一、巨噬细胞内毒素耐受时TLR4/MD-2的基因表达调节作用（论文文献综述）
王欢[1]（2021）在《lsgB基因介导的脂寡糖α2，3-唾液酸化在副猪革拉瑟氏菌致病中的作用及机制研究》文中研究指明副猪革拉瑟氏菌（Glaesserella parasuis,GPS）属于巴氏杆菌科的一种短小杆菌,是猪上呼吸道常在菌。在机体受到应激、免疫力低下或继发感染条件下,侵入上皮细胞、进入血液引发宿主的革拉瑟氏病。该病多发于断奶仔猪,或常见于与其他细菌和/或病毒混合感染的猪群,对生猪养殖业造成严重的经济损失。目前,对该病原的研究主要是对病原毒力因子的挖掘,但对其在上呼吸道定殖以及突破呼吸道屏障的研究较少。已有研究表明:能造成全身系统性感染的菌株都含有lsg B基因,其编码一个α2,3-唾液酸转移酶蛋白,但其具体的机制尚不清楚。本研究从构建lsg B基因缺失菌株出发,在体外细胞模型上证实了该基因缺失能显着降低GPS跨越单层细胞屏障的能力、降低GPS侵入细胞能力、降低GPS在健康猪血清中的存活能力,并发现lsg B基因介导LOS的α2,3-唾液酸化能识别巨噬细胞表面结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素1（Siglec1）,促进TGF-β1的分泌。我们探究了TGF-β1对上皮屏障完整性的影响,深入分析了TGF-β1调控GPS侵入上皮细胞的机制,主要研究内容如下:1.lsg B基因介导LOS发生α2,3-唾液酸化利用自然转化的方法,我们在5型临床分离的强毒株SH0165（以下称野生菌株）中成功获得lsg B基因缺失菌株,并通过穿梭质粒在缺失菌株中回补该基因成功构建其互补菌株。通过高效液相色谱（HPLC）检测证实:相较于野生菌株和互补菌株,缺失菌株表面的α2,3-唾液酸化水平显着降低,lsg B基因造成GPS菌株去唾液酸化。分别提取上述三株菌的LOS,PAGE银染实验进一步证实去唾液酸化降低LOS分子量,表明lsg B基因编码唾液酸转移酶的作用是修饰GPS的LOS发生α2,3-唾液酸化。2.lsg B基因介导LOS的α2,3-唾液酸化影响GPS致病力为探究LOS唾液酸化对GPS致病力的影响,我们分别在猪肾上皮细胞（PK-15）和猪髋动脉内皮细胞（PIEC）上进行了黏附侵入实验,结果表明缺失菌株对于上述两种细胞的侵入能力显着减弱,而黏附能力显着增强。分析LOS结构发现,LOS去唾液酸化后暴露了半乳糖残基,通过半乳糖预处理PK15细胞,再进行黏附实验发现缺失菌株黏附增强的现象被显着抑制。同时,我们探究了唾液酸化对GPS在血清中存活能力的影响,血清杀菌实验结果表明缺失菌株在健康猪血清中的存活率显着降低。WB实验结果表明,缺失菌株表面结合的补体抑制因子f H显着低于野生菌株和互补菌株。流式细胞术结果进一步证实沉积在缺失菌株表面C3b和攻膜复合体（MAC）的量显着高于野生菌株和互补菌株。上述结果表明,GPS唾液酸化通过结合补体抑制因子f H降低菌体表面C3b的沉积和MAC的形成,促进GPS在健康猪血清中存活率。小鼠实验结果表明缺失lsg B基因影响GPS对小鼠的致死率。上述结果表明。lsg B基因在GPS致病过程中发挥重要作用。3.α2,3-唾液酸化促进肺泡巨噬细胞TGF-β1的产生在本研究中,通过细菌的Pull Down实验,我们证实了野生菌株能够与重组的Siglec1发生相互作用,而缺失菌株结合较弱。WB和LOS-ELISA证实LOS的α2,3-唾液酸化与重组的Siglec1发生相互作用。野生菌株和缺失菌株及它们的LOS刺激猪肺泡巨噬细胞3D4/21后,WB检测Siglec1蛋白水平表达,证实α2,3-唾液酸化诱导更高水平的Siglec1表达。免疫组化进一步证实α2,3-唾液酸化诱导Siglec1在肺部的高表达。免疫共沉淀证实α2,3-唾液酸化激活的Siglec1能促进DAP12和Syk表达并形成三聚体激活下游级联反应。通过干扰RNA实验证实α2,3-唾液酸化激活的Siglec1/DAP12/Syk三聚体能促进上清中TGF-β1的分泌。WB证实去α2,3-唾液酸化的缺失菌株激活p38的磷酸化显着低于野生菌株,抑制p38通路后上清中TGF-β1的分泌显着减少。同时,通过抑制剂实验进一步证实Syk抑制剂显着抑制p38磷酸化和上清中TGF-β1的分泌。综上所述,α2,3-唾液酸化通过识别巨噬细胞表面受体Siglec1形成Siglec1/DAP12/Syk三聚体影响p38磷酸化调控TGF-β1的分泌。4.TGF-β1诱导GPS侵入上皮细胞及跨越上皮细胞屏障为证实分泌的TGF-β1对上皮屏障的影响。我们通过重组的TGF-β1蛋白对NPTr细胞进行了体外实验。ECIS结果证实TGF-β1能剂量依赖降低NPTr细胞形成的电阻屏障,TGF-β1受体抑制剂证实其降低NPTr电阻屏障依赖其受体发挥作用。WB结果进一步证实TGF-β1能降低NPTr细胞形成的电阻屏障是下调了NPTr细胞间的紧密连接蛋白。此外,我们还发现TGF-β1能通过依赖其受体的方式增加GPS对上皮细胞的侵入。通过WB和荧光素酶报告系统证实TGF-β1能增加GPS侵入NPTr细胞是通过下调Fn的表达来实现的。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对Fn蛋白进行敲除,证实Fn能影响GPS对气管上皮细胞的侵入能力。