原合成Western blot结果显示,HG组心脏成纤维细胞Wnt3、β-catenin的表达水平显着高于LG组,p-GSK-3β/GSK-3β值显着高于LG组。达格列净处理可部分逆转上述指标的变化。研究结论（1）达格列净可改善糖尿病大鼠的心室重构及心脏功能。（2）达格列净可通过抑制Wnt/β-catenin通路改善糖尿病大鼠心肌间质纤维化。（3）达格列净可通过抑制Wnt/β-catenin通路降低高糖诱导的心脏成纤维细胞胶原合成增加。
李晨[4]（2021）在《电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用》文中研究说明目的 基于“中医治未病”思想及“心胸内关谋”经典理论,在前期研究基础上,以心肌缺血再灌注损伤模型大鼠为研究对象,从细胞凋亡、细胞焦亡以及细胞自噬的角度出发,观察电针“内关”“足三里”“关元”穴预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其作用机制。并借用FXR/SHP凋亡信号通路激动剂GW4064及抑制剂Z-guggulsterone从FXR/SHP信号转导通路的角度探讨其作用机制,以及细胞凋亡、焦亡和自噬的联系,为电针预处理防治MIRI提供新的理论依据和治疗靶点。方法 一理论探讨:以中医学和现代医学理论为基础,从心肌细胞焦亡、自噬及凋亡角度出发,探讨电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其机制;从FXR/SHP凋亡信号通路的角度出发,探讨FXR/SHP通路对心肌细胞凋亡、焦亡以及自噬的影响及其作用机制,以及三者间的联系。二动物实验:将Wistar大鼠80只（雄性,SPF级）按照“随机数字表法”进行随机分组,平均分为4组,分别是:正常组（N组）、假手术组（S组）、模型组（M组）和电针预处理组（EA组）,20只为一组。所有实验动物适应性喂养1周后,开始正式实验。通过左侧冠状动脉结扎法制备MIRI大鼠模型,每组大鼠给予相应的干预措施。再增加40只Wistar大鼠（雄性,SPF级）,随机分为2组,每组20只,分别为电针+GW4064激动剂组（EA+GW组）和电针+z-Guggulsterone抑制剂组（EA+Z组）,每组大鼠给予相应的干预措施。实验1:采用HE染色观察各组心肌组织的形态结构;采用TTC染色测量各组心肌梗死面积和心肌梗死质量;采用TUNEL染色计算各组心肌细胞凋亡指数,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法（ELISA法）进行各组心肌损伤标志物（LDH、CK和c Tn I）的测定;从而探讨电针预处理对MIRI大鼠的保护作用。实验2:采用Western-blot法检测各组NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白等焦亡相关指标的表达,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞焦亡通路的调节作用实验3:采用Western-blot法检测各组Beclin1、LC3I、LC3Ⅱ蛋白表达以及LC3Ⅱ/LC3I比值,研究电针预处理对心肌细胞的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞自噬通路的调节作用。实验4:采用Western-blot法检测各组Bcl-2、Bax蛋白表达,同时用荧光定量PCR法检测各组Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,研究电针预处理对MIRI大鼠模型的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞凋亡通路的调节作用。实验5:采用TUNEL染色法计算各组心肌细胞凋亡指数,采用荧光定量PCR法检测凋亡相关指标FXRm RNA、SHPm RNA表达,采用Western-blot法检测各组凋亡相关指标Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达,焦亡相关指标Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达以及自噬相关指标Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,探讨电针预处理对MIRI模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响,以及FXR/SHP信号通路对细胞凋亡、焦亡、自噬的影响及三者间的联系。结果 实验1电针预处理对MIRI大鼠心肌损伤标志物、心肌细胞凋亡指数及形态学影响（1）HE染色:光镜下观察与比较各组大鼠心肌细胞形态学结果如下:N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。（2）心肌梗死面积:与N组相比较,S组梗死面积变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死面积显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死面积显着减小（P<0.01）。（3）心肌梗死质量;与N组相比较,S组梗死质量变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死质量显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死质量显着减小（P<0.01）。（4）心肌细胞凋亡指数:N组和S组心肌组织中,可见极少量凋亡细胞核,M组中存在大量凋亡细胞,细胞核形态不规则,成碎片状,EA组可见少量凋亡细胞核。与N组和S组比较,M组心肌细胞凋亡指数明显上升（P<0.01）,与M组比较,EA组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.01）。（5）血清LDH、CK、c Tn I含量:与N组相比较,S组血清LDH、CK、c Tn I含量变化不大,差异均无统计学意义（均P>0.05）;与N组比较,M组、EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均上调（均P<0.01）,EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均低于M组（均P<0.01）。实验2电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠焦亡通路的调控作用（1）心肌组织NLRP3、ASC蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的NLRP3、ASC蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组NLRP3、ASC蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。（2）心肌组织Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。实验3电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠自噬通路的调控作用（1）心肌组织Beclin-1蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Beclin-1蛋白表达明显升高（P<0.05）,与M组相比,EA组Beclin-1蛋白表达明显降低（P<0.05）。（2）心肌组织LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（P<0.05）。实验4电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠细胞凋亡的影响（1）心肌组织Bcl-2蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）。与M组比较,EA组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。（2）心肌组织Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组和EA组Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达显着升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组的Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。实验5电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响（1）心肌细胞凋亡指数:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数均明显降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.05）,EA+GW组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）。（2）心肌组织FXRm RNA、SHPm RNA表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组及EA+GW组大鼠心肌细胞FXRm RNA、SHPm RNA表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组的FXRm RNA、SHPm RNA表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组FXR、SHPm RNA表达水平显着降低（P<0.05）,EA+GW组FXR、SHPm RNA表达水平明显升高（P<0.05）。（3）心肌组织Bcl-2、Bax、Caspases-3蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GM组及EA+Z组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显着升高（均P<0.05）。与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Bcl-2蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,EA+GW组Bax、Caspases-3蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。（4）心肌组织Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。（5）心肌组织Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组大鼠心肌细胞Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。结论 1.电针预处理能使MIRI模型大鼠心肌梗死面积及梗死程度明显下降,降低凋亡指数,病理形态学检测提示电针可显着改善受损心肌组织的病理损害程度。2.电针预处理能下调MIRI模型大鼠血清中LDH、CK及c Tn I的含量,保护大鼠心肌组织。3.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达,通过抑制细胞焦亡,保护心肌组织。4.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值过度升高,通过抑制细胞过度自噬,保护心肌组织。5.电针预处理能下调MIRI模型大鼠Bax蛋白表达、Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,上调Bcl-2蛋白表达,通过抑制细胞凋亡,保护心肌组织。6.电针预处理能通过抑制FXR/SHP凋亡信号通路从而抑制心肌细胞凋亡,抑制凋亡,能起到抑制细胞焦亡和抑制细胞过度自噬的作用,从该角度探讨三者间的联系,进一步说明电针预处理对MIRI的保护机制可能是多层次、多途径的综合效应。
