一、转座子挽救法对苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关基因的定位（论文文献综述）
黄成文[1]（2018）在《西瓜食酸菌抗铜相关基因tolC和gntR的鉴定与功能分析》文中进行了进一步梳理细菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch,BFB）是一种严重危害葫芦科植物的种传细菌性病害,其病原菌为西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）。该病害自爆发以来,在世界各地迅速传播,使得葫芦科作物受到巨大的损失。目前,使用含铜制剂是大田防控BFB的主要措施,但是铜的过量使用不仅会导致土壤污染,同时还发现了西瓜食酸菌抗铜菌株的出现。因此,探究该病菌的抗铜机制,可以为研究开发有效防控BFB的新方法、新措施提供理论依据。基于此,本研究通过对西瓜食酸菌FC440菌株的Tn5转座子插入突变体库的筛选,获得两个抗铜能力改变的突变体。利用生物信息学分析、基因功能互补等手段,鉴定出2个与西瓜食酸菌抗铜机制相关的基因,并且对基因的功能进行了验证。主要结果如下:本研究首先比较了西瓜食酸菌基因功能研究中常用的表达载体p BBR1MCS-5和p HC60对菌的生物学特性的影响。实验结果表明:表达载体p BBR1MCS-5对菌株的胞外纤维素酶活性、胞外蛋白酶活性、胞外多糖含量、游动性、致病性和诱导过敏性坏死反应能力、生长速率以及抗铜性等方面未表现出显着影响,而表达载体p HC60会显着抑制宿主菌株的生长速率和游动性。由此说明,表达载体本身会影响西瓜食酸菌的某些生物学特性,在基因功能研究中应依据所研究基因的功能选择适宜的表达载体。本研究中基因功能分析表达载体选用p BBR1MCS-5。本研究筛选西瓜食酸菌FC440菌株的Tn5转座子插入突变体库,获得2株抗铜能力减弱的突变体。利用质粒挽救法获得这2株突变体的突变位点分别与西瓜食酸菌AAC00-1菌株的Aave-1811和Aave-2798基因同源;生物信息学分析显示,基因Aave-1811和Aave-2798分别编码TolC外膜蛋白和GntR家族转录调控因子。本研究比较发现西瓜食酸菌AAC00-1、FC440、XJL12和AW0601四个菌株的tolC基因的大小相同均为1488 bp,但核酸序列存在差异,其中FC440菌株的与AW0601菌株的一致,AAC00-1菌株的与XJL12菌株的一致。结构预测分析表明,TolC蛋白可以分泌大小为18～19氨基酸的信号肽,该蛋白在20～30氨基酸处疏水性较高,存在一个跨膜区,亚细胞定位于周质空间。以TolC蛋白为标记的进化树分析显示,西瓜食酸菌与燕麦食酸菌（Acidovorax avenae）的亲缘关系较近;大肠杆菌（Escherichia coli）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的亲缘关系较近。突变体FC440（?tolC）菌株在含3.75 mmol/L Cu SO4的KMB培养基上已失去生长能力,其基因功能互补菌株在含3.75 mmol/L Cu SO4的KMB培养基中生长能力部分恢复,证明TolC蛋白参与了西瓜食酸菌的抗铜机制;基因tolC的突变未影响西瓜食酸菌除抗铜性外的其它生物学特性,说明TolC未参与到该菌的这些生理活动中。西瓜食酸菌FC440菌株的GntR家族转录调控因子的基因全长为1041 bp。蛋白序列分析显示不产生信号肽,在185～195氨基酸处疏水性较高,存在一段跨膜结构域,理化性质的分析表明该蛋白为不稳定蛋白质,亚细胞定位在细胞质中。进化树分析显示,西瓜食酸菌GntR家族转录调控因子与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的亲缘关系较近,与大肠杆菌的亲缘关系较远。突变体FC440（?gnt R）菌株在含3.75 mmol/L Cu SO4的KMB培养基中生长能力减弱,其基因功能互补菌株在含5.625 mmol/L Cu SO4培养基中生长能力完全恢复,证明GntR家族转录调控因子对西瓜食酸菌的抗铜性有贡献;gnt R基因突变未影响菌的除抗铜能力外的其它生物学特性,说明GntR家族转录调控因子与菌的这些生理活动无显着相关性。本研究结果表明西瓜食酸菌中的TolC和GntR蛋白参与了该菌的抗铜机制。
周美丽[2]（2014）在《骆驼刺中慢生根瘤菌CCNWXJ12-2T全基因组测序及耐盐相关功能基因的研究》文中提出根瘤菌与豆科植物骆驼刺所形成的共生体系在西北干旱半干旱荒漠地区具有很好的生存能力，该共生体系能很好的在盐碱地生存并表现极强的抗逆特性，在防风固沙，防止沙漠化蔓延中起到及其重要的作用。骆驼刺中慢生根瘤菌Mesorhizobium alhagiXJ12-2T分离自新疆的疏叶骆驼刺，是实验室具有自主知识产权的新种。对该菌株进行了抗逆性研究，结果发现该菌株具有非常强的抗逆特性，能够耐受5%的NaCl，并且能在pH512的范围内良好生长。为了揭示M. alhagi CCNWXJ12-2T的耐盐分子机制，本文通过转座子突变技术对该菌耐盐相关功能基因进行来了鉴定，结合全基因组测序对该菌的渗透调节网络进行了分析预测。通过pRL27对M. alhagi CCNWXJ12-2T进行插入诱变，建立了库容达15000多的转座子突变体库，对突变体库中的结合子进行多次盐敏感筛选，获得了4株盐敏感突变株。这4株盐敏感突变株都对NaCl呈现不同程度的高度敏感性状，并且表现出非常稳定的敏感特性。生长测定发现，在NaCl浓度为0.3mol/L的水平上，突变体Mam1、Mam2、Mam3呈现非常明显的盐敏感性状，生长量不到野生菌M. alhagi CCNWXJ12-2T生长量的1/2，而突变体Mam4则尤为明显，随着NaCl浓度的增加呈非常明显的生长减弱趋势；同时，这4株菌对KCl也表现出敏感性状，而对LiCl、Na2SO4及蔗糖的敏感性不是很明显，预示相关基因在耐盐方面具有独特功能。运用转座子挽救法对转座子侧翼序列进行了克隆，在获得4个突变体Mam1、Mam2、Mam3和Mam4中，Tn5分别插入到了不同的基因中，命名为xj952、xj3794、xj1521和xj274。与全基因组测序结果进行比对，确定了突变基因在全基因组的位置并绘制了突变基因及侧翼基因的物理图谱，同时运用多种方法对这4个突变基因的功能进行预测及分析。xj952基因所编码假定蛋白MAXJ12004699可能为一个多药物抗性EamA家族膜转运蛋白；xj3794基因编码的蛋白为5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶；xj1521基因编码的蛋白为假定外膜分泌蛋白MAXJ1200972；xj274基因所编码假定蛋白MAXJ1201324可能为酰基转移酶家族的膜蛋白。通过三亲杂交，利用功能互补质粒pBBR1-MCS5将全长的xj952、xj3794、xj1521和xj274这4个基因导入到相应的盐敏感突变株中进行了功能互补验证。对功能互补菌在0.4mol/L NaCl的生长情况进行测定，结果发现相较于突变体，各功能互补菌在0.4mol/L NaCl条件下的生长均得到不同程度的恢复，其中突变体Mam1、Mam3生长量恢复到原菌的一半，而突变体Mam2、Mam4的生长量恢复程度要小一些，恢复到原菌的1/3，表明这四个基因确实和盐耐受性相关，在根瘤菌渗透调节及保护耐受胁迫方面发挥着作用。采用Illumina HiSeq2000platform测序平台对M. alhagi CCNWXJ12-2T进行全基因组测序，测序工作由华大基因完成。对测序所得序列进行了拼接并完成了精细图的绘制。对获得的基因参照蛋白库KEGG、COG、SwissProt、TrEMBL、NR进行功能注释，全面分析了M. alhagi CCNWXJ12-2T全基因组序列特征，以及潜在的渗透调节相关基因。全基因组预测得到377个与渗透调节有关的基因，包括大量的参与渗透调节的转运系统及相容性溶质合成及转运基因。根据已有研究结果对这些基因进行归类分析，绘制了该菌可能的渗透调节网络。通过我们的实验，在M. alhagi CCNWXJ12-2T中，首次鉴定了3个新的基因，命名为xj952、xj1521和xj274，分别编码假定蛋白MAXJ12004699、假定外膜分泌蛋白MAXJ1200972、假定MAXJ1201324与该菌的耐盐性相关，同时鉴定了一个已知编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的基因xj3794，也与该菌的耐盐性有关。通过全长扩增、序列分析、功能预测、亚细胞定位及胞外多糖分析等方法从多方面系统的分析了突变基因的功能及与该菌耐盐性的关系。