以上结果表明,lsg B基因介导的α2,3-唾液酸化在GPS突破上皮细胞屏障过程中发挥作用,细菌通过α2,3-唾液酸化修饰利用宿主免疫细胞表面受体来调控上皮细胞屏障入侵深层组织。5.α2,3-唾液酸化修饰诱导宿主免疫细胞耐受通过构建体外耐受模型,我们发现去α2,3-唾液酸化显着降低LOS诱导的免疫细胞耐受水平,降低耐受细胞上清和小鼠血清中TNF-α的含量,降低Siglec1的表达。在耐受细胞中,WB和co-IP结果表明α2,3-唾液酸化通过诱导Siglec1受体来上调其接头分子DAP12和炎症抑制因子SHIP,并形成复合物。共聚焦实验证实去α2,3-唾液酸化减弱Siglec1与SHIP的相互作用。WB证实耐受细胞中去α2,3-唾液酸化降低p65磷酸化并降低上清中TNF-α和NO的分泌量。干扰RNA实验进一步证实耐受细胞中SHIP的上调依赖于Siglec1的激活。小鼠耐受模型中,α2,3-唾液酸化显着上调小鼠脾脏巨噬细胞中Siglec1的表达。以上结果证实,α2,3-唾液酸化通过诱导Siglec1上调SHIP诱导内毒素耐受。本研究证实了lsg B基因介导的α2,3-唾液酸化在GPS致病力、突破上呼吸道屏障和逃避宿主天然免疫中发挥重要作用。本研究深入探究了α2,3-唾液酸化在GPS在逃避宿主天然免疫、突破屏障和逃避补体杀伤过程中的重要作用,为更好的理解GPS引发系统性疾病提供理论依据。
易竹君[2]（2021）在《PKM2四聚体调控巨噬细胞内毒素耐受的机制研究》文中研究表明背景脓毒症是临床上发病凶险和致死率高的常见并发症。内毒素耐受是机体应对脓毒症的一种重要的内源性保护途径。丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2,PKM2）是糖酵解途径的限速酶,PKM2有三种构型:单聚体、二聚体和四聚体。研究发现单核巨噬细胞在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的刺激下,促进PKM2四聚体（位于胞浆）向单/二聚体（位于胞核）转变,通过诱导单/二聚体PKM2的核转位,介导炎症反应。TEPP-46是PKM2的小分子激动剂,可以诱导PKM2四聚体形成。研究表明用TEPP-46处理的单核巨噬细胞通过抑制单/二聚体PKM2的核转位抑制LPS介导的炎症反应。TEPP-46除了可以抑制单/二聚体PKM2核转位,还可以促进PKM2四聚体形成。四聚体的PKM2对巨噬细胞内毒素耐受有何调控作用以及调控的具体分子机制是什么,目前尚不清楚。研究PKM2四聚体在巨噬细胞内毒素耐受中的作用机理,对阐明脓毒症时内源性保护效应具有重要意义。在本研究中,我们以C57BL/6小鼠、小鼠腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophage,PMs）、小鼠肝脏枯否细胞（Kupffer cells,KCs）以及RAW264.7巨噬细胞株为研究对象,以PKM2为研究靶点,通过用不同浓度LPS刺激的方式构建小鼠或巨噬细胞内毒素耐受和非耐受模型,探讨PKM2在内毒素耐受形成中的作用及分子机制。这为进一步研究内毒素耐受的分子机制以及研究脓毒症时机体的内源性保护途径提供了新的理论依据。第一部分:PKM2四聚体对巨噬细胞内毒素耐受的影响目的:探讨PKM2四聚体在体内/外对小鼠PMs和肝脏KCs以及RAW264.7巨噬细胞内毒素耐受的调控作用。方法:（1）用腹腔注射不同剂量LPS的方式构建小鼠内毒素耐受和非耐受模型,提取各组小鼠的PMs和KCs,Western blot实验和细胞免疫荧光实验检测内毒素耐受和非耐受小鼠PMs和KCs中PKM2蛋白表达;ELISA实验检测小鼠血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白细胞介素6（imerleukin-6,IL6）的水平。（2）提取正常小鼠PMs和KCs,用不同浓度LPS刺激,构建PMs、KCs和RAW264.7细胞内毒素耐受和非耐受模型,检测细胞中PKM2蛋白表达;ELISA实验检测细胞上清液中TNF-α和IL6的水平。（3）TEPP-46是PKM2的小分子激动剂,可以促进PKM2四聚体的表达。Western blot实验探索TEPP-46的最佳刺激浓度和最佳处理时间;CCK8实验检测TEPP-46对RAW264.7细胞活性的影响。（4）用TEPP-46诱导RAW264.7细胞PKM2四聚体的形成,再用大剂量LPS处理细胞,ELISA实验检测细胞上清液中炎症因子的水平,探讨TEPP-46诱导的PKM2四聚体形成对巨噬细胞内毒素耐受的影响。结果:（1）在体内,与内毒素非耐受组（脓毒症组）小鼠相比,内毒素耐受组小鼠PMs和KCs中PKM2四聚体表达升高,单/二聚体表达降低,抑制了LPS介导的PKM2核转位;内毒素耐受组小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL6的水平更低,差异具有统计学意义（p<0.05）。（2）在体外,与内毒素非耐受组的PMs、KCs和RAW264.7细胞相比,内毒素耐受组PMs、KCs和RAW264.7细胞中PKM2四聚体表达升高,单/二聚体表达降低（p<0.05）,同样抑制LPS介导的PKM2核转位;内毒素耐受组细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL6的水平更低（p<0.05）。