王惠[5]（2021）在《基于TXNIP/NLRP3途径研究益气活血药对心梗后内质网应激诱发细胞焦亡的影响》文中研究说明研究背景:受饮食习惯、生活方式和社会压力等因素影响,心肌缺血和心肌梗死及其导致的心衰仍严重影响居民的身体健康和生活质量,其中涉及的中青年患者也在不断增多。研究发现,当心肌受损后可导致内质网、线粒体功能障碍,触发包括细胞焦亡在内的多种细胞死亡途径,导致心脏功能受损。临床使用益气活血中药治疗,可有效改善患者症状和心脏功能。而益气活血药主要包括黄芪50g,生晒参10g,当归15g,川芎15g,三七6g,是以中医气血理论（气虚血瘀、气滞血瘀）为理论基础而创立,为导师临床治疗心肌缺血缺氧、心肌损伤以及心肌梗死后各种遗留症状的经验效方,其作用主要是有益心气,促进血液运行和疏通脉络,本课题组在前期研究中已经证明益气活血药能够改善心肌梗死患者疼痛、胸闷、气短等的症状,明显改善心脏射血功能和心脏形态,可以改善大鼠心肌梗死后炎症反应对心肌的损伤,减轻血清中炎症细胞因子分泌水平。研究目的和意义:探究心肌梗死后内质网应激与细胞焦亡的相互作用和调控机制,详细研究心肌梗死的病理生理过程,揭示益气活血药防治心肌缺血、心肌梗死的作用机制和靶点,对于心梗的临床治疗和新药的研发有重要理论意义和实际应用价值。研究方法:本课题内容分为动物实验和细胞实验两部分。动物实验:购买雄性SD大鼠（200±20g）,适应性喂养三天后,结扎左冠状动脉前降支构建急性心梗动物模型。术后根据心电图情况,选取符合要求（5个及5个以上病理Q波）的成模大鼠并随机分为4组:模型组（Model,M）,益气活血组（YQHX,Y）,培哚普利组（Perindopril,P）和只穿线不结扎的假手术组（Sham,S）,于术后第二天给予相应药物和蒸馏水灌胃。前期研究结果表明益气活血药改善心肌缺血、减轻心肌梗死的作用以益气药和活血药2:1时作用最为显着,且服用28天疗效更佳显着。28天时间点还是心梗后心衰的时间窗,模拟临床急性心梗导致心衰的病理情况。因此本实验观察灌胃28天后,各组大鼠的心脏超声情况,HE染色观察各组大鼠心肌细胞状态,评价各组大鼠心脏功能;透射电镜观察心肌组织超微结构,免疫荧光染色观察TXNIP、GSDMD分布及表达情况;免疫蛋白印记法观察各组大鼠梗死边缘区心肌组织中GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达情况,揭示心肌梗死后梗死边缘区组织内质网应激和细胞焦亡变化情况及益气活血药的调节作用。细胞实验:采用H9c2心肌细胞系复制缺糖缺氧模型,根据课题组前期研究结果,并考虑益气活血药冻干粉的存放时间,选用冻干粉200μg/ml、300μg/ml和400μg/ml浓度进行观察。将心肌细胞分为:对照组（C）;缺糖缺氧模型组（M）;200μg/ml益气活血药组（Y2）;30μg/ml益气活血药组（Y3）;400μg/ml益气活血药组（Y4）。根据课题组的前期研究成果,选用造模12h时的时间点观察益气活血药对中轻度心肌细胞损伤的保护作用。采用CCK-8试剂盒观察各组心肌细胞的活力,测定各组细胞中LDH和ROS水平,筛选出益气活血药调节氧化应激水平的最佳浓度为300μg/ml。为进一步观察内质网应激和细胞焦亡间的关系,使用内质网应激抑制剂4-PBA,并将心肌细胞以40×104密度随机分为5组:对照组（C）,缺糖缺氧模型组（M）,益气活血药组（Y）,4-PBA抑制剂组（4-PBA）,益气活血药组+4-PBA抑制剂组（Y+4-PBA）。通过Hoechst 33342/PI双染检测各组心肌细胞细胞焦亡率,免疫蛋白印记法观察各组心肌组织中GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达情况。实验结果:1.超声结果评价各组大鼠左室心功能情况。各组大鼠相应干预28天后,与假手术组相比,M组大鼠的左室射血分数（EF）和左室短轴率（FS）显着降低（p<0.01）,LVAWd、LVIDd、LVIDs 也都显着升高（p<0.01）,LVPWs 也有升高（p<0.05）,而、LVAWs降低（p<0.01）。益气活血药干预后可显着改善各组大鼠心功能,促进各组超声相应指标向正常范围恢复。2.各组大鼠梗死边缘区组织HE染色的心肌细胞情况。可见S组心肌细胞排列整齐,结构完整,细胞核位于细胞中央,无炎性细胞浸润;M组心肌细胞形态受损,细胞肿胀,细胞核散乱,形态位置都发生变化,心肌纤维断裂,结构破坏,胞浆着色不均,排列紊乱,细胞间隙显着增大,有大量炎性细胞浸润;Y组和P组边缘区组织可见心肌细胞肿胀,但整体结构完整,炎性细胞较M组减少,可见少量心肌纤维断裂,心肌细胞间隙略有增宽。3.透射电镜观察各组超微结构的变化。S组大鼠心肌Z线、M线清晰,粗细肌丝清晰排列整齐,线粒体结构完整,双层膜清晰可见,线粒体内基质颗粒和线粒体嵴排列清楚,内质网结构正常。心梗28天后,M组心肌细胞内超微结构紊乱,线粒体肿胀破裂,线粒体嵴模糊甚至消失,细肌丝断裂,粗肌丝堆积,肌原纤维断裂,内质网肿胀,多处可见空泡样结构。而药物干预组粗细肌丝融合分界不清,内质网、线粒体肿胀,线粒体嵴模糊,结构尚完整。5.免疫组化染色TXNIP、GSDMD的情况。TXNIP在假手术组少有表达,模型组显着增加,阳性细胞率大幅度提高。益气活血药和培哚普利组可减少TXNIP的阳性率表达。GSDMD在模型组广泛表达,强阳性染色细胞率较假手术组显着增多,用药组干预后GSDMD的蛋白阳性率可明显降低6.各组大鼠梗死边缘区组织内质网应激和细胞焦亡相关蛋白表达情况。蛋白免疫印迹法结果显示:与 S 组相比,M 组 GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11 蛋白表达水平都显着增高（p<0.01）,而益气活血药和培哚普利可不同程度的降低各组蛋白表达,发挥相应调节作用（p<0.05）。7.益气活血药对缺糖缺氧H9c2心肌细胞的保护作用。与C组相比,缺糖缺氧12h后心肌细胞活力显着降低（p<0.01）,而Y2、Y3、Y4可不同程度的提高心肌细胞活力,保护其免受或少受缺糖缺氧的损伤,其中Y3的效果最佳。又继续探索了不同浓度益气活血药对各组细胞LDH和ROS的影响,结果显示益气活血药可降低缺糖缺氧心肌细胞LDH、ROS水平,其中Y3显示出更好的效果,故在本课题接下来的实验中,选用300μg/ml的益气活血药浓度进行机制探究。我们继续观察了 C、M、Y（300μg/ml）、4-PBA和Y（300μg/ml）+4-PBA五组心肌细胞的细胞存活率和LDH表达水平。结果显示,与C组相比,M组细胞存活率显着降低（p<0.01）,平均降至40%左右。在药物和抑制剂的干预下细胞存活率都明显增加（p<0.05）。虽然Y、4-PBA和Y+4-PBA三个组的细胞存活率程增加趋势,但三者没有统计学差异（p>0.05）。模型组细胞上清中LDH量显着增高（p<0.01）,平均可达400U/L左右。Y、4-PBA和Y+4-PBA干预后都可明显减少LDH的释放（p<0.01）,Y组与Y+4-PBA组相比,差异具有统计学差异（p<0.01）,Y+4-PBA组LDH的减少程度更佳显着。8.心肌细胞细胞焦亡率的情况。采用Hoechst 33342/PI双染后可见C组细胞淡蓝染,细胞密度高,细胞大小正常,基本没有红染细胞。M组细胞核蓝染高亮,细胞密度降低,细胞体积增大,大量红染细胞。而使用抑制剂和中药干预后,都可以降低焦亡细胞比率,细胞密度也较M组增加。9.益气活血药对缺糖缺氧心肌细胞内质网应激和细胞焦亡相关蛋白的影响。与S组相比,M 组 GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达水平都显着增高（p<0.01）,益气活血药和抑制剂干预都可降低相关指标的表达,而抑制剂作用更佳显着。当益气活血药与抑制剂联用时,可进一步降低其表达水平（p<001）。研究结论:1.益气活血药可通过改善缺血心肌细胞超微结构损伤而提高心梗后心功能,改善心梗后的收缩功能,减小梗死面积。2.益气活血药通过调节内质网应激和细胞焦亡相关蛋白,减少心肌细胞死亡,挽救缺血心肌。3.内质网应激抑制剂4-PBA可显着抑制心肌细胞焦亡相关指标表达,表明细胞焦亡可以由内质网应激途径触发并加重细胞焦亡的损伤作用,该作用可能与TXNIP/NLRP3途径有关。而益气活血药可通过抑制内质网应激TXNIP/NLRP3途径,缓解内质网应激抑制细胞焦亡,减轻心肌细胞损伤,且从研究结果显示,益气活血药的作用机制与IRE1 α诱导的相关途径密切相关,这将是进一步研究该课题的重点方向。4.益气活血药减轻内质网损伤,改善了“气虚”的状态,提高了受损心脏功能运行的动力,为从现代科学角度阐释中医“气血”理论提供了研究基础。
李玉为[6]（2021）在《神经病理性疼痛对心肌缺血再灌注损伤的影响及机制研究》文中研究指明背景与目的心肌缺血是冠心病患者死亡的重要原因,再灌注治疗是目前最有效的干预方法之一,但亦带来心肌缺血再灌注损伤。疼痛,作为一种伤害性刺激,对心肌缺血再灌注损伤可能有保护作用,但目前关于该方面研究仍具有争议性。凋亡和自噬作为两种不同的细胞死亡方式,常同时对机体生理或病理过程进行调节,因此本研究拟观察神经病理性疼痛对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响并且初步探讨凋亡和自噬是否参与疼痛因素介导的心肌缺血再灌注损伤的保护过程。方法雄性SD大鼠,重250～300g,按随机数字表法分为3组（n=12）:对照组（C组）、心肌缺血再灌注损伤组（I/R组）和神经病理性痛+心肌缺血再灌注组（NP+I/R组）。通过行坐骨神经缩窄性损伤（chronic constriction injury,CCI）及结扎冠状动脉左前降支分别建立在体神经病理性疼痛（neuropathic pain,NP）模型和心脏缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）模型。观察指标为疼痛行为学,包括机械缩足反应阈值（mechanical withdrawal threshold,MWT）和热缩足反应潜伏期（thermal withdrawal lantency,TWL）;血流动力学包括心率（heart rate,HR）及平均动脉压（mean arterial pressure,MAP）;心肌梗死面积（以梗死区/危险区比值表示,IS/AAR）。同时,WB法观察心肌组织Bcl-2、BAX、Caspase-3等凋亡相关蛋白及Akt、m TOR、p Akt、pm TOR、LC3B等自噬相关蛋白的表达;HE观察心肌病理变化;IF观察心肌中LC3B的定位及表达。结果1.疼痛行为学与C组比较,I/R组CCI术后MWT和MWT差异无统计学意义（p>0.05）;与I/R组比较,NP+I/R组CCI术后MWT、TWL值降低（P<0.05）。2.血流动力学与C组比较,I/R组在IRI相应时间点MAP、HR及RPP降低（p<0.05）.I/R组和NP+I/R组在相应时间点的MAP、HR及RPP无统计学差异（p>0.05）。3.心肌梗死面积与C组比较,I/R组IS/AAR增加;与I/R组比较,NP+I/R组IS/AAR降低（P<0.05）。4.凋亡蛋白分子表达与C组相比,I/R组BAX、Caspase-3表达上调;Bcl-2表达下调;与I/R组相比,NP+I/R组BAX、Caspase-3表达下调;Bcl-2表达上调（P<0.05）。5.自噬相关蛋白分子表达与C组相比,I/R组p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR表达下调,LC3B-II/I表达上调;与I/R组相比,NP+I/R组p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR比值上调,LC3B-II/I比值下调（P<0.05）。6.HE染色C组心肌纤维排列整齐;I/R组心肌可见坏死灶,水肿明显;NP+I/R组坏死灶和水肿较I/R组轻。7.免疫荧光染色C组未见到明显LC3B荧光表达;I/R组LC3B荧光表达较C组增强;CCI+I/R组LC3B荧光表达较I/R组弱。结论1.NP可能对心肌IRI有保护作用;2.神经病理性痛因素可能经凋亡途径减轻心肌IRI;3.Akt/m TOR信号通路相关的自噬途径也可能参与神经病理性痛因素减轻IRI的过程。