刘君[3]（2012）在《西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）Tn5转座子插入突变体的制备和致病性缺失突变体的鉴定与分析》文中进行了进一步梳理由西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）引起的细菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）是西瓜、甜瓜以及其它葫芦科植物的一种重要种传细菌病害。二十世纪八十年代以来，BFB在世界范围内蔓延传播，导致葫芦科作物生产，尤其是西甜瓜的果品生产和制种业蒙受巨大损失。由于致病菌的抗药性、现有化学杀菌剂的局限性以及抗病材料的缺乏，BFB已经成为全球葫芦科作物产业安全的严重威胁。目前世界范围内对BFB的研究刚刚起步，对病菌致病的生物学和分子生物学基础的认知非常有限。研究BFB病菌的致病机理，是开发有效控制BFB新途径、新方法的基础。为了有效发掘并推进对西瓜食酸菌的致病相关基因的鉴定与功能研究，本研究以不同亚群的西瓜食酸菌菌株、不同黄瓜器官为材料，研究建立西瓜食酸菌与黄瓜互作的模式病害体系；利用Tn5转座子插入诱变技术，构建西瓜食酸菌的突变体库，并从中筛选鉴定西瓜食酸菌致病相关的基因；结合生物信息学分析和基因功能互补等手段，对部分候选基因进行了功能分析。主要研究内容及结果如下：1.在实验条件下，确认西瓜食酸菌能够侵染和定殖包括果实在内的黄瓜地上部所有器官，而且西瓜食酸菌亚群I菌株对黄瓜的致病性强于亚群II菌株。以西瓜食酸菌亚群I菌株为接种材料，以5mmol·L-1PBS悬浮、106cells接种量划伤接种离体幼嫩（20d）黄瓜叶片可应用于病菌致病性的评定，但重复性有限；而以6d的活体黄瓜子叶为材料，划伤接种107cells、ddH2O悬浮的亚群I菌株分析BFB病症严重度的西瓜食酸菌-黄瓜互作体系，周期短、操作简单、重复性好，适用于西瓜食酸菌致病性的评定以及致病性改变突变体的规模化筛选。2.西瓜食酸菌属于转座子诱变较难的细菌；以转座子Tn5诱变时，通过延长双亲结合杂交时间、延长初次抗生素筛选结合子的时间、每个杂交组合收集一个独立菌落以及至少三轮的抗生素选择的方法，获得了包含约2100个的转座子插入随机且单一、遗传稳定的西瓜食酸菌突变体库。利用西瓜食酸菌–黄瓜亲和互作体系，筛选获得多个致病性改变的突变体。这一结果，不仅证实了西瓜食酸菌-黄瓜模式病害体系的有效性，同时表明所构建的突变体库为开展西瓜食酸菌的生物学和病理学研究提供了重要的资源。3.聚类分析以及基因功能互补实验证实，西瓜食酸菌基因组的预测III型分泌系统ATPase（T3SS ATPase）属于非鞭毛III型分泌系统ATPase（NF-T3SS ATPase），即HrcN蛋白，其缺失导致病菌丧失对寄主的致病性和诱导非寄主产生HR的能力，是西瓜食酸菌致病性和NF-T3SS功能的必需因子；系统进化分析表明西瓜食酸菌的NF-T3SS属于含茄科雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌的NF-T3SS亚群II。4.蛋白质序列比较分析显示，西瓜食酸菌中的预测葡萄糖抑制分裂型蛋白A （GidA）与其它模式病原细菌中的与致病性相关的GidA蛋白相似度高；基因组核酸序列分析显示，西瓜食酸菌的GidA基因与下游GidB基因转录区域重叠，其上下游基因种类也同其它模式病原细菌的GidA基因间存在差异，暗示西瓜食酸菌GidA蛋白在功能上可能有别于其它致病菌中的同源物；GidA缺失导致西瓜食酸菌的毒力急剧降低、菌的抽动运动性丧失，基因功能互补实验证实GidA是西瓜食酸菌的毒性因子并参与调控菌的抽动运动性。
马占强[4]（2011）在《苜蓿中华根瘤菌CCNWSX0020抗铜基因的克隆与功能验证》文中研究指明根瘤菌是土壤中广泛分布的一类能与豆科植物共生结瘤固氮的重要农业微生物资源,根瘤菌—豆科植物的共生固氮体系是生物固氮体系的重要组成。苜蓿中华根瘤菌（S. meliloti）CCNWSX0020分离自陕西凤县重金属尾矿的天蓝苜蓿（Medicago lupulin）,能抗高达1.8 mM CuSO4。本文利用Tn5-1063a转座子对S. meliloti CCNWSX0020进行随机突变,建立了一个库容达14000余个突变株库,从中筛选得到在0.8 mM CuSO4的YMA培养基上不能生长的6株铜敏感性突变株SXa-1、SXa-2、SXc-1、SXc-2、SXn和SXy。重金属抗性表明SXc-1、SXc-2、SXn和SXy对ZnSO4表现出一定程度的敏感性,而SXa-1和SXa-2对ZnSO4不多敏感,暗示了SXc-1、SXc-2、SXn和SXy中的突变基因可能与阳离子转运有关或者Zn2+参与这些突变株的某些代谢途径;对Pb（NO3）2抗性测定表明只有SXc-1、SXc-2和SXy对Pb（NO3）2较为敏感,其余突变株则对Pb（NO3）2敏感性较弱,进一步表明这三株突变株突变基因可能与二价阳离子运输有关。利用Tn5-1063a可以自连成环并具有自我复制的功能,对突变株的全基因组DNA进行酶切并自连,再根据Tn5-1063a两端的已知序列设计引物,对其PCR扩增,PCR产物电泳谱图显示6株突变株都只有单拷贝插入,表明突变株的铜敏感表型是由于转座子插入造成的。进而对其两翼序列进行测序,结果表明,6株突变株是由4个基因突变引起的,其中SXa-1和SXa-2是由lpxXL基因突变所致,该基因编码产物为LpxXL C28-酰基转移酶;SXc-1和SXc-2是由cueR基因突变所致,该基因是MerR家族中一种,是铜抗性基因copA和cueO的调控基;SXn是转座子插入到S. meliloti 1021的SMc02281内部,该基因编码未知膜蛋白,与Agrobacterium sp. H13-3的铜抗性蛋白CopB同源性为74.63%,以此本文把该基因定位copB;SXy由fixI1基因突变造成的,该基因是E1-E2 ATPase家族中一个基因,是一种阳离子泵,且参与细胞有氧呼吸的电子传递过程。根据突变株的测序结果,PCR扩增得到含启动子的全长片段,将其克隆到穿梭载体pBBR1MCS-5上,三亲杂交将各个基因转入到相应的突变株中,结果发现SXy-1可以在1.2 mM CuSO4固体平板上恢复生长,其它突变株都可以在1.5 mM CuSO4平板上恢复生长,进一步证明这些基因与S. meliloti CCNWSX0020的抗铜性有关。结瘤实验表明,lpxXL和fixI1基因的显着降低了与宿主植物的结瘤数目;盆栽实验表明,当培养基质中CuSO4含量高于47.36 mg/kg时,与接种野生型菌株相比,所有突变株接种的宿主植物的根茎干重都显着降低,且根茎中的铜含量也显着降低,说明突变株已经影响到宿主植物的生长和对的铜吸收,也可以间接说明突变基因与铜离子的运输有关。