（3）TEPP-46促进巨噬细胞PKM2四聚体形成,在50 nmol/ml的TEPP-46刺激2 h时巨噬细胞中PKM2四聚体的蛋白表达接近峰值;CCK8实验证实50 nmol/ml的TEPP-46刺激2h对巨噬细胞无明显毒性作用（p>0.05）。（4）用50 nmol/ml的TEPP-46预刺激RAW264.7细胞2 h,再用大剂量LPS处理,发现TEPP-46预处理可以显着降低LPS介导的炎症因子TNF-α和IL6的分泌（p<0.05）,诱导巨噬细胞内毒素耐受。结论:巨噬细胞内毒素耐受促进PKM2四聚体的高表达,而PKM2四聚体的形成也是巨噬细胞内毒素耐受的关键环节。第二部分:TEPP-46介导的PKM2四聚体形成调控巨噬细胞内毒素耐受的分子机制目的:探讨TEPP-46介导的PKM2四聚体形成调控巨噬细胞内毒素耐受的分子机制。方法:首先,探讨TEPP-46介导的PKM2四聚体形成对线粒体功能的影响。（1）用50 nmol/ml的TEPP-46刺激RAW264.7细胞2 h后,流式检测细胞对壬基吖啶橙染剂（nonyl acridine orange,NAO）的摄取;Western blot检测细胞中p62、LC3和线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A,mtTFA）的蛋白表达;RT-PCR实验检测线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）的相对拷贝数;透射电镜检测细胞的大体形态改变;线粒体压力测试实验检测细胞耗氧率（oxygen consumption rate,OCR）、基础呼吸、ATP产生和最大呼吸等。（2）接着用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默细胞PKM2基因后,再重复上述实验。（3）用短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）沉默细胞mtTFA基因,通过重复上述实验,探讨细胞线粒体生物合成对PKM2四聚体诱导的巨噬细胞内毒素耐受的调控作用。（4）用shRNA沉默细胞PGC-1α基因,重复上述实验,探讨PGC-1α在PKM2四聚体诱导的线粒体生物合成中的调控作用。（5）用PI3K小分子激动剂740Y-P或Akt小分子激动剂SC79刺激细胞,通过Western blot实验检测磷酸化PI3K（phosphorylation of PI3K,p-PI3K）、PI3K、p-Akt和Akt的蛋白表达,探讨PI3K/Akt信号通路在PKM2四聚体促进PGC-1α表达中的调控作用。结果:（1）50 nmol/ml的TEPP-46刺激RAW264.7细胞2 h,细胞对NAO的摄取显着增加（p<0.05）,说明TEPP-46介导的PKM2四聚体形成促进巨噬细胞线粒体质量的增加;此外,TEPP-46增加巨噬细胞mtDNA的相对拷贝数（p<0.05）,也促进mtTFA的蛋白表达（p<0.05）,电镜结果显示TEPP-46刺激细胞后,线粒体数量增多（p<0.05）,以上结果说明TEPP-46介导的PKM2四聚体形成促进巨噬细胞线粒体生物合成;TEPP-46对巨噬细胞中p62和LC3BI/II的蛋白表达无显着影响（p>0.05）,电镜结果显示细胞内溶酶体数量无显着变化（p>0.05）,提示TEPP-46介导的PKM2四聚体形成对巨噬细胞自噬和线粒体自噬水平无显着影响;TEPP-46刺激细胞后提高了巨噬细胞OCR,同时也提高了基础呼吸率、ATP产生和最大呼吸,说明TEPP-46介导的PKM2四聚体形成促进了巨噬细胞的呼吸功能（p<0.05）。（2）用siRNA沉默细胞PKM2后,发现沉默PKM2后,TEPP-46对线粒体生物合成和OCR的促进作用减弱甚至消失,提示TEPP-46的上述功能依赖于PKM2;（3）通过沉默细胞mtTFA的方式抑制线粒体生物合成后,有效抑制了PKM2四聚体诱导的巨噬细胞内毒素耐受;（4）PKM2四聚体通过促进PGC-1α的表达促进线粒体生物合成,用慢病毒抑制细胞PGC-1α的表达后,PKM2四聚体对巨噬细胞线粒体生物合成的促进作用减弱;（5）TEPP-46介导的PKM2四聚体形成通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活,促进PGC-1α的表达。用PI3K小分子激动剂740Y-P或Akt小分子激动剂SC79刺激细胞后,显着抑制了PKM2四聚体对PGC-1α的促进作用（p<0.05）。结论:TEPP-46介导的PKM2四聚体形成通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活,促进PGC-1α的表达,通过诱导巨噬细胞线粒体生物合成,抑制LPS介导的炎症因子TNF-α和IL6的释放,进而促进巨噬细胞内毒素耐受。第三部分:TEPP-46介导的PKM2四聚体形成对脓毒症小鼠内毒素耐受的调控作用目的:探讨TEPP-46介导的PKM2四聚体形成在体内对脓毒症小鼠内毒素耐受的调控作用。方法:（1）首先通过腹腔注射的方式将50 mg/kg的TEPP-46注入C57BL/6小鼠体内,再提取小鼠PMs和KCs,Western blot实验检测细胞中PKM2的蛋白表达;流式细胞仪检测了细胞对NAO的摄取;RT-PCR实验检测mtDNA的相对拷贝数。