陆件[7]（2021）在《右美托咪定对窒息大鼠心肺复苏后神经细胞凋亡和自噬的影响及其机制研究》文中指出目的:观察右美托咪定（dexmedetomidine,Dex）对窒息心脏骤停（cardiac arrest,CA）大鼠自主循环恢复（return of spontaneous circulation,ROSC）后体温及其神经功能的影响,并在ROSC后12 h和24 h后观察脑皮质和海马神经细胞形态学和相关生物学分子的表达变化,探讨Dex对心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation,CPR）后大鼠神经细胞凋亡和自噬的影响及其作用机制。方法:健康雄性成年SD大鼠204只,随机分为四组,空白对照组（BC）、常规复苏组（N）、右美托咪定复苏组（D）、右美托咪定+拮抗剂复苏组（DT）,除BC组6只大鼠外,其余三组均66只。除BC组外,其余三组根据观察时间点的不同在ROSC后再随机分二亚组,即ROSC后12 h和24 h组,每个亚组的样本量以最终存活到观察时间点的大鼠数量决定。建立窒息大鼠心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation,CPR）模型,N组在CPR时使用常规给药方法（静脉注射肾上腺素和碳酸氢钠）复苏,D组于复苏前在使用常规复苏组药物的基础上腹腔注射Dex,DT组于复苏前在使用常规复苏组药物的基础上腹腔注射Dex和其拮抗剂育亨宾。在ROSC后,各复苏组均在恒温25℃条件下观察大鼠的体温变化。到达观察时间点（ROSC后12或24 h）时对大鼠进行神经功能缺损评分（neurological deficit score,NDS）。评分后迅速处死大鼠断头取脑获取脑海马和皮质组织,对海马和脑皮质组织进行病理和电镜观察。对脑皮质进行单细胞悬液制作,使用流式细胞（flow cytometer,FCM）技术检测神经细胞内的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。使用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）技术检测海马神经细胞caspase-3表达的变化。利用蛋白免疫印迹（Western-Blotting）技术检测海马神经细胞热休克蛋白70（HSP70）、Bcl-2、Bax以及自噬相关蛋白Beclin1表达的变化。结果:复苏后大鼠在25℃恒温环境下,Dex干预后的D组大鼠体温与N组比较有显着性降低（P<0.05）,使用了Dex拮抗剂育亨宾后DT组大鼠的体温与N组无显着性差异（P>0.05）;常规复苏后的N组大鼠NDS与BC组比较有显着性降低（P<0.05）,Dex干预后的D组大鼠NDS与N组比较有显着性升高（P<0.05）,而阻断了Dex作用后的DT组大鼠NDS与D组比较有显着性降低（P<0.05）;N组大鼠的海马神经细胞损伤在光镜和电镜的观察下较BC组明显加重,D组的海马神经细胞损伤较N组有所减轻,DT组的海马神经细胞损伤较D组明显。使用常规复苏方法的N组大鼠脑皮质神经细胞内的ROS水平较BC组明显升高（P<0.05）,Dex干预后的D组脑皮质神经细胞内的ROS水平较N组有所减少（P<0.05）,而阻断了Dex作用后的DT组脑皮质神经细胞内的ROS水平较D组有所增加（P<0.05）;N组caspase-3的表达与BC组比较有显着性增加（P<0.05）,D组caspase-3的表达与N组比较有显着性降低（P<0.05）,DT组caspase-3的表达与D组比较有显着性升高（P<0.05）;N组Bax的表达与BC组比较有显着性增加（P<0.05）,D组Bax的表达与N组比较有显着性降低（P<0.05）,DT组Bax的表达与D组比较有显着性升高（P<0.05）;N组Beclin1的表达与BC组比较有显着性增加（P<0.05）,D组Beclin1的表达与N组比较有显着性降低（P<0.05）,DT组Beclin1的表达与D组比较无显着性差异（P>0.05）;N组Bcl-2的表达与BC组比较有显着性降低（P<0.05）,D复苏组Bcl-2的表达与N组比较有显着性增加（P<0.05）,DT组Bcl-2的表达与D组比较无显着性差异（P>0.05）;N组HSP70的表达与BC组比较有显着性增加（P<0.05）,D组HSP70的表达与N组比较有显着性增加（P<0.05）,DT组HSP70的表达与D组比较有显着性降低（P<0.05）。结论:使用常规药物CPR时联合腹腔注射Dex对复苏后大鼠有明显的致低温作用,并能显着提高复苏大鼠的神经功能。其机制与Dex能减少复苏后大鼠脑皮质神经细胞内的ROS水平,减少脑海马caspase-3、Bax和增加HSP70等凋亡相关蛋白的表达,以及调控Bcl-2-Beclin1复合体的自噬作用有关。
段佳林[8]（2020）在《太白楤木总皂苷及其单体成分对脑卒中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理脑卒中是威胁人类健康的三大疾病之一,是我国成年人致死和致残的首要原因,且呈年轻化趋势,其中缺血性脑卒中占60-80%。目前,治疗缺血性脑卒中主要采用溶栓法进行血管再通,但严格的时间窗限制使中国患者受益率只有2.4%。超时间窗溶栓虽能取得一定的治疗效果,但有可能引起再灌注损伤,即脑缺血/再灌注损伤（Cerebral ischemia-reperfusion injury,CI/RI）。缺血中心区细胞已坏死无法逆转,但周边脑区即缺血半暗带细胞还可以挽回,因此,保护缺血半暗带组织和细胞,阻止脑损伤进一步发展,对于治疗脑卒中具有重要意义。太白楤木特产于我国“三大药山”之一的太白山区,其主要成分太白楤木总皂苷（Saponins from Aralia taibaiensis,sAT）,具有抗氧化、抗炎、抑制凋亡等生物学作用,但其对CI/RI的防治作用尚不明确,同时,其脑保护活性成分和作用机制也未见报道。目的:1.揭示sAT对抗CI/RI的药理学作用,尤其对CI/RI关键环节（氧化应激和线粒体障碍）的作用;2.阐明sAT对抗CI/RI的可能分子机制,以此为基础,筛选sAT对抗CI/RI的可能药效物质,为开发和利用sAT提供理论和实验基础。方法:体内采用大鼠局灶性脑缺血/再灌注（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型,体外采用HT22小鼠海马神经元细胞氧糖剥夺/复氧（Oxygen and glucose deprivation/reoxygenafion,OGD/R）模型,验证sAT的脑保护作用。采用网络药理学技术预测可能作用的通路和靶点以寻找sAT的潜在作用机制。根据网络药理学预测结果,Western blotting检测腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedprotein kinase,AMPK）、蛋白激酶B（Protein kinase B,又称Akt）、过氧化物增殖子激活-受体因子γ辅激活因子（Peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α）和叉头框蛋白O 3a（Forkhead box protein O 3a,FOXO3a）蛋白的乙酰化水平和磷酸化水平,以及下游相关蛋白的表达情况。采用siRNA干扰技术、特异性激动剂或抑制剂证明相关蛋白的调控作用。通过采用siRNA干扰技术证明sAT通过Apelin 13调控AMPK/Akt。明确sAT对P38 MAPK、ATF4和HIF-1α的作用后,采用P38 MAPK的特异性激活剂（anisomycin）和抑制剂（SB203580）,或者siRNA干扰HIF-1α或ATF4表达,观察对sAT促Apelin13表达能力和脑保护作用的影响,以明确sAT是否通过HIF-1α和P38 MAPK/ATF4调控Apelin 13。为明确sAT的药效物质基础,对sAT中的单体成分进行活性筛选。采用RT-PCR、荧光报告基因细胞筛选模型,测定不同单体成分对缺氧反应元件（Hypoxia response elements,HREs）和CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer binding protein beta,C/EBPβ）转录活性的影响。最后采用siRNA干扰HIF-1α或P38 MAPK的特异性激活剂和抑制剂验证筛选出的皂苷单体的药效学作用及其是否分别通过影响HIF-1α和P38 MAPK/ATF4促进Apelin 13表达。结果:1.药效学研究。在体内,MCAO/R引起脑梗死面积显着增加（46.6±2.86%vs 0,P<0.01）、脑组织含水量增加（85.13±1.36%vs 77.6±4.03%,P<0.01）、神经功能学评分升高（4.33±0.82 vs 0,P<0.01）,而sAT能够剂量依赖性的抑制脑梗死面积（34.27±3.69%,26.97±2.15%,17.57±2.72%vs 46.6±2.86%,P<0.01）、减少脑组织含水量（81.97±1.36,79.9±2.29,77.97±2.46 vs 85.13±1.36,P<0.01）、改善脑神经功能障碍（3.5±1.05,2.67±1.03,1.0±0.89 vs 4.33±0.82,P<0.01）,同时,能够抑制脑组织中的氧化应激（P<0.01）和细胞凋亡水平（P<0.01）。在体外,OGD/R使细胞存活率显着下降（0.46±0.09 vs 1±0,P<0.01）、LDH释放增加（149.6±14.19 vs 39.63±8.89,P<0.01）、凋亡率增加、线粒体功能异常以及氧自由基水平增加,而sAT显着抑制细胞损伤,增加细胞内抗氧化酶表达、ATP水平,改善线粒体膜电位稳态和功能。证实sAT对缺血再灌注引起的脑损伤具有保护作用,且与降低氧化应激和改善线粒体功能关系密切。2.太白楤木中共收集31个皂苷单体,并根据结构预测到415个靶点,脑卒中筛选得到389个靶点,通过Venny分析二者交集筛选得到72个共同靶点。