郝凤[5]（2010）在《AFP、CBF2基因表达载体的构建及其对苜蓿遗传转化的研究》文中进行了进一步梳理低温是限制植物分布与生长的重要因素,低温伤害是一种严重的自然灾害,全球每年因此造成农作物的损失高达数千亿美元。苜蓿（Medicago sativa）为暖温带重要的牧草,对温度反应敏感。低温是制约其生长的主要限制因子,如何提高苜蓿的抗寒性对提高其生产力有重要的意义,利用现代生物学技术进行植物抗冻性分子改良具有高效性和针对性。本研究成功地从胡萝卜和拟南芥中克隆了抗冻蛋白基因AFP和抗冻基因CBF2,并分别构建了植物表达载体并将其导入农杆菌中;还针对目前农杆菌介导转化法中存在的转化率低的问题,对苜蓿的遗传转化体系进行了优化;已通过农杆菌介导转化法,将构建好的AFP、CBF2抗冻基因植物表达载体分别转化到了优良苜蓿品种中。本研究主要成果如下:1.分别以胡萝卜和拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR方法,成功地克隆了全长1200bp的抗冻蛋白基因AFP和全长700bp的抗冻基因CBF2,转化大肠杆菌DH5α,采用IPTG诱导,使宿主菌重组子表达特异的抗冻基因。2.通过双酶切,将其分别连接到PBI121工程质粒上,成功地构建了含有卡那霉素抗性选择标记的植物表达载体P-T-AFP和P-T-CBF2,并通过直接转化法将其导入农杆菌EHA105中。3.遗传转化体系的建立。以培养7天的和田苜蓿的无菌苗子叶为外植体,以农杆菌菌株为介体,预培养3天,侵染时间为10min,菌液浓度OD600=0.3,共培养3天,Kan筛选浓度定为60mg/L,脱菌过程中使用400 mg/L的羧苄青霉素。4.通过叶盘法转化紫花苜蓿,分别将抗冻基因AFP和CBF2导入苜蓿基因组中,经Kan筛选及PCR检测,初步证明抗冻基因AFP和CBF2已整合入苜蓿基因组中。
王淼[6]（2009）在《籽粒苋PPDK基因的克隆及紫花苜蓿遗传转化》文中指出牧草作物生产在为畜牧业提供高产优质饲料的同时,节约了粮食,改善了生态环境。因此牧草生产是提高农业生产水平、协调农林牧结构以及实现农业可持续发展的重要手段。同时牧草中具有许多优良性状,是很多优势基因的资源库。从牧草中克隆优势基因为植物基因工程提供了可操作的对象。籽粒苋的光合效率高于玉米、甘蔗等C4植物。丙酮酸磷酸二激酶（Pyruvate orthophosphate dikinase ,PPDK）是植物C4代谢途径以及景天酸代谢途径（Crassulacean acid metabolism ,CAM）的限速酶,催化将ATP及丙酮酸（Pyruvate）生成磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate）的过程。已有研究表明,过量表达PPDK基因可提高植物的光合效率,提高植物产量。本研究以高光效植物籽粒苋为材料,开展了PPDK基因克隆及重要牧草紫花苜蓿遗传转化研究,获得主要研究结果如下:采用同源克隆及RACE技术从饲用籽粒苋中克隆了C4型植物光合作用限速酶PPDK酶的编码基因,分析表明PPDK基因cDNA全长3.2 kb,其中其中5’非翻译区为71 bp,3’非翻译区为285 bp,阅读框为2868 bp,推导的蛋白为956个氨基酸,分子量大约为106 kD。与其他作物PPDK基因比对并构建系统发育树,发现它与冰叶日中花（Mesembryanthemum crystallinum）同源性最高,达82%。构建了含籽粒苋PPDK cDNA全长序列的植物表达载体,建立了甘农三号紫花苜蓿的遗传转化体系,转入C3植物紫花苜蓿,以研究C4型PPDK基因对C3植物光合效率的影响。为进一步研究PPDK基因的启动子,经反向PCR技术及LA-PCR技术获得5’端上游一段约600 bp序列,经Plant CARE分析发现:此序列包含TATA-box、CAAT-box、GT1-motif及sp1等光反应顺式作用元件。将其中部分序列构建植物表达载体,转化烟草,GUS染色结果发现在农杆菌及烟草愈伤组织中均具有瞬时表达活性。
孙伟泽[7]（2009）在《NaCl胁迫对紫花苜蓿七个生理生化指标影响研究》文中研究表明以金皇后紫花苜蓿为材料,在幼苗期采用不同浓度梯度的NaCl溶液进行胁迫处理。利用农作物和牧草抗逆性鉴定上广泛采用的生理生化指标,分别对地上部分和地下部分的CAT、SOD、POD、Vc、超氧阴离子自由基、T-AOC和MDA进行动态分析,以期了解和揭示其在盐胁迫过程中的生理生化变化机制,为今后能更好地开发和利用优质苜蓿资源提供科学依据;并为今后相关的耐盐性评价及耐盐草种的选育提供参考依据。研究内容包括:将幼苗期金皇后紫花苜蓿分为5组,每组分别用0mmol/L,40mmol/L,80mmol/L,120mmol/L,160 mmol/L的NaCl溶液进行处理,分别于处理后2h,4h,6h,8h,10h时测定其地上部分和地下部分的7个生理生化指标,并分析这7个指标分别随NaCl浓度增大和处理时间延长的变化情况。研究结果如下:1、NaCl胁迫下,紫花苜蓿地上部分和地下部分均能迅速感知NaCl胁迫,并上调CAT、SOD和POD等抗氧化酶的活性和Vc等非酶抗氧化剂的含量来减少NaCl胁迫诱导的氧化损伤。如进行幼苗耐盐性鉴定,地下部分宜在NaCl处理后4h进行,地上部分为8h或10h。2、NaCl胁迫下,地上部分和地下部分中MDA含量随浓度的增大和时间的延长均呈增大趋势,表明NaCl胁迫导致了细胞膜透性的增大,但在短时间内地下部分较地上部分增加缓慢。3、随NaCl浓度的增加,地上部分和地下部分T-AOC均呈下降趋势;地上部分T-AOC随胁迫时间的延长呈增大趋势,而地下部分随胁迫时间的延长虽无明显变化规律,但到10h时各NaCl浓度处理间T-AOC水平趋于一致。4、由本次试验结果可以看出,在苜蓿幼苗期,适宜作为耐盐性鉴定的生理生化指标有:地上部分的MDA、SOD、POD、Vc和地下部分的MDA、POD、Vc。
陈文峰[8]（2008）在《Sinorhizobium meliloti应译为“草木樨中华根瘤菌”》文中提出在国内众多文献中均将Sinorhizobium meliloti误译为"苜蓿中华根瘤菌",它的种加词meliloti是来自豆科植物草木樨属（Melilotus）,经拉丁化后而形成的,因此应译为"草木樨中华根瘤菌"才为正确。与它亲缘关系十分接近的另一种根瘤菌-Sinorhizobium medicae,种加词medicae来自豆科植物苜蓿属（Medicago）,因此Sinorhizobium medicae才应真正地译为"苜蓿中华根瘤菌"。
田方[9]（2008）在《烟草根际铁载体产生菌ARDRA分析、铁载体拮抗活性研究及fur基因克隆》文中提出本研究对分离到的烟草根际铁载体产生菌进行了遗传多样性分析,从中筛选到一株限铁条件下对烟草疫霉有较好拮抗作用的地中海假单胞菌,研究了其铁载体对烟草疫霉的拮抗活性,克隆了其铁吸收调控蛋白基因,并用转座子诱变法获得了其铁载体合成缺失突变株,得出如下结论:1、用16S rDNA PCR扩增产物的限制性酶切分析（ARDRA）、16S rRNA序列同源性和进化树分析等方法,对从烟草根际分离到的299铁载体产生细菌进行了遗传多样性分析。这299个分离物分属于28个ARDRA类型,由测序结果进一步可知分属于β-,γ,α-变形杆菌、鞘氨醇杆菌、芽孢杆菌和放线菌纲的14个不同的属。尤其是由假单胞菌、肠杆菌、沙雷氏菌、泛菌、欧文氏菌和窄食单胞菌构成的γ-变形杆菌占据了18个ARDRA类型。研究结果展示了比以往研究更为丰富的铁载体产生细菌多样性,例如,首次报道了鞘氨醇杆菌G-2-21-1和G-2-27-2、Pseudomonas poae G-2-1-1、内共生肠产气杆菌G-2-10-2和N-5-10、食酸丛毛单胞菌G-1-15、木糖氧化无色杆菌N-46-11HH和N-5-20在限铁条件下产生铁载体。其中95%以上的铁载体产生菌属于革兰氏阴性菌,枯草芽孢杆菌和红平红球菌是仅有的两类革兰氏阳性菌。进一步研究发现,假单胞菌和肠杆菌占了产生铁载体总菌数的50%以上,还发现75%以上的产生高铁载体活性单位（4060）的细菌属于假单胞菌。2、从烟草根际筛选到一株限铁条件下烟草疫霉[Phytophthora parasitica var. nicotianae （Breda de Hann）Tucker]拮抗菌G-229-21T。