（2）用腹腔注射5 mg/kg LPS的方式或用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）构建小鼠脓毒症模型,联合腹腔注射50 mg/kg的TEPP-46,通过观察小鼠生存率、ELISA实验检测小鼠血清中炎症因子的水平以及HE染色检测肝组织的病理改变,探讨TEPP-46在体内对脓血症小鼠内毒素耐受的影响及调控作用。（3）通过尾静脉向小鼠体内注射氯磷酸二钠脂质体（clodronate liposomes,CL）清除小鼠体内的单核/巨噬细胞,再用腹腔注射LPS的方式构建小鼠脓毒症模型,联合腹腔注射50 mg/kg的TEPP-46,通过检测血清中炎症因子的水平,探讨单核/巨噬细胞在TEPP-46诱导的小鼠内毒素耐受中的作用。结果:（1）在体内,TEPP-46促进小鼠PMs和KCs中PKM2四聚体表达,并通过促进PGC-1α、核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factor,NRF1/2）和mtTFA的表达,诱导巨噬细胞线粒体生物合成;（2）TEPP-46有效抑制脓毒症小鼠炎症因子TNF-α和IL6的分泌,延长小鼠的生存时间（p<0.05）;（3）尾静脉注射CL可有效清除小鼠PMs和KCs（p<0.05）。清除小鼠PMs和KCs后,抑制了TEPP-46诱导的脓毒症小鼠内毒素耐受。结论:在小鼠体内,TEPP-46通过介导小鼠单核/巨噬细胞PKM2四聚体形成,诱导线粒体生物合成,进而促进小鼠内毒素耐受。
谭定勇,秦凡博,程瑶,龚建平[3]（2019）在《脂多糖诱导Kupffer细胞激活、焦亡及耐受机制研究进展》文中提出Kupffer细胞是定植于肝脏中的巨噬细胞,作为一类庞大的巨噬细胞群体,它与天然免疫和获得性免疫有密切关联。Kupffer细胞可被革兰阴性菌脂多糖（LPS,内毒素的主要构成）激活,现发现细胞外的LPS与细胞内的LPS均可以通过不同途径激活巨噬细胞,参与炎症介质的释放及导致焦亡。内毒素耐受是机体在面对感染时的一种自身防御机制,可以避免炎症过度激活带来的组织损伤,而Kupffer细胞则在内毒素耐受中扮演着重要的角色,近年来由于非编码RNA及蛋白泛素化修饰等研究不断进展,内毒素耐受的机制也因此有了新的研究进展。该文总结了LPS对Kupffer细胞的激活机制及近年来关于焦亡和内毒素耐受机制的研究进展。
杨虎,李运璧[4]（2013）在《内毒素耐受及相关机制探讨》文中研究指明经内毒素耐受后的机体其细胞因子的释放量、细胞及组织损伤程度均明显低于非耐受机体。而该耐受机制的建立与Toll样受体4（TLR4）通路的改变（正性）及负性调节分子的产生密切相关。本文从正负双向途径就内毒素耐受相关机制及其临床意义进行综述。
赵一萍[5]（2013）在《蒙古马免疫相关基因表达研究及脾脏表达谱分析》文中进行了进一步梳理中国马业正处在从传统马业向现代马业转型的过程中，急需培育出适应我国自然环境的马匹新品种（系）。为此，对优良地方品种蒙古马免疫相关基因进行研究，不但可以进一步了解蒙古马抗病力强的原因，为揭示蒙古马抗病力遗传特性提供理论依据，而且可以对蒙古马种质资源的保护、利用和创新起到积极的作用，并指导地方品种马的杂交改良、品种（系）的培育。本研究以蒙古马为研究对象，以纯血马为对照，首先对蒙古马与纯血马血液生化、免疫和抗氧化指标进行测定分析，判断正常生理情况下，蒙古马与纯血马血液指标是否存在差异，从总体上掌握两个品种马抗病力的情况；其次，对马匹抗病候选基因TLR2、TLR4多态性进行研究，分析两个品种马基因型的差异性；再次，采用实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）的相对定量方法对两个品种马不同组织中TLRs基因的表达量进行差异分析，同时对在脂多糖（LPS）诱导下的两个品种马单核细胞与免疫相关基因的差异表达进行研究，得到各基因的相对表达量，进而分析免疫相关基因对不同品种间抗性的影响；最后，利用高通量测序技术对蒙古马与纯血马脾脏表达谱文库进行测序，以寻找两个品种马脾脏组织中的差异表达基因。通过本研究的结果可以为揭示蒙古马抗病力遗传特性提供理论依据，并获得以下主要研究结果：1．通过对血液生化、免疫和抗氧化指标的结果分析发现，纯血马血液中白蛋白和胆固醇的含量偏高，这与其饲料营养水平相一致；蒙古马血液中球蛋白、IgG和IgA的含量均显着高于纯血马（P＜0.05），推测与蒙古马的免疫力高有关。2．采用PCR-SSCP技术对蒙古马与纯血马TLR2基因进行分型，两个群体都呈现出三种基因型（AA、AB和BB型）；经测序发现该基因外显子存在两处突变：编码区945bp位置G→C的同义突变和1070bp位置G→A的错义突变；由于密码子的摆动性，945bp位置并未导致精氨酸的突变；而1070bp位置由精氨酸突变为谷氨酰胺。对基因型统计分析，蒙古马与纯血马品种之间不同基因型分布存在显着差异（0.01≤P＜0.05）。3．