对72个共同靶点进行KEGG分析,获得248个生物过程,32个细胞组成,63个分子功能,对获得的104条KEGG通路分析发现,sAT调节的细胞通路包括TNF信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、MAPK通路、FoxO通路、Toll样受体、AMPK通路和钙信号通路等。其中PI3K/Akt、AMPK、MAPK、HIF-1、Fox O等信号通路与上一章发现的抗氧化应激和线粒体稳态具有密切关系,是本研究下一章关注的重点。3.sAT通过AMPK/Akt调控SIRT1抑制氧化应激和线粒体功能障碍。sAT能够促进AMPK和Akt的磷酸化水平,同时促进SIRT1蛋白表达,以及FOXO3a和PGC-1α去乙酰化和磷酸化。通过si RNA干扰SIRT1表达,证实sAT通过SIRT1调控FOXO3a和PGC-1α乙酰化水平从而影响其活性;采用siRNA干扰Akt表达,证实sAT通过Akt促进FOXO3a和PGC-1α磷酸化水平影响其活性,同时可通过Akt调控SIRT1表达,继而影响下游蛋白的表达。siRNA干扰和抑制剂实验证实sAT对AMPK和Akt的交互调节关系。最终证明sAT通过活化AMPK/Akt促进SIRT1表达,从而调控FOXO3a和PGC-1α活性抑制线粒体损伤和氧化应激。4.sAT通过P38MAPK/ATF4和HIF-1α调控Apelin 13/AMPK/Akt。与模型组比较,sAT各剂量组使脑组织中Apln基因表达量分别增加约2.26倍、2.73倍和5.31倍,Aplnr基因表达量分别增加约1.5倍、2.75倍和3.27倍（P<0.01）,同时观察到sAT能够促进Apelin 13蛋白表达,表明sAT能够促进脑细胞内Apelin 13的基因和蛋白表达。采用基因干扰Apelin 13受体证实Apelin 13在sAT调控AMPK/Akt及其下游蛋白表达发挥脑保护作用中的关键作用。为研究Apelin 13的上游调节通路,本研究关注了P38MAPK/ATF4和HIF-1α的表达情况。sAT可梯度依赖性的抑制P38 MAPK磷酸化和ATF4表达。OGD/R通过促进P38MAPK磷酸化和ATF4表达,抑制Apelin 13表达,而sAT可以逆转这些作用。sAT能够促进HIF-1α表达,而siHIF-1α使sAT的促Apelin13表达能力降低,同时对细胞的保护作用明显降低（P<0.01）。上述结果表明sAT通过促进HIF-1α表达和抑制P38 MAPK/ATF4活化上调脑细胞中Apelin 13表达。5.sAT中活性单体成分筛选。通过RT-PCR实验共筛选出12个皂苷单体对Apln基因表达具有明显的促进作用,其中6个皂苷单体（10号、14号、15号、19号、20号和21号单体）对HRE转录活性具有明显影响。Western blotting和siRNA干扰实验进一步证实这6个单体对HIF-1α蛋白表达均具有促进作用,siHIF-1α使它们显着降低对细胞的保护作用。5个皂苷单体（10号、11号、14号、19号和21号）对C/EBP转录活性具有调控作用。采用抑制剂和激活剂验证发现,10、14和19号皂苷单体是通过P38 MAPK/ATF4调控Apelin 13表达发挥细胞保护作用的。10号单体为楤木皂苷A,14号单体为去葡萄糖竹节参皂苷IVa,19号单体为竹节参皂苷IVa,这三个单体可同时影响P38 MAPK/ATF4和HIF-1α信号通路,促进Apelin 13表达。15号单体为竹节参皂苷Ib,20号单体为刺嫩芽皂苷F,21号单体为拟人参皂苷RT1可通过影响HIF-1α信号通路,促进Apelin 13表达。11号单体为楤木皂苷D和21号单体为拟人参皂苷RT1虽然对P38 MAPK/ATF4没有影响,但对C/EBPβ转录活性和Apelin13表达均有显着影响,推测其可能通过其他途径或者直接影响C/EBPβ转录活性。结论:本研究首次系统研究了sAT对CI/RI的保护作用,并借助网络药理学技术和分子生物学技术阐明了sAT发挥脑保护作用可能的分子机制,以此为基础,筛选了sAT中的皂苷单体成分,发现不同皂苷单体分别通过影响P38 MAPK/ATF4和HIF-1α信号通路共同促进Apelin 13表达,调控AMPK/Akt/SIRT1信号通路,抑制氧化应激和线粒体功能障碍,发挥脑保护作用。本研究揭示了sAT脑保护作用的药效物质基础和分子作用机制,为太白楤木的开发和应用提供理论和实验依据。
李伟伟[9]（2020）在《牛磺酸抑制低温环境下肉鸡右心肥厚机理研究》文中研究指明病理性心肌肥厚对于现代肉鸡养殖业一直是潜在的难以解决的代谢性疾病,不仅对肉鸡种群的健康存在威胁更是对养殖业的经济有着重要的影响。病理性心肌肥厚常常伴有心肌细胞凋亡,而钙蛋白酶-1（calpain-1）介导的凋亡途径在心肌细胞凋亡中起重要作用。牛磺酸已被证明可通过抑制calpain-1活性来减弱细胞凋亡而且还具有抗氧化,抗凋亡和维持心脏健康的功能。本试验旨在确定牛磺酸是否可以通过抑制calpain-1/细胞色素c（cytochrome c）的凋亡途径来预防心肌肥厚。并且在体外通过异丙肾上腺素（ISO）诱导培养的H9c2心肌细胞肥厚来进一步探究牛磺酸在calpain-1/cytochrome c凋亡途径中所调控的具体因子。体内试验从21日龄开始在肉仔鸡饮水中溶解有1%的牛磺酸,180只肉鸡随之分成对照（C）组、低温（M）组、低温+牛磺酸（T）组,自15日龄,M组和T组肉鸡的鸡舍温度每日降低1～2℃,从第21日龄到第42日龄肉鸡在10℃～12℃饲养。在第21日龄、28日龄、35日龄和42日龄收集右心室组织。结果表明牛磺酸可降低右心肥厚指数（RVHI）,血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）,去甲肾上腺素（NE）和心肌肥厚标志物心房利钠肽（ANP）m RNA水平的表达。牛磺酸通过维持线粒体膜电位（MMP）明显抑制心肌细胞的凋亡,并降低肉鸡右心室中cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的活化。抗氧化性测定结果表明,牛磺酸增强了超氧化物歧化酶（SOD）总抗氧化剂能力（T-AOC）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性,以及谷胱甘肽（GSH）/谷胱甘肽二硫化物（GSSG）的比率。Real time PCR和Western-Blot结果显示,牛磺酸还可以下调右心肥厚肉鸡心肌细胞中calpain-1和胞质cytochrome c的表达,同时上调Bcl-2/Bax和线粒体cytochrome c的表达。体外实验结果表明牛磺酸可以抑制ISO诱导的H9c2心肌细胞表面积的增加并降低心肌肥厚标志物ANP、脑利钠肽（BNP）和β-肌球蛋白重链（β-MHC）的蛋白质表达水平。牛磺酸还降低了活性氧（ROS）,细胞内Ca2+超载和维持MMP的稳定。此外,牛磺酸通过降低calpain-1,Bax,t-Bid,胞质cytochrome c,Apaf-1,cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的蛋白表达以及增强calpain抑制剂（calpastatin）和Bcl-2的蛋白表达来抑制心肌细胞凋亡。Calpain-1小干扰RNA（si RNA）转染试验表明,在心脏肥厚过程中牛磺酸可以通过调控calpain-1和cleaved caspase-9的活化来抑制线粒体依赖性细胞凋亡,但不能通过calpain-1/AIF途径抑制心肌肥厚。因此,牛磺酸可通过抑制氧化应激,细胞内Ca2+超载,calpain-1介导的线粒体依赖性凋亡途径和cleaved caspase-9的活化水平来预防心肌肥厚。综上所述,我们发现牛磺酸在体内水平可通过抑制calpain-1/cytochrome c凋亡途径,抑制35日龄和42日龄的右心肥厚肉鸡心肌细胞凋亡,而在体外水平牛磺酸可防止ISO诱导的H9c2心肌细胞肥厚、氧化应激和细胞内Ca2+超载,并通过影响cleaved caspase-9活化来抑制calpain-1/cytochrome c凋亡通路。
冯秀晶[10]（2020）在《基于调控线粒体动力学探究右美托咪定对LPS诱导大鼠急性肾损伤的保护作用机制》文中进行了进一步梳理脓毒症致急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）是兽医临床上常面对的一种高发病率和死亡率的全身性感染并发症,由于其发病机制复杂,目前仍没有开发出有效的防治药物或干预措施,因此阐明脓毒症致AKI的发病机制及探寻有效的防治药物一直是兽医学乃至医学研究的难点和焦点。研究表明线粒体动力学是AKI发生时引起肾小管细胞凋亡的重要机制。然而,线粒体动力学失衡是否介导脓毒症致AKI的发生及其机制尚不清楚。右美托咪定（Dexmedetomidine,DEX）具有显着的抗氧化、抗凋亡和线粒体保护作用,也可影响线粒体分裂/融合的调节,故推测DEX可通过调控线粒体动力学对脓毒症致AKI起到保护作用,并探讨相关机制。体内试验选取30只雄性SD大鼠,随机均分为5组,CON组、DEX组（30μg/kg）、LPS组（10 mg/kg）、DEX+LPS组（30μg/kg+10 mg/kg）、Atip+DEX+LPS组（250μg/kg+30μg/kg+10 mg/kg）。造模4 h后心脏采血、膀胱采尿,取肾脏组织备用。观测肾脏功能和结构、炎症因子、氧化应激、细胞凋亡、线粒体结构和功能、线粒体动力学、Ca MKII的表达和定位、Calcineurin的表达和活性、SIRT1和PGC-1α的表达和定位情况。为了进一步揭示线粒体分裂介导了脓毒症致AKI的发生及DEX通过调控线粒体动力学对脓毒症致AKI起到保护。体外试验选用NRK-52E细胞,分成7组,分别为CON组、LPS组（25μg/m L）、si-Drp1+LPS组、DEX+LPS组（0.001μM+25μg/m L）、si-SIRT1+DEX+LPS组、si-PGC-1α+DEX+LPS组、si-Ctrl+LPS组。细胞分别用si-RNA沉默相关基因,并根据各组需要完成造模后,检测炎症因子、氧化应激、细胞凋亡、线粒体结构和功能、线粒体动力学、Ca2+介导的信号转导、SIRT1/PGC-1α通路中调控因子的表达情况。试验结果表明:（1）LPS处理后血清BUN和Cre、尿液KIM-1和NGAL的水平升高;DEX预处理后上述指标显着降低;α2-AR抑制剂Atip显着逆转了DEX的肾功能保护作用。表明DEX通过激活α2-AR对LPS诱导的肾功能障碍起到保护作用。（2）LPS处理后血清和细胞TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平显着升高;DEX干预后上述指标显着降低;Atip显着逆转了DEX的抗炎作用。表明DEX通过激活α2-AR抑制LPS诱导的炎症反应。si-Drp1抑制Drp1分裂后,显着抑制了炎症因子的释放,提示DEX很可能通过调控线粒体动力学抑制炎症因子释放。（3）通过光学显微镜观察,CON组肾脏皮质和髓质结构正常;LPS组和Atip+DEX+LPS组肾小管扩张、空泡变性、炎细胞浸润和肾小管坏死;DEX+LPS组轻度炎症细胞浸润和局灶性坏死。透射电镜观察结果显示CON组肾脏亚细胞形态正常;LPS组和Atip+DEX+LPS组肾脏细胞核不规则皱缩,核膜破裂,线粒体肿胀、空泡变性及双层膜结构破裂;DEX+LPS组肾脏亚细胞器结构损伤轻于LPS组,细胞核和线粒体等形态恢复正常。表明DEX通过激活α2-AR对LPS诱导的AKI大鼠肾脏结构起到保护作用。（4）LPS处理后GSH含量、CAT和SOD活性显着降低,MDA、GSSG和ROS含量显着升高,GSH/GSSG比值显着降低;DEX预处理后GSH含量、CAT和SOD活性显着升高,MDA、GSSG和ROS含量显着降低,GSH/GSSG比值显着升高;Atip显着逆转了DEX的抗氧化应激作用。