该菌产生高亲和力铁载体。通过形态特征、生理生化实验、16S rRNA序列同源性和系统发育分析及种特异性分子法鉴定,确定其属于Pseudomonasmediterranea。XAD-2吸附层析法提取其铁载体,分光光度法检测其产生羧酸型铁载体。该铁载体,在低铁条件下（0.16μmol/L10μmol/L FeCl3）对烟草疫霉的抑制率达92.3%以上,而在富铁条件下（100μmol/L FeCl3）抑制率仅为2.0%。3、采用兼并引物PCR和TAIL-PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR）法,获得了完整的P. mediterranea G-229-21T铁吸收调控蛋白基因序列。该基因与Pseudomonas fluorescens PfO-1 fur基因的同源性最高为82%,其编码蛋白质含有104个氨基酸,与P. fluorescens PfO-1 Fur蛋白的同源性最高为86%。并通过Swiss-Model对其Fur蛋白空间结构进行了模拟。4、用抗生素平板法对P. mediterranea G-229-21T进行抗药性试验,G-229-21T对卡那霉素敏感,能够耐受20μg/mL以上的氯霉素。利用转座子Tn5-1063a对G-229-21T进行转座子插入诱变,筛选出1株铁载体合成缺失突变株:G-229-21TA。用P. mediterranea特异性引物PC5/1和PC5/2,以突变株基因组为模板进行了特异性扩增,证实了突变株由出发菌株突变而来。根据转座子Tn5-1063a上luxA序列,设计引物,分别以G-229-21T总DNA、pRL1063a DNA和突变株总DNA进行PCR扩增,测序结果表明,突变株G-229-21TA的luxA序列与已知的luxA序列同源性为100%,由此证实转座子Tn5-1063插入到G-229-21T基因组中。
张玉,白史且,邓永昌,李达旭,游明鸿,刘刚,张昌兵[10]（2007）在《分子标记在苜蓿遗传育种中的应用进展》文中认为苜蓿是一种重要的豆科牧草,近年来分子标记技术广泛应用在苜蓿亲缘关系和遗传规律研究、基因突变、遗传多样性检测、基因定位、基因克隆、遗传连锁图谱的绘制、种质鉴定、种质渐渗和基因转移、抗性育种等方面。本文主要对分子标记在苜蓿遗传育种中的应用和前景进行了综述。
二、转座子挽救法对苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关基因的定位（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转座子挽救法对苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关基因的定位（论文提纲范文）
（1）西瓜食酸菌抗铜相关基因tolC和gntR的鉴定与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 瓜类细菌性果斑病概述 |
| 1.2 植物相关细菌抗铜性研究进展 |
| 1.3 细菌外膜蛋白TolC的研究进展 |
| 1.4 细菌中GntR家族转录因子的研究现状 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 两种表达载体对西瓜食酸菌生物学特性的影响 |
| 2.1 材料、试剂与仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 西瓜食酸菌抗铜相关基因tolC的鉴定与分析 |
| 3.1 材料、试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 西瓜食酸菌GntR家族转录调控因子抗铜功能的鉴定与分析 |
| 4.1 材料、仪器与试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）骆驼刺中慢生根瘤菌CCNWXJ12-2T全基因组测序及耐盐相关功能基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 选题的依据、目的和意义 |
| 1.1.1 选题的依据 |
| 1.1.2 目的和意义 |
| 1.2 根瘤菌国内外研究概况 |
| 1.2.1 根瘤菌多样性研究进展 |
| 1.2.2 根瘤菌分子遗传学的研究进展 |
| 1.3 细菌耐盐机制的研究进展 |
| 1.3.1 细菌渗透调节机制 |
| 1.3.2 外膜孔道蛋白(porin)：OmpC 和 OmpF |
| 1.3.3 双组份调节系统 EnvZ/OmpR |
| 1.3.4 细菌中的阳离子运输蛋白或系统 |
| 1.3.5 转录因子的全细胞调控作用 |
| 1.4 根瘤菌-豆科植物相互作用提高植物的抗逆性 |
| 1.5 转座子及转座子诱变法 |
| 1.5.1 转座子和转座子标签技术介绍 |
| 1.5.2 Tn5 转座子的特点及应用 |
| 1.6 本研究的内容及技术路线 |
| 1.6.1 试验方案 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 骆驼刺中慢生根瘤菌耐盐菌株的筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 培养基与营养液 |
| 2.2.2 仪器及设备 |
| 2.2.3 供试菌株 |
| 2.2.4 回接实验 |
| 2.2.5 抗逆性测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 骆驼刺根瘤调查与结瘤分析 |
| 2.3.2 骆驼刺根瘤菌抗逆性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 M. alhagi CCNWXJ12-2~T盐敏感突变体的获得及生长测定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 M. alhagi CCNWXJ12-~(2T)突变体筛选培养基的选择 |
| 3.3.2 M. alhagi CCNWXJ12-~(2T)突变体库的建立及盐敏感突变体的筛选 |
| 3.3.3 M. alhagi CCNWXJ12-~(2T)盐敏感突变体正确性的验证 |
| 3.3.4 盐敏感突变体的耐盐性分析 |
| 3.3.5 盐敏感突变株在其它渗透压条件下的生长 |
| 3.3.6 盐敏感突变株生长曲线的测定 |
| 3.3.7 盐敏感突变株 Mam4 与野生菌的表型比较观察 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 突变基因的克隆及序列分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 侧翼序列的克隆 |
| 4.3.2 Tn5 插入位点 blast 比对定位及物理图谱绘制 |
| 4.3.3 插入突变基因的鉴定及所编码蛋白分析 |
| 4.3.4 插入突变基因序列分析及功能预测 |
| 4.3.5 突变基因所编码蛋白的亚细胞定位分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 突变基因全长的克隆及功能互补验证分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 突变基因全长的扩增及测序验证 |
| 5.3.2 功能互补质粒的构建（以 952 基因为例） |
| 5.3.3 功能互补结果分析 |
| 5.3.4 突变体 Mam4 及功能互补菌多糖含量测定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全基因组测序及渗透调节网络分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 M. alhagi CCNWXJ12-2~T的生物学特性 |