通过直接测序方法发现，蒙古马与纯血马TLR4基因第3外显子共发现11处碱基突变，其中8处（520bp位置T→G，668bp位置A→G，817bp位置C→T，1003bp位置C→T，1513bp位置T→C，1546bp位置G→A，1771bp位置T→C和1903bp位置T→C）为同义突变；其他3处，713bp位置C→A导致谷氨酰胺变为赖氨酸，1353bp位置T→C使甲硫氨酸变为苏氨酸，1673bp位置A→G导致甲硫氨酸变为缬氨酸，并且这3处不同基因型分布存在极显着差异（P＜0.01）。4．采用RT-qPCR的2-△Ct方法对蒙古马与纯血马TLR1-9基因在肝脏、脾脏、肺脏、盲肠和骨髓组织进行了差异表达研究。结果表明各基因在5个组织中均有表达；TLRs基因在免疫器官（脾脏和骨髓）中的表达量为蒙古马高于纯血马；而在肝脏中为蒙古马低于纯血马。5．马外周血单核细胞经LPS刺激后，无论是蒙古马还是纯血马TLR4、CD14、MD-2、TNF-α、INF-β、IL-1β、IL-6和IL-8基因表达量都有所增加（与对照组相比）；TLR4、CD14、IL-1β、IL-6和IL-8基因的表达量均是蒙古马低于纯血马，其中TLR4基因和IL-1β基因表达差异显着（P＜0.05）。单核细胞上清液中细胞因子（TNF-α、INF-β、IL-1β和IL-8）含量在两个品种之间差异不显着（P≥0.05）。6．构建了蒙古马-脾脏和纯血马-脾脏组织表达谱文库，经Illumina Miseq高通量测序，分别获得了6811804和7744386有效reads；两个文库Map到8号和1号染色体的reads最多，而Map到29号、30号和31号染色体的reads最少；两个文库共筛出279个差异表达基因，其中与免疫相关的基因有45个。GO功能富集分析结果表明差异表达基因与生物学过程、细胞组分和分子功能有关；KEGG通路富集分析结果表明差异最大的显着富集KEGG条目为免疫系统。
杨雅[6]（2013）在《鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19诱导RAW264.7细胞内毒素耐受的实验研究》文中研究说明研究背景及目的：脓毒症（Sepsis）是临床上一种常见的危重病症，是指由感染引起的全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），具有发病率高、死亡率高的特点。作为革兰氏阴性菌细菌细胞壁外层的主要成分之一的内毒素（Lipopolysaccharide,LPS）除了能引发脓毒症外，还可通过诱导“内毒素耐受”，降低各种原因引起的炎症反应，从而预防潜在脓毒症的发生。内毒素耐受是指动物或免疫细胞等在给予小剂量LPS预处理后，对LPS再次刺激时无反应或反应性明显降低。因此，寻找一种可诱导内毒素耐受同时又不诱导机体产生炎性反应的药物是抗感染及抗炎药物研究的新策略。环状鲎肽（Cyclic limulus peptide，CLP-19）是经美洲鲎抗内毒素因子（Limulusanti-lipopolysaccharide factor, LALF）结构改造后得到的一条无溶血性、对巨噬细胞等无致炎作用的环肽，具有较理想中和LPS及抗菌活性。课题组前期研究表明，提前给予CLP-19可显着降低血清肿瘤坏死因子-α （Tumour Necrosis Factor, TNF-α）水平、提高大肠杆菌致急性腹膜炎模型鼠的生存率；预防性给予CLP-19能显着减少大肠杆菌致急性腹膜炎模型鼠体内的细菌量。在细胞水平，CLP-19预刺激30min后，以磷酸盐缓冲盐水（Phosphate buffered saline, PBS）清洗细胞，再用LPS进行刺激，结果发现，CLP-19预处理组同样可显着降低LPS刺激所引起的TNF-α的升高。上述现象表明，CLP-19可诱导“内毒素耐受”，然而其机制有待深入研究。因此，为明确CLP-19诱导内毒素耐受效应及分子机制，本实验通过建立RAW264.7细胞内毒素耐受模型，利用逆转录聚合酶链式反应（Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction, RT-PCR）、免疫印迹法（Western Blotting, WB）等比较研究巨噬细胞炎症信号通路中关键因子的mRNA及蛋白的变化，初步探讨CLP-19诱导内毒素耐受的分子机制。通过以上研究，拟明确CLP-19诱导小鼠“内毒素耐受”的作用及其途径，并为其用于脓毒症预防提供理论依据。实验方法：第一部分：CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应研究1. ELISA分析LPS诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应不同浓度（0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、10ng/ml）的LPS作用于RAW264.7细胞，培养不同时间（10h、20h、24h）后，新鲜培养基培养2h，再给予10ng/ml的LPS作用于细胞，4h后取上清液，酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）观察不同时间、不同剂量下TNF-α的表达量，从而确定LPS诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量。