表明DEX通过激活α2-AR抑制LPS诱导的氧化应激反应。si-Drp1抑制Drp1分裂后,显着抑制了细胞的氧化应激反应,提示DEX很可能通过调控线粒体动力学抑制氧化应激水平。（5）LPS组肾小管凋亡细胞明显增多,凋亡蛋白Bak、Bax/Bcl-2、胞浆Cyt C、Cleaved caspase 9和Cleaved caspase 3表达升高,凋亡基因Bak、Bax、Caspase9和Caspase3 m RNA表达升高;DEX预处理后肾小管细胞凋亡明显减少,且上述凋亡蛋白和基因的表达降低;Atip明显逆转了DEX的抗凋亡作用。表明DEX通过激活α2-AR减轻LPS诱导的线粒体途径的肾小管细胞凋亡。si-Drp1抑制Drp1分裂后,显着抑制了线粒体途径的细胞凋亡,提示DEX很可能通过调控线粒体动力学抑制肾小管细胞的线粒体途径的凋亡。（6）CON组肾脏线粒体双层膜结构完整,且嵴结构清晰;LPS组和Atip+DEX+LPS组肾脏线粒体形态异常、肿胀明显、空泡变性、双层膜结构破裂溶解、嵴结构断裂且模糊不清、线粒体体积变小;DEX+LPS组仅可见轻微外膜溶解。LPS处理后MMP、线粒体呼吸链复合物I-IV活性、ATP含量显着降低;DEX预处理后MMP、线粒体呼吸链复合物I-IV活性、ATP含量显着升高;Atip明显逆转了DEX的线粒体保护作用。表明DEX通过激活α2-AR减轻LPS诱导的线粒体结构损伤和功能障碍。si-Drp1抑制Drp1分裂后,显着抑制LPS诱导的线粒体片段化和ROS/线粒体ROS的产生,恢复线粒体呼吸链复合物Ⅰ-IV活性和MMP,增强线粒体功能,提示DEX可能通过抑制线粒体分裂,对线粒体的结构和功能起到改善作用。（7）LPS处理后p-Drp1 Ser616和Fis1蛋白表达升高,Drp1和Fis1 m RNA表达显着升高,Mfn1、Mfn2和Opa1 m RNA和蛋白表达降低,Drp1、Fis1与VDAC1共定位增多;DEX预处理后p-Drp1 Ser616和Fis1蛋白表达显着降低,Drp1和Fis1 m RNA表达显着降低,Mfn1、Mfn2和Opa1 m RNA和蛋白表达显着升高,Drp1、Fis1与VDAC1共定位减少;Atip显着逆转了DEX的线粒体动力学保护作用。表明DEX通过激活α2-AR调节线粒体动力学平衡,抑制Drp1的线粒体易位,对LPS诱导的AKI起到保护作用。si-Drp1抑制Drp1分裂后,显着抑制了线粒体分裂,促进了线粒体的融合,提示线粒体分裂介导了AKI的发生。（8）LPS处理后,细胞内Ca2+水平显着升高,Ca MKII m RNA和p-Ca MKII蛋白表达显着升高,且主要定位在肾小管细胞;DEX预处理后,细胞内Ca2+水平显着降低,Ca MKII m RNA和p-Ca MKII蛋白表达显着降低。Atip显着逆转了DEX对Ca MKII的调控。表明DEX通过α2-AR激活Ca MKII。si-Drp1抑制Drp1分裂后,显着抑制LPS诱导的细胞内Ca2+和p-Ca MKII水平升高,提示DEX可通过抑制线粒体分裂,减轻ROS介导的Ca2+超载和Ca MKII的激活,进一步抑制Drp1的线粒体易位,对AKI起保护作用。（9）LPS处理后SIRT1和PGC-1αm RNA和蛋白表达显着降低,且主要定位在肾小管细胞;DEX预处理后,SIRT1和PGC-1αm RNA和蛋白表达显着升高。Atip逆转了DEX对SIRT1和PGC-1α的调控。表明SIRT1/PGC-1α信号通路可能参与DEX对LPS诱导AKI的保护作用过程。应用si-SIRT1和si-PGC-1α分别抑制SIRT1和PGC-1α后,显着抑制了DEX对炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、线粒体结构和功能、线粒体动力学等的保护作用,提示DEX对线粒体动力学的调控作用至少部分依赖于SIRT1/PGC-1α通路的激活。综上所述,抑制线粒体分裂可有效改善氧化应激,减轻线粒体功能障碍和细胞凋亡,从而对脓毒症致AKI起到保护作用。DEX可通过减少ROS的产生,抑制Ca2+/Ca MKII通路,减轻Drp1介导的线粒体分裂。DEX可通过激活SIRT1/PGC-1α通路,从而阻止Drp1介导的线粒体分裂,促进Mfn2介导的线粒体融合,随后抑制ROS的产生,改善线粒体功能障碍,减少细胞凋亡,对脓毒症致AKI起到保护作用。这些数据表明抑制线粒体分裂或维持线粒体动力学平衡可为防治脓毒症致AKI提供新的治疗策略。同时也为DEX的肾脏保护作用提供了新的分子机制解释,表明DEX可能是一种有应用潜力的治疗脓毒症致AKI的辅助药物。
二、NAC对大鼠I/R心肌细胞凋亡及bad、bak、bax的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NAC对大鼠I/R心肌细胞凋亡及bad、bak、bax的影响（论文提纲范文）
（1）基于线粒体功能探讨二参颗粒对心肌缺血模型的保护作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一 线粒体功能障碍在心血管疾病中的作用及研究进展 |
| 综述二 中医药治疗心血管疾病研究进展 |
| 实验研究 |
| 第一章 二参颗粒高效液相指纹图谱研究及网络药理学靶点预测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 二参颗粒对CoCl_2诱导的H9C2 心肌细胞模型氧化应激和凋亡的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 二参颗粒对CoCl_2诱导的H9C2 心肌细胞模型线粒体功能和SIRT1-PGC-1α-PPARα信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 二参颗粒对心肌缺血大鼠模型线粒体功能和SIRT1-PGC-1α-PPARα信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（2）罗布麻叶总黄酮及异槲皮苷对吡柔比星致心脏损伤的保护作用和机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词对照表 |
| 第1篇 前言 |
| 第2篇 文献综述 |
| 第1章 蒽环类药物心脏毒性概述 |
| 1.1 蒽环类药物引起心脏损伤的类型 |
| 1.2 蒽环类药物引起心脏损伤的分子机制 |
| 1.2.1 拓扑异构酶抑制 |
| 1.2.2 铁离子代谢紊乱 |
| 1.2.3 线粒体功能障碍 |
| 1.2.4 肌纤维降解和肌浆网钙稳态失衡 |
| 1.2.5 氧化应激 |
| 1.2.6 细胞凋亡 |
| 第2章 罗布麻叶和异槲皮苷研究概述 |
| 2.1 罗布麻叶研究概述 |
| 2.1.1 罗布麻植物学特征和传统医学应用 |
| 2.1.2 罗布麻叶提取物药理学作用 |
| 2.1.3 罗布麻叶提取物安全性 |
| 2.2 异槲皮苷研究概述 |
| 2.2.1 异槲皮苷的制备 |
| 2.2.2 异槲皮苷药理作用 |
| 2.2.3 异槲皮苷的体内吸收过程 |
| 第3章 蒽环类药物所致心脏损伤与miRNAs概述 |
| 3.1 miRNAs简介 |
| 3.2 蒽环类药物心脏损伤心肌组织中miRNAs表达变化 |
| 3.3 蒽环类药物心脏损伤血液miRNAs表达的变化 |
| 3.4 miRNAs在蒽环类药物心脏损伤中预防和治疗的作用 |
| 第3篇 实验研究 |
| 第1章 罗布麻叶总黄酮对THP诱导大鼠心脏损伤的保护作用及机制研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 药品及试剂 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物分组及处理 |
| 1.2.2 各组大鼠心电图和心脏血流动力学参数 |
| 1.2.3 各组大鼠血清心肌酶水平 |
| 1.2.4 各组大鼠SOD和 MDA含量测定 |
| 1.2.5 各组大鼠心脏取材 |
| 1.2.6 各组大鼠心脏组织HE染色 |
| 1.2.7 各组大鼠心脏组织中线粒体膜基因的表达 |
| 1.2.8 各组大鼠心脏线粒体蛋白制备 |
| 1.2.9 各组大鼠心脏组织中相关蛋白的表达 |
| 1.2.10 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 大鼠一般状态观察 |
| 1.3.2 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心电图的影响 |
| 1.3.3 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠血流动力学的影响 |
| 1.3.4 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心肌酶的影响 |
| 1.3.5 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠组织形态学的影响 |
| 1.3.6 AVLE对 THP诱导的心脏损伤大鼠血清SOD和 MDA的影响 |
| 1.3.7 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心脏组织线粒体膜m RNA表达的影响 |
| 1.3.8 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心脏组织AKT和 p-AKT表达的影响 |
| 1.3.9 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心脏组织Cyt c表达的影响 |
| 1.3.10 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心脏组织胞浆Caspase家族蛋白表达的影响 |
| 1.3.11 AVLE对 THP所致心脏损伤大鼠心脏组织Bcl-2和Bax表达的影响 |
| 1.4 本章小结 |
| 第2章 罗布麻叶总黄酮的制备及成份分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 药品及试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 AVL生药学鉴定 |
| 2.2.2 AVLE提取和纯化 |
| 2.2.3 仪器分析条件 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 AVL性状鉴定 |
| 2.3.2 AVL横切面显微鉴定 |
| 2.3.3 HPLC-ESI-MS/MS法对AVLE进行定性分析 |
| 2.3.4 HPLC法对AVLE部分化合物进行定量分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 AKT在罗布麻叶总黄酮和异槲皮苷保护THP诱导H9c2 细胞损伤中的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 药品及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 细胞传代 |
| 3.2.3 细胞冻存 |
| 3.2.4 MTT检测细胞毒性和存活率 |
| 3.2.5 DCFH-DA探针检测H9c2 细胞ROS水平 |
| 3.2.6 ELISA法检测H9c2 细胞SOD和 MDA的含量 |