| 6.2.2 基因组测序和拼接 |
| 6.2.3 基因预测及注释 |
| 6.3 结果及分析 |
| 6.3.1 全基因组测序结果 |
| 6.3.2 功能基因注释及功能分类 |
| 6.3.3 渗透调节相关功能基因分析 |
| 6.3.4 M. alhagi CCNWXJ12-2~T渗透调节网络分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 结论与创新 |
| 7.1 结论 |
| 7.1.1 M. alhagi CCNWXJ12-2~T菌株的抗逆性 |
| 7.1.2 转座子突变体库的建立及盐敏感突变体的筛选及生长测定 |
| 7.1.3 突变基因的克隆及功能预测与分析 |
| 7.1.4 突变基因全长的扩增及功能互补分析 |
| 7.1.5 M. alhagi CCNWXJ12-2~T全基因组测序及渗透调节网络分析 |
| 7.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）Tn5转座子插入突变体的制备和致病性缺失突变体的鉴定与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 细菌性果斑病 |
| 1.1.1 细菌性果斑病的危害 |
| 1.1.2 细菌性果斑病菌–西瓜食酸菌 |
| 1.1.3 西瓜食酸菌的群体结构和寄主范围特点 |
| 1.2 基因功能研究策略―转座子插入诱变 |
| 1.2.1 Tn5 转座子插入诱变的分子机制 |
| 1.2.2 Tn5 转座子插入诱变在基因功能研究中的应用 |
| 1.3 植物病原细菌致病性机制的研究现状 |
| 1.3.1 细菌与植物互作的类型以及致病相关的概念 |
| 1.3.2 植物病原细菌致病相关因子 |
| 1.4 西瓜食酸菌致病机制的研究现状 |
| 1.5 本研究的目的意义和技术路线 |
| 1.5.1 目的意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 西瓜食酸菌—黄瓜互作模式病害体系的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料、仪器与试剂 |
| 2.2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 材料的培养与接种 |
| 2.3.1.1 植物材料的培养 |
| 2.3.1.2 西瓜食酸菌的培养和菌悬液制备 |
| 2.3.1.3 接种 |
| 2.3.2 BFB 病害严重度测定以及叶组织内病原菌群体数量的检测 |
| 2.3.3 植物发病组织病原菌的分离与鉴定 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 用于西瓜食酸菌–黄瓜互作体系的菌株和黄瓜品种 |
| 2.4.2 西瓜食酸菌与黄瓜离体叶片的互作 |
| 2.4.3 西瓜食酸菌与黄瓜果实、活体幼苗的互作 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 西瓜食酸菌的转座子插入诱变和致病性改变突变体的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料、仪器与试剂 |
| 3.2.1 主要仪器和试剂 |
| 3.2.2 材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 大肠杆菌的遗传转化 |
| 3.3.2 双亲结合法制备 Tn5 转座子插入诱变突变体 |
| 3.3.2.1 菌株的选择与培养 |
| 3.3.2.2 突变体的制备 |
| 3.3.2.3 西瓜食酸菌的 Tn5 转座频率计算 |
| 3.3.3 候选突变体的阳性检测 |
| 3.3.4 质粒挽救法获取西瓜食酸菌基因组 Tn5 侧翼序列信息 |
| 3.3.4.1 突变体基因组 DNA 的提取 |
| 3.3.4.2 基因组 DNA 的酶切 |
| 3.3.4.3 基因组 DNA 酶切产物的自连接 |
| 3.3.4.4 转化大肠杆菌 |
| 3.3.4.5 Tn5 侧翼序列片段的获得 |
| 3.3.4.6 生物信息学分析 |
| 3.3.5 Southern 杂交分析 |
| 3.3.5.1 探针的设计 |
| 3.3.5.2 待测 DNA 样品的制备和琼脂糖凝胶电泳分离 |
| 3.3.5.3 转膜 |
| 3.3.5.4 探针标记、预杂交及杂交 |
| 3.3.6 转座子插入诱变突变体稳定性分析 |
| 3.3.7 突变体致病性检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 西瓜食酸菌菌株较难进行转座子插入诱变 |
| 3.4.2 获得较高质量的西瓜食酸菌突变体库 |
| 3.4.3 西瓜食酸菌-黄瓜模式体系筛选获得致病性改变突变体 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 西瓜食酸菌的致病必需因子非鞭毛Ⅲ型分泌系统 ATPase 蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料、仪器与试剂 |
| 4.2.1 主要仪器和试剂 |
| 4.2.2 材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 材料的培养和接种 |
| 4.3.1.1 材料的培养 |
| 4.3.1.2 菌悬液的制备 |
| 4.3.1.3 接种 |
| 4.3.2 BFB 病害严重度测定及叶组织内病原菌群体的检测 |
| 4.3.3 hrcN 表达载体的构建 |
| 4.3.3.1 目的基因 hrcN 克隆 |
| 4.3.3.2 重组质粒 pHC60-hrcN 的构建 |
| 4.3.4 质粒转化细菌 |
| 4.3.4.1 质粒转化大肠杆菌 |
| 4.3.4.2 质粒转化西瓜食酸菌 |
| 4.3.5 NF-T3SS ATPase 的聚类分析和 T3SS 的系统进化分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 预测 T3SS ATPase 缺失菌株表型和基因鉴定 |
| 4.4.2 HrcN 是西瓜食酸菌的致病性和 NF-T3SS 功能的必需因子 |
| 4.4.3 预测的 T3SS ATPase 的聚类分析 |
| 4.4.4 西瓜食酸菌 T3SS 的系统进化分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 西瓜食酸菌的毒性因子葡萄糖抑制分裂型蛋白 A |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料、仪器与试剂 |
| 5.2.1 主要仪器和试剂 |
| 5.2.2 材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 材料的培养和接种 |
| 5.3.1.1 材料的培养 |
| 5.3.1.2 菌悬液的制备 |
| 5.3.1.3 接种 |
| 5.3.2 BFB 病害严重度测定及叶组织内病原菌群体的检测 |
| 5.3.3 GidA 表达载体的构建 |
| 5.3.3.1 目的基因 GidA 克隆 |
| 5.3.3.2 表达载体 pHC60-GidA 的构建 |
| 5.3.4 质粒转化细菌 |
| 5.3.4.1 质粒转化大肠杆菌 |
| 5.3.4.2 质粒转化西瓜食酸菌 |
| 5.3.5 细菌鞭毛观察以及细菌运动性分析 |
| 5.3.6 生物信息学分析 |
| 5.4 结果分析 |
| 5.4.1 西瓜食酸菌中 GidA 同源蛋白的识别 |