2. ELISA分析CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应用不同浓度（0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）的CLP-19作用于RAW264.7细胞，培养不同时间（10h、20h、24h）后，新鲜培养基培养2h，再加入LPS使其终浓度为10ng/ml，4h后取上清液，测定不同时间、不同剂量下TNF-α的表达量和IL-10的表达量，从而确定CLP-19诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量。以LPS诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量为对照组。3. CLP-19诱导内毒素耐受后IL-6和IL-10表达变化分别以5ng/ml LPS、50μg/ml CLP-19孵育细胞20h，用PBS反复清洗后以新鲜培养基培养2h，再加入LPS使其终浓度为10ng/ml，4h后取上清液测定IL-6和IL-10表达变化。第二部分：CLP-19诱导RAW264.7内毒素耐受的分子机制研究1. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内TLR4、myD88、TRAF6的mRNA表达变化用50μg/ml CLP-19预处理细胞20h，再用培养基培养2h，向各组中均加入10ng/mlLPS处理细胞不同时间（0h、1h、3h、6h、12h）后，提取细胞RNA，通过RT-PCR检测细胞因子Toll样受体4（Toll like receptor, TLR4）、髓样细胞分化因子88（mydoidMyD88，MyD88）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor-associated factor6，TRAF6）的mRNA变化。以培养基和5ng/ml LPS预处理作为对照。2. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内和胞膜TLR4的蛋白表达变化用50μg/ml CLP-19预处理细胞20h，用培养基培养2h后，再向各组中加入10ng/mlLPS作用4h后，分别提取胞膜和胞内蛋白，Western Blot检测胞膜和胞内TLR4蛋白的表达变化。以培养基预处理作为对照。3. CLP-19诱导内毒素耐受后P38的磷酸化水平变化用50μg/ml CLP-19预处理细胞20h，用培养基培养2h后，向各组中均加入10ng/mlLPS分别作用不同时间（0min、10min、30min、60min）后，提取细胞总蛋白，Western Blot检测促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路中P38的磷酸化水平。以培养基和5ng/ml LPS预处理作为对照。4. CLP-19诱导内毒素耐受后Iκ-B的蛋白表达变化用50μg/ml CLP-19预处理细胞20h，用培养基培养2h后，再向各组中加入10ng/mlLPS作用不同时间（0min、5min、15min、30min、60min）后，提取细胞总蛋白，WesternBlot检测核因子κB抑制蛋白（I-kappa-B，IκB）的蛋白表达变化。以培养基预处理作为对照。结果：第一部分：CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应研究5ng/ml LPS预处理RAW264.7细胞20h为LPS诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。50μg/ml CLP-19预处理RAW264.7细胞20h为CLP-19诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。50μg/ml CLP-19预处理巨噬细胞20h后，炎症因子IL-6表达下调，抗炎因子IL-10表达增加，与培养基预处理组相比，均有显着差异（P<0.01）。第二部分：CLP-19诱导RAW264.7细胞内毒素耐受的分子机制研究1. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内TLR4、myD88和TRAF6的mRNA表达变化RT-PCR结果显示，与培养基预处理细胞组比较，CLP-19预处理细胞组中，随着刺激时间的延长，TLR4mRNA表达下调，差异有统计学意义（P<0.01）。而MyD88和TRAF6的mRNA表达均无明显变化（P﹥0.05）。2. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内和胞膜TLR4蛋白表达降低Western Blot结果显示，与培养基预处理组相比，CLP-19诱导的内毒素耐受组中，胞膜和胞内TLR4的蛋白表达均下调，有显着差异（P<0.05）。3. CLP-19诱导内毒素耐受后MAPK通路中P38的磷酸化被抑制Western Blot结果显示，培养基预处理细胞组中，P38的磷酸化水平在刺激15min后明显增加，30min后达到高峰。与培养基预处理细胞组相比，CLP-19诱导的耐受组中，P38的磷酸化水平均被显着抑制（P<0.01）。