| 3.2.7 Mito-Tracker Red CMXRos探针检测H9c2 细胞线粒体活性 |
| 3.2.8 JC-1 探针检测H9c2 细胞线粒体膜电位 |
| 3.2.9 RT-qPCR检测H9c2 细胞线粒体膜基因的表达 |
| 3.2.10 TUNEL检测H9c2 细胞凋亡率 |
| 3.2.11 H9c2 细胞线粒体提取 |
| 3.2.12 Western blot检测H9c2 细胞相关蛋白的表达 |
| 3.2.13 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 IQC、AVLE和 THP对 H9c2 细胞作用的最佳浓度和时间确定 |
| 3.3.2 IQC和 AVLE对 THP处理H9c2 细胞的保护作用 |
| 3.3.3 AKT在 IQC和 AVLE改善THP处理H9c2 细胞凋亡中的作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 THP诱导大鼠心脏损伤miRNA芯片生物信息学分析及miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2 信号通路的构建和验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 药品及试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 差异miRNA筛选 |
| 4.2.2 miR-190a-5p和 AVL靶基因预测及通路富集 |
| 4.2.3 大鼠心脏组织miR-190a-5p、Phlpp1 基因及蛋白的表达 |
| 4.2.4 H9c2 细胞miR-190a-5p、Phlpp1 基因及蛋白的表达 |
| 4.2.5 双荧光素酶报告基因实验 |
| 4.2.6 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 差异miRNA筛选结果 |
| 4.3.2 miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2 信号通路的构建 |
| 4.3.3 AVLE对 THP诱导的心脏损伤大鼠心脏组织miR-190a-5p和 Phlpp1 基因及蛋白表达的影响 |
| 4.3.4 IQC和 AVLE对 THP处理H9c2 细胞miR-190a-5p和Phlpp1 基因及蛋白表达的影响 |
| 4.3.5 双荧光素酶报告基因实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 miR-190a-5p在 THP诱导H9c2 细胞损伤中的作用及机制 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 药品及试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 荧光显微镜检测miR-190a-5p转染H9c2 细胞效率 |
| 5.2.2 RT-qPCR检测H9c2 细胞miR-190a-5p和 Phlpp1 m RNA的表达 |
| 5.2.3 DCFH-DA探针检测H9c2 细胞ROS含量 |
| 5.2.4 ELISA法检测H9c2 细胞SOD和 MDA含量 |
| 5.2.5 Mito-Tracker Red CMXRos探针检测H9c2 细胞线粒体活性 |
| 5.2.6 JC-1 探针检测H9c2 细胞线粒体膜电位 |
| 5.2.7 RT-qPCR检测H9c2 细胞线粒体膜基因的表达 |
| 5.2.8 TUNEL检测H9c2 细胞凋亡率 |
| 5.2.9 H9c2 细胞线粒体提取 |
| 5.2.10 Western blot检测H9c2 细胞相关蛋白的表达 |
| 5.2.11 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 转染miR-190a-5p对 miR-190a-5p和 Phlpp1 m RNA表达的影响 |
| 5.3.2 miR-190a-5p对 THP处理H9c2 细胞的保护作用 |
| 5.3.3 miR-190a-5p对 THP处理H9c2 细胞miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2 信号通路的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第4篇 讨论 |
| 1.1 THP所致大鼠心脏组织/H9c2 细胞损伤模型复制 |
| 1.1.1 动物模型 |
| 1.1.2 细胞模型 |
| 1.2 AVLE制备及成份分析 |
| 1.3 IQC和 AVLE改善THP处理大鼠心脏组织/H9c2 细胞的作用 |
| 1.3.1 AVLE改善THP处理大鼠心脏组织心电图、血流动力学、心肌酶及组织形态学的变化 |
| 1.3.2 IQC和 AVLE改善THP处理大鼠心脏组织/H9c2 细胞氧化应激和线粒体功能的作用 |
| 1.4 IQC和 AVLE对 THP所致大鼠心脏组织/H9c2 细胞损伤的保护作用机制 |
| 1.4.1 THP诱导大鼠心脏损伤miRNA芯片生物信息学分析及miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2 信号通路的构建 |
| 1.4.2 miR-190a-5p/Phlpp1 生物学作用及IQC、AVLE和 DZR对miR-190a-5p/Phlpp1 调控作用的验证 |
| 1.4.3 AKT作为IQC和 AVLE保护THP诱导大鼠心脏组织/H9c2 细胞损伤作用节点的探讨 |
| 1.4.4 miR-190a-5p减轻THP处理H9c2 细胞氧化应激及对线粒体功能的保护作用 |
| 1.4.5 miR-190a-5p在 IQC和 AVLE保护THP诱导H9c2 细胞损伤机制中的探讨 |
| 1.5 IQC与 AVLE药效对比分析 |
| 第5篇 结论 |
| 创新点 |
| 今后工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）PHLPP1及达格列净在糖尿病心肌病中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ PHLPP1在糖尿病心肌病中的作用及其机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 达格列净在糖尿病心肌病心肌纤维化中的作用及其机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的SCI论文 |
| English article Ⅰ |
| English article Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌损伤标志物、凋亡指数和形态学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞自噬的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP通路的调控作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录一 文献综述 心肌缺血再灌注损伤相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图二 |
| 附录三 读博期间发表论文、科研情况 |
| 致谢 |
（5）基于TXNIP/NLRP3途径研究益气活血药对心梗后内质网应激诱发细胞焦亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 益气活血类中药保护缺血性心肌病的作用机制及在内质网应激方面的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 心肌细胞死亡形式及其在心血管疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 益气活血药对心梗大鼠心脏功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 益气活血药对心肌梗死大鼠内质网应激和细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 益气活血药对缺血缺氧诱导的H9c2心肌细胞活力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 益气活血药对缺糖缺氧诱导的H9c2心肌细胞内质网应激和细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）神经病理性疼痛对心肌缺血再灌注损伤的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述疼痛对缺血再灌注损伤心肌的影响及机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）右美托咪定对窒息大鼠心肺复苏后神经细胞凋亡和自噬的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 右美托咪定对缺血缺氧后脑神经细胞凋亡和自噬影响的作用机制 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 英文对照缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表论文 |
| 致谢 |
（8）太白楤木总皂苷及其单体成分对脑卒中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 太白楤木简介 |
| 1.1.1 太白楤木分布情况 |
| 1.1.2 太白楤木的主要化学成分 |
| 1.1.3 太白楤木皂苷的药理学作用 |
| 1.2 脑卒中的发病机制和治疗现状 |
| 1.2.1 脑卒中的发病机制 |
| 1.2.2 氧化应激、线粒体功能障碍和CI/RI |
| 1.2.3 缺血性脑卒中的治疗手段 |
| 1.3 中药皂苷对缺血性脑卒中的治疗作用 |
| 1.3.1 抑制炎症反应 |
| 1.3.2 抑制氧化应激 |
| 1.3.3 改善能量代谢 |
| 1.3.4 抑制细胞凋亡 |
| 1.3.5 改善脑血管循环 |
| 1.3.6 抑制兴奋性氨基酸损伤 |
| 1.4 Apelin13 在缺血性脑卒中治疗中的重要作用 |
| 1.4.1 Apln基因简介 |
| 1.4.2 Apelin13 具有明确的脑保护作用 |
| 1.4.3 Apelin和缺血再灌注损伤 |
| 1.5 展望 |
| 第二章 sAT的脑保护作用研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 sAT的提取和纯化 |
| 2.3.2 总皂苷含量测定 |
| 2.3.3 动物实验 |
| 2.3.4 细胞实验 |
| 2.3.5 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.3.6 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 sAT减轻MCAO/R引起的脑损伤 |
| 2.4.2 sAT减轻MCAO/R引起的脑组织凋亡 |