| 5.4.2 西瓜食酸菌 GidA 基因缺失突变体减弱了致病性及其在寄主组织内的增殖 |
| 5.4.3 GidA 基因缺失突变体改变了菌的抽动运动性和游动运动性 |
| 5.4.4 GidA 基因对西瓜食酸菌的致病性有贡献 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）苜蓿中华根瘤菌CCNWSX0020抗铜基因的克隆与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 根瘤菌及其重金属抗性研究概况 |
| 1.2.1 根瘤菌在农业生产中的地位 |
| 1.2.2 根瘤菌及根瘤菌-豆科植物共生体系对重金属抗性的研究 |
| 1.3 重金属及其污染土壤概况 |
| 1.3.1 重金属及生物学效应 |
| 1.3.2 土壤重金属污染的特点 |
| 1.4 微生物对重金属的抗性研究概况 |
| 1.4.1 重金属对微生物的毒性效应 |
| 1.4.2 微生物对重金属的抗性机理和解毒机制 |
| 1.4.3 微生物抗重金属基因研究 |
| 1.5 微生物的铜抗性机理 |
| 1.5.1 细菌抗铜作用方式及其抗性基因 |
| 1.5.2 耐铜基因的调节 |
| 1.6 转座子标签技术 |
| 1.6.1 转座子标签技术在分析未知基因上的优越性 |
| 1.6.2 转座子标签技术的应用 |
| 1.7 研究内容及技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 实验方案及技术路线 |
| 第二章 S. meliloti CCNWSX0020 铜敏感性突变体的筛选及其特性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 S. meliloti CCNWSX002 对不同重金属的抗性水平 |
| 2.3.2 S. meliloti CNWSX0020 对不同抗生素的抗性水平 |
| 2.3.3 突变体筛选培养基的选择 |
| 2.3.4 pRL1063a 正确性鉴定 |
| 2.3.5 突变体库的建立 |
| 2.3.6 突变体的分子检测 |
| 2.3.7 铜敏感性突变株的筛选 |
| 2.3.8 铜敏感突变株的生长状况 |
| 2.3.9 重金属对铜敏感突变株的生长状况影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 S. meliloti CCNWSX0020 抗铜相关基因序列分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 突变株基因组酶切、自连和转化 |
| 3.3.2 突变株单一插入位点的确定 |
| 3.3.3 Tn5-1063a 侧翼DNA 序列的测序及插入基因确定 |
| 3.3.4 插入基因的序列分析及其蛋白同源性比较 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 突变基因的克隆与功能互补 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 S.meliloti CCNWSX0020 lpxXL、CueR、copB 和fixI1 基因全长的获得 |
| 4.3.2 lpxXL、CueR、copB 和fixI1 与重组质粒pBBR1MCS-5 的构建 |
| 4.3.3 lpxXL、CueR、copB 和fixI1 与其相应突变株的互补分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 铜敏感性突变株对宿主植物结瘤和植物生长的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 突变株对宿主植物结瘤和生长的影响 |
| 5.3.2 铜胁迫下突变株对宿主植物生长的影响 |
| 5.3.3 突变株对宿主植物根茎铜含量的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与创新 |
| 6.1 结论 |
| 6.1.1 S. meliloti CCNWSX0020 的抗性能力 |
| 6.1.2 突变体库的建立和铜敏感性突变株的筛选及特性 |
| 6.1.3 Tn5-1063a 插入位点的侧翼序列分析 |
| 6.1.4 功能互补实验 |
| 6.1.5 突变株对水培植物结瘤和生长的影响 |
| 6.1.6 铜胁迫下突变株对盆栽植物生长和铜含量的影响 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）AFP、CBF2基因表达载体的构建及其对苜蓿遗传转化的研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 抗冻蛋白基因AFP |
| 1.1 抗冻蛋白基因AFP 分离纯化的发展史 |
| 1.2 抗冻蛋白的功能特性 |
| 1.2.1 抗冻蛋白非依数性降低冰点的活性 |
| 1.2.2 抗冻蛋白修饰冰晶形态的活性 |
| 1.2.3 抗冻蛋白抑制冰晶发生重结晶 |
| 1.3 抗冻蛋白的作用机制 |
| 1.4 抗冻蛋白基因对植物的遗传转化 |
| 1.4.1 鱼类抗冻蛋白基因转化植物 |
| 1.4.2 昆虫抗冻蛋白基因转化植物 |
| 1.4.3 植物抗冻蛋白基因转化植物 |
| 2 抗冻基因CBF |
| 2.1 CBF 基因家族的发现及其结构特点 |
| 2.2 CBF 转录因子的表达 |
| 2.3 CBF 转录因子的生理生化功能 |
| 2.4 CBF 转录因子在植物基因工程中的应用 |
| 3 苜蓿基因工程 |
| 3.1 常用的基因转化方法 |
| 3.1.1 农杆菌介导转化法 |
| 3.1.2 基因枪转化法 |
| 3.1.3 PEG 介导基因转化法 |
| 3.1.4 硅碳纤维介导基因转化法 |
| 3.1.5 电穿孔法 |
| 3.1.6 显微注射法 |
| 3.1.7 花粉管通道法 |
| 3.1.8 超声波转化法 |
| 3.1.9 脂质体介导法 |
| 3.2 转基因苜蓿的研究进展 |
| 3.2.1 转基因抗寒苜蓿 |
| 3.2.2 转基因耐盐苜蓿 |
| 3.2.3 转基因抗病虫害苜蓿 |
| 3.3 苜蓿遗传转化存在的问题 |
| 3.4 转基因苜蓿的发展局势和应用前景 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 AFP、CBF2 基因植物表达载体的构建及其对农杆菌的直接转化 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 常用酶和生化试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 基本培养基 |
| 3 溶液配制 |
| 4 引物设计和技术路线 |
| 4.1 引物设计 |
| 4.2 植物表达载体构建的技术路线 |
| 5 试验方法 |
| 5.1 植物材料的获得 |
| 5.1.1 胡萝卜无菌苗的获得 |
| 5.1.2 拟南芥无菌苗的获得 |
| 5.2 AFP、CBF2 抗冻基因的克隆 |
| 5.2.1 基因组DNA 的提取 |
| 5.2.2 目的片段的获得 |
| 5.2.3 目的片段的回收 |
| 5.2.4 目的片段与载体连接 |
| 5.2.5 大肠杆菌DH5a 感受态细胞的制备与转化 |
| 5.2.6 重组质粒的鉴定 |
| 5.2.7 目的基因的序列测定 |
| 5.3 抗冻基因AFP、CBF2 表达载体的构建 |
| 5.3.1 PBI121 质粒的酶切（一） |
| 5.3.2 PBI121 质粒的酶切（二） |
| 5.3.3 T-AFP 与PBI121 酶切产物的连接 |
| 5.3.4 T-CBF2 与PBI121 酶切产物的连接 |
| 5.3.5 载体转化至大肠杆菌DH5a |