4. CLP-19诱导内毒素耐受后IκB未被降解Western Blot结果显示，培养基预处理细胞组中，IκBα在大剂量LPS刺激30min内迅速降解，IκBβ在大剂量LPS刺激60min后迅速降解。与培养基预处理细胞组相比，CLP-19诱导的耐受组中，IκBα和IκBβ表达水平有显着差异（P<0.01）。结论：1.50μg/ml CLP-19预处理RAW264.7细胞20h为CLP-19诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。2.鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可通过降低TLR4在胞膜和胞内的表达诱导内毒素耐受。3.鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可通过抑制P38磷酸化诱导内毒素耐受。4.鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可抑制IκBα和IκBβ的降解，从而抑制NF-κB转位进入胞核，进而诱导内毒素耐受。
李慧[7]（2012）在《Toll样受体2,4与人牙龈上皮细胞内毒素耐受的关系初探》文中研究表明人牙龈上皮细胞（human gingival epithelial cells,HGECs）长期暴露于大量的细菌环境中,是防御病原微生物入侵牙周组织的第一道屏障。牙周炎是一种慢性感染性疾病,长期的细菌内毒素（lipopolysaccharide,LPS）刺激可能会诱使HGECs对后续刺激的反应性降低,即产生内毒素耐受。内毒素耐受的机制究竟是什么,是否与LPS的信号识别受体Toll样受体 2（toll-like receptor 2,TLR2）和 Toll 样受体 4（toll-like receptor 4,TLR4）有关,它将如何影响牙周炎症的发生和发展,目前尚不得而知。目的:本研究旨在建立一种HGECs的内毒素耐受模型,并初步探讨内毒素耐受在牙周组织炎症反应中的作用和机制,为进一步阐明牙周炎发生发展的免疫学机理提供实验数据。方法:1.利用酶消化法体外分离培养HGECs;检测角蛋白和波形丝蛋白的表达,以确定其生物学来源;并采用MTT法观察HGECs在体外的生长特性。2.采用 1μg/ml 牙银卟啉单胞菌（Pophyromonasg gingivalis,P.gingivalis）LPS和/或1μg/ml大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）LPS重复刺激或交叉重复刺激,建立HGECs的内毒素耐受模型。利用ELISA法检测炎症因子IL-1β、IL-6,和趋化因子IL-8表达水平的变化。3.采用逆转录PCR技术检测TLR2,4 mRNA在HGECs的表达;采用real-time PCR技术和流式细胞术检测HGECs产生内毒素耐受或交叉耐受后,TLR2,4 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:1.通过酶消化法分离培养的HGECs表达角蛋白,属于外胚层来源的细胞,在体外具有良好的增殖能力。2.1 μg/ml P.gingivalis LPS 或 1μg/ml E.coli LPS 刺激 HGECs 24h 后,细胞条件培养液中均可检测到IL-1β、IL-6和IL-8,三种细胞因子的分泌水平均较刺激前明显增高（p<0.05）。上述两种LPS重复刺激或交叉重复刺激后,IL-6和IL-8的表达水平均较单次刺激后明显降低（p<0.05）;1μg/ml E.coli LPS重复刺激后,IL-1β的分泌水平也较单次刺激后明显降低（p<0.05）。表明,内毒素耐受模型的构建是成功的。3.来自不同个体的HGECs 均表达TLR2,4mRNA。1μg/ml P.gingivalis LPS刺激HGECs后,TLR2 mRNA和蛋白表达水平均明显上调（p<0.05）;1μg/ml E.coli LPS刺激后,TLR4 mRNA和蛋白表达水平也明显上调（p<0.05）。1μg/ml P.gingivalisLPS重复刺激后,TLR2 mRNA和蛋白表达水平较单次刺激后明显降低（p<0.05）;1μg/ml E.coli LPS重复刺激后,TLR4 mRNA和蛋白表达水平也较单次刺激后明显降低（p<0.05）。结论:本研究首次构建了 HGECs的内毒素耐受模型,并初步探讨了内毒素耐受对牙周组织炎症和免疫反应的影响,及其作用机制。研究结果显示,P.gingivalis LPS和（或）E.coli LPS重复刺激能诱导HGECs产生内毒素耐受,不同程度的抑制细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的分泌,这种耐受可能与TLR2,4表达水平的降低有关。