| 2.4.3 sAT抑制脑组织内氧化应激水平 |
| 2.4.4 sAT减轻OGD/R引起的细胞损伤 |
| 2.4.5 sAT抑制OGD/R引起的细胞凋亡 |
| 2.4.6 sAT抑制OGD/R引起的氧化应激水平 |
| 2.4.7 sAT保护线粒体的功能 |
| 2.5 讨论和小结 |
| 第三章 网络药理学技术筛选sAT的潜在作用靶点 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 太白楤木皂苷单体成分及靶点信息收集 |
| 3.3.2 脑卒中靶点 |
| 3.3.3 交集靶点 |
| 3.3.4 共同靶点网络构建 |
| 3.3.5 靶点通路注释分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 太白楤木皂苷靶点预测结果 |
| 3.4.2 脑卒中相关靶点收集 |
| 3.4.3 共同靶点 |
| 3.4.4 共同靶点PPI网络构建 |
| 3.4.5 基因功能富集分析 |
| 3.4.6 通路富集分析结果 |
| 3.5 讨论和小结 |
| 第四章 sAT通过调控AMPK/Akt信号通路发挥脑保护作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 细胞转染 |
| 4.3.3 抑制剂的使用 |
| 4.3.4 免疫沉淀技术 |
| 4.3.5 Western blotting检测蛋白表达 |
| 4.3.6 线粒体膜电位测定 |
| 4.3.7 ATP含量测定 |
| 4.3.8 细胞存活率测定 |
| 4.3.9 细胞凋亡率测定 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 sAT对 AMPK和 Akt的激活作用 |
| 4.4.2 sAT对 SIRT1/FOXO3/PGC-1 信号通路的激活作用 |
| 4.4.3 sAT通过Akt调控SIRT1 信号通路 |
| 4.4.4 sAT对 AMPK和 Akt的交互调节作用 |
| 4.5 讨论和小结 |
| 第五章 sAT通过P38 MAPK/ATF4和HIF-1α调控Apelin 13/AMPK/Akt信号通路 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 侧脑室注射给药 |
| 5.3.2 sAT处理 |
| 5.3.3 MCAO/R模型 |
| 5.3.4 TTC染色 |
| 5.3.5 神经功能学评分 |
| 5.3.6 脑组织含水量 |
| 5.3.7 S-100β和NSE含量测定 |
| 5.3.8 Western blotting测定蛋白表达 |
| 5.3.9 RT-PCR测定Apln和 Aplnr mRNA表达 |
| 5.3.10 抑制剂和激活剂使用方法 |
| 5.3.11 细胞转染 |
| 5.3.12 细胞凋亡率测定 |
| 5.3.13 ROS含量 |
| 5.3.14 细胞存活率 |
| 5.3.15 线粒体膜电位 |
| 5.3.16 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 sAT促进Aplein13 蛋白和基因的表达 |
| 5.4.2 Apelin13对MCAO/R引起的脑损伤具有保护作用 |
| 5.4.3 sAT通过Apelin13调控AMPK/Akt信号通路 |
| 5.4.4 sAT对 P38 MAPK和 ATF4 表达的影响 |
| 5.4.5 sAT通过抑制P38 MAPK/ATF4 促进Apelin13 表达 |
| 5.4.6 sAT对 HIF-1α表达的影响 |
| 5.4.7 sAT通过上调HIF-1α促进Apelin13 表达 |
| 5.5 讨论和小结 |
| 第六章 筛选太白楤木皂苷的主要活性成分并进行验证 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 化合物 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 细胞OGD/R模型 |
| 6.3.2 RT-PCR测定单体对Apln表达的影响 |
| 6.3.3 细胞转染 |
| 6.3.4 荧光素酶报告基因检测 |
| 6.3.5 Western blotting |
| 6.3.6 统计分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 不同皂苷单体对Apln基因表达的影响 |
| 6.4.2 不同皂苷单体对HRE的调控作用 |
| 6.4.3 不同皂苷单体对C/EBPβ的调控作用 |
| 6.4.4 皂苷单体分别对HIF-1α的调控作用验证 |
| 6.4.5 皂苷单体分别对P38 MAPK/ATF4 的调控作用验证 |
| 6.5 讨论和小结 |
| 总结与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士/硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）牛磺酸抑制低温环境下肉鸡右心肥厚机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 肉鸡右心肥厚的概述 |
| 1.1.1 肉鸡右心肥厚的定义与诊断标准 |
| 1.1.2 肉鸡右心肥厚的发病机理 |
| 1.1.3 肉鸡右心肥厚的预防 |
| 1.2 心肌肥厚与心力衰竭 |
| 1.2.1 心肌肥厚的概述与病因 |
| 1.2.2 心肌肥厚的发病机理 |
| 1.2.3 肾素-血管紧张素-醛固酮系统与心肌肥厚的关系 |
| 1.2.4 儿茶酚胺类激素与心肌肥厚的关系 |
| 1.2.5 氧化应激与心肌肥厚的关系 |
| 1.2.6 线粒体稳态在心肌肥厚病程中的作用 |
| 1.2.7 心力衰竭与心肌肥厚的关系 |
| 1.2.8 心功能障碍与细胞凋亡的关系 |
| 1.3 线粒体依赖性细胞凋亡 |
| 1.3.1 线粒体依赖性细胞凋亡的触发机制 |
| 1.3.2 Calpains家族的概述 |
| 1.3.3 Calpains与线粒体依赖性细胞凋亡的关系 |
| 1.4 牛磺酸的概述 |
| 1.4.1 牛磺酸的起源与基本性质 |
| 1.4.2 牛磺酸对心肌肥厚的影响 |
| 1.4.3 牛磺酸对心脏Ca~(2+)的调节作用 |
| 1.4.4 牛磺酸的抗氧化特性 |
| 1.4.5 牛磺酸在心脏中对儿茶酚胺类激素的调节作用 |
| 1.4.6 牛磺酸在心脏中对AngⅡ的调节作用 |
| 1.4.7 牛磺酸的抗凋亡作用 |
| 1.5 本研究的目的与意义及研究内容和技术路线 |
| 第二章 牛磺酸通过抑制calpain-1/cytochrome c通路预防RVH肉鸡心肌细胞凋亡 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 动物日粮 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 饲养管理及分组 |
| 2.2.2 右心肥厚指数(RVHI)的测定 |
| 2.2.3 NE含量的测定 |
| 2.2.4 AngⅡ含量的测定 |
| 2.2.5 线粒体的分离及胞质蛋白的提取 |
| 2.2.6 MMP的测定 |
| 2.2.7 RNA的提取 |
| 2.2.8 反转录 |
| 2.2.9 Real Time PCR |
| 2.2.10 GSSG/GSH的测定 |
| 2.2.11 GSH-px的测定 |
| 2.2.12 总SOD的测定 |
| 2.2.13 T-AOC的检测 |
| 2.2.14 蛋白印迹法 |
| 2.2.15 数据的统计与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 牛磺酸降低了低温条件下肉鸡的RVHI |
| 2.3.2 牛磺酸降低了低温条件下肉鸡心肌组织中NE、AngⅡ的浓度 |
| 2.3.3 牛磺酸提高了低温条件下肉鸡心肌细胞的抗氧化能力 |
| 2.3.4 牛磺酸降低了低温条件下肉鸡的心肌细胞凋亡 |
| 2.3.5 低温条件下牛磺酸通过下调线粒体依赖性凋亡通路抑制肉鸡心肌细胞凋亡 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 在H9c2心肌细胞中牛磺酸对ISO诱导的线粒体依赖性凋亡的调控机制 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要器械及仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 H9c2细胞培养 |
| 3.2.2 牛磺酸浓度的优化 |
| 3.2.3 细胞试验的注意事项 |
| 3.2.4 细胞表面积的测定 |
| 3.2.5 胞内Ca~(2+)浓度的检测 |
| 3.2.6 胞内ROS浓度的检测 |
| 3.2.7 siRNA的转染 |
| 3.2.8 细胞凋亡率的检测 |
| 3.2.9 MMP的检测 |
| 3.2.10 蛋白印迹法 |
| 3.2.11 数据的统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 牛磺酸对心肌细胞活力的影响 |
| 3.3.2 牛磺酸可减少ISO诱导的心肌细胞肥厚 |
| 3.3.3 牛磺酸可抑制ISO诱导的心肌细胞内Ca~(2+)和ROS的上调 |
| 3.3.4 牛磺酸可减少ISO诱导的心肌细胞凋亡 |
| 3.3.5 牛磺酸通过抑制calpain-1/cytochrome c通路抑制ISO诱导的心肌细胞凋亡 |
| 3.3.6 牛磺酸通过调节calpain-1和caspase-9 抑制线粒体依赖性的心肌细胞凋亡 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
（10）基于调控线粒体动力学探究右美托咪定对LPS诱导大鼠急性肾损伤的保护作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 脓毒症的相关概述 |
| 1.2 脓毒症致急性肾损伤的概述 |
| 1.2.1 脓毒症致AKI的研究进展 |
| 1.2.2 脓毒症致AKI的生物标志物 |
| 1.2.3 脓毒症与肾小管细胞损伤 |
| 1.3 脓毒症致急性肾损伤发病机制的研究概况 |
| 1.3.1 脓毒症致AKI与肾脏微循环 |
| 1.3.2 脓毒症致AKI与炎症反应 |
| 1.3.3 脓毒症致AKI与氧化应激 |
| 1.3.4 脓毒症致AKI与线粒体动力学 |
| 1.3.5 脓毒症致AKI与线粒体功能障碍 |
| 1.3.6 脓毒症致AKI与细胞凋亡 |
| 1.4 脓毒症致急性肾损伤中线粒体动力学调控机制的研究进展 |
| 1.4.1 细胞内钙超载与线粒体动力学 |
| 1.4.2 SITR1/PGC-1α通路与线粒体动力学 |
| 1.5 脓毒症致急性肾损伤的治疗进展 |
| 1.5.1 液体复苏 |
| 1.5.2 血管活性药物 |
| 1.5.3 药物治疗策略 |
| 1.5.4 RRT疗法 |
| 1.6 右美托咪定及其药理作用的研究现状 |
| 1.6.1 DEX与微循环障碍 |
| 1.6.2 DEX与炎症反应 |
| 1.6.3 DEX与氧化应激 |
| 1.6.4 DEX与细胞凋亡 |
| 1.6.5 DEX与线粒体功能障碍 |