| 5.4 植物表达载体向农杆菌的转化 |
| 5.4.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备 |
| 5.4.2 液氮冻融法直接转化农杆菌 |
| 5.4.3 阳性克隆的筛选和鉴定 |
| 6 结果与分析 |
| 6.1 目的基因的克隆与回收 |
| 6.2 克隆载体的构建 |
| 6.3 重组质粒的鉴定 |
| 6.4 植物表达载体的构建 |
| 6.5 植物表达载体的鉴定 |
| 6.6 农杆菌的转化 |
| 6.7 转化菌的鉴定 |
| 7 讨论 |
| 7.1 关于基因的克隆 |
| 7.2 关于植物表达载体的构建 |
| 7.3 关于农杆菌直接转化法及其鉴定 |
| 第三章 农杆菌介导的AFP、CBF2 基因对紫花苜蓿的转化及分子生物学检测 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 质粒和农杆菌菌株 |
| 1.3 农杆菌培养基 |
| 1.4 培养基类型 |
| 1.5 生化试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 无菌苗的获得 |
| 2.2 筛选培养中卡那霉素选择压的确定 |
| 2.3 筛选培养中抗生素种类及其浓度的抑菌作用 |
| 2.4 农杆菌介导的基因转化方法 |
| 2.4.1 菌种保存 |
| 2.4.2 工程菌的纯化 |
| 2.4.3 工程菌侵染悬浮液的制备 |
| 2.4.4 侵染 |
| 2.5 转化体系的建立 |
| 2.5.1 侵染时间对转化率的影响 |
| 2.5.2 农杆菌浓度对转化率的影响 |
| 2.5.3 预培养时间对转化率的影响 |
| 2.5.4 共培养时间对转化率的影响 |
| 2.6 转基因愈伤组织的鉴定 |
| 2.6.1 植物组织DNA 的提取 |
| 2.6.2 PCR 反应体系 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 筛选培养中卡那霉素选择压的确定 |
| 3.2 筛选培养基中抗生素浓度的确定 |
| 3.3 转化体系的建立 |
| 3.3.1 侵染时间对转化率的影响 |
| 3.3.2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响 |
| 3.3.3 预培养时间对转化效率的影响 |
| 3.3.4 共培养时间对转化率的影响 |
| 3.4 和田苜蓿转化愈伤组织的鉴定 |
| 3.4.1 转AFP 基因愈伤组织的PCR 分子鉴定 |
| 3.4.2 转CBF2 基因愈伤组织的PCR 分子鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 选择方法和选择时间对转化的影响 |
| 4.2 抗生素对愈伤组织诱导的影响 |
| 4.3 农杆菌菌株对转化的影响 |
| 4.4 转化体系中各因素对转化的影响 |
| 4.5 PCR 分子鉴定的局限性 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（6）籽粒苋PPDK基因的克隆及紫花苜蓿遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 PPDK 基因研究 |
| 1.1.1 PPDK 酶简介 |
| 1.1.2 PPDK 的结构及功能 |
| 1.1.3 PPDK 酶中的催化及调控位点 |
| 1.1.4 C4 植物中PPDK 基因结构与表达 |
| 1.1.5 PPDK 基因的进化 |
| 1.1.6 PPDK 基因在植物基因工程领域的应用 |
| 1.2 籽粒苋研究进展 |
| 1.3 牧草基因工程的研究进展 |
| 1.3.1 牧草的遗传转化工作研究进展 |
| 1.3.2 基因的克隆方法及其在牧草基因工程中的运用 |
| 1.4 本研究中使用的部分技术的研究进展 |
| 1.4.1 cDNA 全长扩增技术 |
| 1.4.2 染色体步移技术 |
| 1.5 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.5.1 目的意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 籽粒苋中 PPDK 基因的克隆及序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 籽粒苋 PPDK 全长cDNA 的克隆 |
| 2.2.2 AhPPDK 基因的序列分析 |
| 2.2.3 AhPPDK 基因的表达特性分析 |
| 第三章 籽粒苋 PPDK 基因导入紫花苜蓿 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 植物表达载体的构建 |
| 3.2.2 紫花苜蓿遗传转化研究 |
| 第四章 籽粒苋 PPDK 基因起始密码子上游调控元件的克隆与分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 染色体步移获得上游顺式作用元件 |
| 4.2.2 含有顺式作用元件的载体构建 |
| 4.2.3 验证上游顺式作用元件驱动GUS 表达 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.1.1 从籽粒苋中克隆了C4 型PPDK 基因cDNA 全长 |
| 5.1.2 构建了含有籽粒苋PPDK 基因cDNA 全长序列的植物表达载体，并将其转化紫花苜蓿 |
| 5.1.3 通过染色体步移技术克隆了一段上游顺式作用元件 |
| 5.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）NaCl胁迫对紫花苜蓿七个生理生化指标影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究目的及意义 |
| 1.2 盐胁迫发生的机理 |
| 1.2.1 盐胁迫对种子萌发的影响 |
| 1.2.2 盐胁迫对植株的影响 |
| 1.3 植物的耐盐机理 |
| 1.3.1 无机盐离子的调节 |
| 1.3.2 渗透调节 |
| 1.3.3 光合作用 |
| 1.3.4 呼吸作用 |
| 1.3.5 细胞膜的稳定性及抗氧化物质的变化 |
| 1.3.6 激素 |
| 1.4 提高植物耐盐性的途径 |
| 1.4.1 选育耐盐品种 |
| 1.4.2 逐步适应锻炼 |
| 1.4.3 外施植物生长物质 |
| 1.4.4 合理施肥及合理灌溉 |
| 1.5 苜蓿耐盐性研究进展 |
| 1.6 问题与展望 |
| 第二章 苜蓿耐盐性能的研究 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 测定指标及测定方法 |
| 2.1.5 数据处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 NaCl 胁迫下各指标随浓度增加的变化 |
| 2.2.2 NaCl 胁迫下各指标随时间延长的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 NaCl 胁迫下苜蓿幼苗CAT、SOD 和POD 的变化 |
| 2.3.2 NaCl 胁迫下苜蓿幼苗MDA 的变化 |
| 2.3.3 NaCl 胁迫下苜蓿幼苗超氧阴离子自由基的变化 |
| 2.3.4 NaCl 胁迫下苜蓿幼苗抗坏血酸的变化 |
| 2.3.5 NaCl 胁迫下苜蓿幼苗 T-AOC 的变化 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）烟草根际铁载体产生菌ARDRA分析、铁载体拮抗活性研究及fur基因克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 细菌遗传多样性研究进展 |
| 1.2.1 传统的微生物培养法 |
| 1.2.2 PLFA 分析法 |
| 1.2.3 DNA 中mol % G+C 丰度的分析 |
| 1.2.4 核酸探针检测技术 |
| 1.2.5 DNA 复性动力学研究 |
| 1.2.6 基于PCR 技术的分子标记技术 |
| 1.3 烟草根际和叶际微生物多样性研究 |
| 1.4 微生物铁载体研究进展 |
| 1.4.1 微生物铁载体的种类与结构 |
| 1.4.2 铁载体的提取和纯化 |
| 1.4.3 铁载体检测方法 |
| 1.4.4 微生物铁载体的合成及相关基因 |
| 1.4.5 PGPR 与铁载体 |
| 1.5 铁吸收调控蛋白-Fur |
| 1.5.1 E. coli 中fur 基因的调节 |
| 1.5.2 其它细菌中的Fur |
| 1.6 转座子诱变法基因克隆策略研究进展 |
| 1.6.1 细菌转座子的插入机制和随机诱变作用 |
| 1.6.2 转座子标签技术 |
| 1.7 本研究的立题依据、研究内容和技术路线 |
| 1.7.1 立题依据 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 1.7.3 技术路线 |
| 第二章 烟草根际铁载体产生菌ARDRA 分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 土样 |
| 2.1.2 培养基、试剂与仪器 |
| 2.1.3 细菌的分离 |
| 2.1.4 铁载体产生菌的筛选 |
| 2.1.5 基因组DNA 的提取 |
| 2.1.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.1.7 PCR 扩增体系和条件 |
| 2.1.8 参考菌株的模拟酶切 |
| 2.1.9 铁载体产生菌的ARDRA 分析 |
| 2.1.10 16S rRNA 基因测序和序列分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 细菌的分离 |
| 2.2.2 铁载体产生菌的筛选 |
| 2.2.3 参考菌株的ARDRA 分析 |
| 2.2.4 铁载体产生菌的ARDRA 和16S rRNA 基因序列分析 |
| 2.2.5 铁载体产生菌分布分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 Pseudomonas mediterranea G-229-21T 筛选、鉴定及其铁载体拮抗活性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 主要试剂和仪器 |
| 3.1.4 菌株的分离和筛选 |
| 3.1.5 铁载体的定性检测和定量分析 |
| 3.1.6 菌株的鉴定 |
| 3.1.7 铁载体的制备 |
| 3.1.8 铁载体类型的检测 |
| 3.1.9 铁载体对烟草疫霉的抑制作用 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 菌株的筛选 |
| 3.2.2 铁载体的定性检测和定量分析 |
| 3.2.3 菌株的鉴定 |
| 3.2.4 铁载体的制备和类型的检测 |
| 3.2.5 铁载体对烟草疫霉的拮抗作用 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 P.mediterranea G-229-21T铁吸收调控蛋白基因克隆与Fur结构模拟 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株和载体 |
| 4.1.2 培养基及主要试剂 |
| 4.1.3 细菌基因组DNA 提取 |
| 4.1.4 fur 保守区域的克隆和序列测定 |
| 4.1.5 fur 完整基因的克隆 |
| 4.1.6 fur 序列分析和系统发育分析 |
| 4.1.7 Fur 序列分析及结构模拟 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 fur 保守区域的克隆 |
| 4.2.2 完整 fur 基因的克隆 |
| 4.2.3 P. mediterranea 的 fur 基因的核苷酸序列 |
| 4.2.4 P. mediterranea 的 fur 基因编码的 Fur 序列分析 |
| 4.2.5 Fur 结构模拟 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 P.mediterranea G-229-21T 铁载体缺失突变株筛选 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 培养基及抗生素 |
| 5.1.3 试剂及仪器 |
| 5.1.4 抗药性试验 |
| 5.1.5 铁载体检测 |
| 5.1.6 转座子诱变 |
| 5.1.7 铁载体合成能力变化突变株的复筛 |
| 5.1.8 基因组DNA 的提取 |
| 5.1.9 琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.1.10 DNA 凝胶回收 |
| 5.1.11 DNA 浓度的确定 |
| 5.1.12 DH5α感受态制备 |
| 5.1.13 特异性引物扩增验证 |
| 5.1.14 luxA 扩增和测序验证 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 铁载体合成缺失突变株的筛选 |
| 5.2.2 突变株总基因组提取 |
| 5.2.3 特异性引物扩增验证 |
| 5.2.4 luxA PCR 扩增和测序验证 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论和建议 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
四、转座子挽救法对苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关基因的定位（论文参考文献）
- [1]西瓜食酸菌抗铜相关基因tolC和gntR的鉴定与功能分析[D]. 黄成文. 新疆农业大学, 2018(05)
- [2]骆驼刺中慢生根瘤菌CCNWXJ12-2T全基因组测序及耐盐相关功能基因的研究[D]. 周美丽. 西北农林科技大学, 2014(02)
- [3]西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）Tn5转座子插入突变体的制备和致病性缺失突变体的鉴定与分析[D]. 刘君. 西北农林科技大学, 2012(06)
- [4]苜蓿中华根瘤菌CCNWSX0020抗铜基因的克隆与功能验证[D]. 马占强. 西北农林科技大学, 2011(04)
- [5]AFP、CBF2基因表达载体的构建及其对苜蓿遗传转化的研究[D]. 郝凤. 甘肃农业大学, 2010(02)
- [6]籽粒苋PPDK基因的克隆及紫花苜蓿遗传转化[D]. 王淼. 中国农业科学院, 2009(10)
- [7]NaCl胁迫对紫花苜蓿七个生理生化指标影响研究[D]. 孙伟泽. 西北农林科技大学, 2009(S2)
- [8]Sinorhizobium meliloti应译为“草木樨中华根瘤菌”[J]. 陈文峰. 中国科技术语, 2008(03)
- [9]烟草根际铁载体产生菌ARDRA分析、铁载体拮抗活性研究及fur基因克隆[D]. 田方. 山东农业大学, 2008(02)
- [10]分子标记在苜蓿遗传育种中的应用进展[A]. 张玉,白史且,邓永昌,李达旭,游明鸿,刘刚,张昌兵. 中国草学会牧草育种专业委员会2007年学术研讨会论文集, 2007