| 1.6.6 DEX与 SIRT1/PGC-1α通路 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验细胞 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要药品与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 在体试验分组及模型建立 |
| 2.2.2 大鼠尿液、血液及肾脏组织的收集 |
| 2.2.3 大鼠肾脏功能的检查 |
| 2.2.4 大鼠血清/细胞培养液炎症因子检查 |
| 2.2.5 大鼠肾脏组织病理学观察 |
| 2.2.6 大鼠肾组织/细胞氧化应激指标的检测 |
| 2.2.7 TUNEL肾脏组织细胞凋亡检测 |
| 2.2.8 大鼠肾组织线粒体形态和MMP检测 |
| 2.2.9 大鼠肾组织线粒体功能检测 |
| 2.2.10 大鼠肾组织钙调神经磷酸酶(CaN)活性检测 |
| 2.2.11 大鼠肾组织免疫组化检测 |
| 2.2.12 大鼠肾组织免疫荧光双染和三染观察 |
| 2.2.13 小干扰RNA(siRNA)转染 |
| 2.2.14 CCK-8检测细胞存活率 |
| 2.2.15 NRK-52E细胞培养及分组 |
| 2.2.16 乳酸脱氢酶(LDH)的检测 |
| 2.2.17 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡 |
| 2.2.18 细胞线粒体形态和MMP的检测 |
| 2.2.19 细胞线粒体功能的检测 |
| 2.2.20 细胞内ROS和线粒体ROS含量的测定 |
| 2.2.21 细胞免疫荧光单/双染检测 |
| 2.2.22 细胞内Ca~(2+)浓度检测 |
| 2.2.23 大鼠肾脏/细胞RNA提取和实时荧光定量PCR检测 |
| 2.2.24 大鼠肾脏/细胞蛋白样品的制备及Western blot实验 |
| 2.3 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DEX对 AKI大鼠肾脏功能的影响 |
| 3.2 DEX对 AKI大鼠血清炎症因子的影响 |
| 3.3 DEX对 AKI大鼠肾脏组织结构的影响 |
| 3.3.1 DEX对 AKI大鼠肾脏组织显微结构的影响 |
| 3.3.2 DEX对 AKI大鼠肾脏组织超微结构的影响 |
| 3.4 DEX对 AKI大鼠肾脏组织氧化应激水平的影响 |
| 3.5 DEX对 AKI大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响 |
| 3.5.1 DEX对 AKI大鼠肾脏细胞凋亡情况的观察 |
| 3.5.2 DEX对 AKI大鼠肾脏线粒体凋亡途径关键蛋白表达的影响 |
| 3.5.3 DEX对 AKI大鼠肾脏线粒体凋亡途径关键基因表达的影响 |
| 3.5.4 DEX对 AKI大鼠肾脏Bax与线粒体共定位的影响 |
| 3.6 DEX对 AKI大鼠肾脏组织线粒体的影响 |
| 3.6.1 DEX对 AKI大鼠肾脏组织线粒体结构的影响 |
| 3.6.2 DEX对 AKI大鼠肾脏组织线粒体功能的影响 |
| 3.7 DEX对 AKI大鼠肾脏组织线粒体动力学的影响 |
| 3.7.1 DEX对 AKI大鼠肾脏线粒体分裂和融合关键蛋白表达的影响 |
| 3.7.2 DEX对 AKI大鼠肾脏线粒体分裂和融合关键基因表达的影响 |
| 3.7.3 DEX对 AKI大鼠肾脏组织Drp1与Fis1 和线粒体共定位的影响 |
| 3.8 DEX对 AKI大鼠肾组织CaMKII和 Calcineurin的影响 |
| 3.8.1 DEX对 AKI大鼠肾组织CaMKII和 Calcineurin蛋白表达的影响 |
| 3.8.2 DEX对 AKI大鼠肾脏组织CaMKII基因表达的影响 |
| 3.8.3 DEX对 AKI大鼠肾脏组织p-CaMKII定位表达的影响 |
| 3.8.4 DEX对 AKI大鼠肾脏组织Calcineurin活性的影响 |
| 3.9 DEX对 AKI大鼠肾脏组织SIRT1/PGC-1α信号通路的影响 |
| 3.9.1 DEX对 AKI大鼠肾脏组织SIRT1和PGC-1α蛋白表达的影响 |
| 3.9.2 DEX对 AKI大鼠肾脏组织SIRT1和PGC-1α基因表达的影响 |
| 3.9.3 DEX对 AKI大鼠肾脏组织SIRT1和PGC-1α定位表达的影响 |
| 3.10 Drp1、SIRT1和PGC-1α最佳有效序列的筛选 |
| 3.10.1 Drp1、SIRT1和PGC-1αmRNA的不同序列表达情况 |
| 3.10.2 Drp1、SIRT1和PGC-1α蛋白表达情况 |
| 3.11 DEX拮抗LPS致 NRK-52E细胞毒性检测项目结果 |
| 3.11.1 不同浓度LPS刺激对NRK-52E细胞存活率的影响 |
| 3.11.2 不同浓度DEX对 LPS诱导NRK-52E细胞存活率的影响 |
| 3.12 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞形态改变的影响 |
| 3.13 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞LDH释放的影响 |
| 3.14 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞炎症反应的影响 |
| 3.15 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞氧化应激的影响 |
| 3.16 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞凋亡的影响 |
| 3.16.1 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞凋亡的观察 |
| 3.16.2 DEX对 LPS诱导的线粒体凋亡途径相关蛋白表达的影响 |
| 3.16.3 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞Bax与线粒体共定位的影响 |
| 3.17 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞线粒体的影响 |
| 3.17.1 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞线粒体结构的影响 |
| 3.17.2 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞线粒体功能的影响 |
| 3.18 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞线粒体动力学的影响 |
| 3.18.1 DEX对 LPS诱导的线粒体分裂和融合关键蛋白表达的影响 |
| 3.18.2 DEX对 LPS诱导的线粒体分裂和融合关键基因表达的影响 |
| 3.18.3 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞Drp1 与线粒体共定位的影响 |
| 3.18.4 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞Mfn2 与线粒体共定位的影响 |
| 3.19 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞内Ca~(2+)稳态失衡的影响 |
| 3.19.1 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞内Ca~(2+)水平变化的影响 |
| 3.19.2 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞CaMKII蛋白表达的影响 |
| 3.19.3 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞p-CaMKII荧光表达的影响 |
| 3.20 SIRT1/PGC-1α通路在DEX调节线粒体动力学平衡中的作用 |
| 3.20.1 DEX对 LPS诱导的SIRT1和PGC-1α蛋白表达的影响 |
| 3.20.2 DEX对 LPS诱导的NRK-52E细胞SIRT1 荧光表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 动物模型建立及药物剂量时间选择依据 |
| 4.2 NRK-52E细胞选择依据及药物剂量筛选 |
| 4.3 DEX对 LPS诱导的大鼠AKI肾功能的影响 |
| 4.4 DEX对 LPS诱导的大鼠AKI肾组织病理学及超微结构的影响 |
| 4.5 DEX对 LPS诱导的炎症反应的影响 |
| 4.6 DEX对 LPS诱导的氧化应激的影响 |
| 4.7 DEX对 LPS诱导的细胞凋亡的影响 |
| 4.7.1 DEX对 LPS诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响 |
| 4.7.2 DEX对 LPS诱导的线粒体凋亡途径的影响 |
| 4.8 DEX对 LPS诱导的线粒体损伤的影响 |
| 4.8.1 DEX对 LPS诱导的线粒体结构损伤的影响 |
| 4.8.2 DEX对 LPS诱导的线粒体功能障碍的影响 |
| 4.9 DEX对 LPS诱导的线粒体动力学失衡的影响 |
| 4.10 Ca~(2+)介导的信号转导参与DEX干预LPS诱导Drp1 磷酸化 |
| 4.11 SIRT1/PGC-1α通路在DEX干预LPS诱导线粒体动力学失衡中的作用 |
| 5 结论 |
| 特色与创新之处 |
| 研究不足之处 |
| 研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
四、NAC对大鼠I/R心肌细胞凋亡及bad、bak、bax的影响（论文参考文献）
- [1]基于线粒体功能探讨二参颗粒对心肌缺血模型的保护作用及相关机制研究[D]. 柴晶美. 长春中医药大学, 2021(01)
- [2]罗布麻叶总黄酮及异槲皮苷对吡柔比星致心脏损伤的保护作用和机制[D]. 张洋. 吉林大学, 2021(01)
- [3]PHLPP1及达格列净在糖尿病心肌病中的作用及其机制研究[D]. 张铭珺. 山东大学, 2021
- [4]电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用[D]. 李晨. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [5]基于TXNIP/NLRP3途径研究益气活血药对心梗后内质网应激诱发细胞焦亡的影响[D]. 王惠. 北京中医药大学, 2021(02)
- [6]神经病理性疼痛对心肌缺血再灌注损伤的影响及机制研究[D]. 李玉为. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]右美托咪定对窒息大鼠心肺复苏后神经细胞凋亡和自噬的影响及其机制研究[D]. 陆件. 苏州大学, 2021(06)
- [8]太白楤木总皂苷及其单体成分对脑卒中的作用及机制研究[D]. 段佳林. 西北大学, 2020(01)
- [9]牛磺酸抑制低温环境下肉鸡右心肥厚机理研究[D]. 李伟伟. 沈阳农业大学, 2020(03)
- [10]基于调控线粒体动力学探究右美托咪定对LPS诱导大鼠急性肾损伤的保护作用机制[D]. 冯秀晶. 东北农业大学, 2020