游海波[8]（2011）在《Twist-2在Kupffer细胞内毒素耐受形成机制的实验研究》文中进行了进一步梳理脓毒症是各种严重创伤、感染、缺血再灌注损伤及外科大手术常见的并发症,至今在临床上仍缺乏有效的治疗手段,由严重脓毒症和脓毒症性休克导致的病死率高达30%左右。脓毒症具有患病率高、死亡率高、治疗费用高的“三高”现象,临床上脓毒症大多数由革兰氏阴性（G-）细菌感染所致。内毒素（Endotoxin）又称脂多糖（lipoplysacchride, LPS）是G-细菌细胞壁上的主要成分和主要的致病成分,其具有广泛的生物活性,通过引起炎症细胞释放TNF-α等大量炎症介质,导致全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）及多器官功能障碍。内毒素耐受（endotoxin tolerance,ET）是指预先以小剂量LPS或其同系物刺激动物或单核-巨噬细胞系统（Mononuclear phagacytic system,MPS）随后再用致死剂量的LPS攻击时,表现为对LPS的低反应性,以保护机体免受LPS致死性毒性反应的现象,称内毒素耐受。内毒素耐受被认为是生物在长期进化过程中形成的一种负反馈调节机制,是一种主动性适应性应答,总体来说内毒素耐受时的细胞因子低表达对机体的影响是积极的。目前,关于内毒素耐受及形成机制仍未完全阐明。NF-κB是一个多功能核转录因子,在调控促炎症基因的合成和释放中起决定性作用,其过度活化并启动相关靶基因转录,可产生和释放大量炎性介质,从而引起“介质病”。在基础情况下,NF-κB二聚体被NF-κB抑制蛋白（inhibitors of NF-κB,IκB）隐没于细胞质中。因此,NF-κB活化的前提条件是IκB的降解或去除NF-κB母核的抑制区域。激活的NF-κB复合物转入细胞核内,与靶基因启动子结合后行使其转录调节功能。目前大量的研究证据表明:细胞中存在着NF-κB激活的负性调节通路,即在NF-κB激活的同时,也进行着NF-κB负性调节因子的的合成及再合成。该负性调节通路的存在能够限制和阻断前炎症因子诱导的NF-κB的活性,以限制炎症性损伤是至关重要的。最近研究发现,扭蛋白Twist-2是核转录因子NF-κB的负性调节的重要相关蛋白,它在参与负性NF-κB调节通路及减缓炎症的应答中起到重要的作用,从而有可能参与内毒素耐受的形成机制。本研究即通过内毒素预处理建立内毒素耐受小鼠模型及体外Kupffer细胞模型,观察在内毒毒耐受状态下机体及细胞中Twist-2表达的变化,初步确定Twist-2与内毒素耐受的关系;进而采用特异性RNA干扰技术在体外沉寂Twist-2的基因表达,观察Kupffer细胞内毒素耐受性的改变;由此阐明Twist-2在内毒素耐受形成中的作用及机制,从而为脓毒症的临床治疗提供新的干预靶点和手段。第一部分Twist-2在内毒素耐受小鼠肝组织中表达变化及意义的研究目的建立内毒素耐受小鼠模型,观察内毒素耐受小鼠接受大剂量LPS刺激前后Twist-2在肝组织中的表达变化情况,从机体水平初步探讨Twist-2与内毒素耐受之间的关系。方法通过对实验动物处理方式的不同,随机分为内毒素非耐受组（NETT）和耐受组（ETT）。比较两组实验动物的一般情况;光镜观察肝组织病理学改变;电镜观察肝脏细胞超微结构改变;转录因子分析试剂盒检测NF-κB活性;酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血浆中的TNF-α水平;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝组织TNF-α及Twist-2的mRNA表达水平。结果（1）成功建立了内毒素耐受小鼠模型;（2） EET组小鼠各时相点血浆TNF-α含量、肝组织中TNF-α表达明显减弱、肝组织中NF-κB活性显着降低（P<0.05）;（3） NETT组在LPS刺激24h后才能在肝组织中检测到Twist-2的mRNA表达,而ETT组肝组织中Twist-2 mRNA表达在0h时已能检测,并在LPS刺激后迅速上调,于6h时达高峰,24h时其表达强度仍为非耐受组2.5倍。结论LPS预处理能成功诱导小鼠内毒素耐受;肝组织中Twist-2高表达表达及Kupffer细胞活化受到抑制可能与内毒素耐受的形成有关。第二部分Twist-2在内毒素耐受Kupffer细胞中的表达及意义目的观察内毒素耐受时Twist-2在kupffer细胞中表达变化情况,并探讨其在Kupffer细胞内毒素耐受中的作用及意义。方法通过分离培养kupffer细胞,根据处理方式的不同分为非耐受组（NETT）和耐受组（ETT）。分别用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测kupffer细胞中Twist-2;TNF-αmRNA表达水平;蛋白印迹法（Western Blotting）检测Twist-2蛋白表达情况;以及Trans AM NF-κB Kit检测kupffer细胞内核转录因子（NF-κB）的相对活性;用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养液中TNF-α的水平。结果（1）成功诱导内毒素耐受Kupffer细胞模型;（2）内毒素非耐受组的NF-κB相对活性、TNF-α含量和表达均较耐受组明显升高（P<0.05）,（3） RT-PCR和Western blotting分析显示:NETT组细胞在LPS刺激24h后才能检测出Twist-2 mRNA和Twist-2蛋白的表达,而ETT组细胞在LPS刺激前已可检测到Twist-2的基因表达,且该表达随LPS刺激的持续而维持在较高水平。结论内毒素耐受状态下,Twist-2基因转录和翻译水平明显上调,而kupffer细胞的活性受到明显抑制,但未完全丧失,提示Twist-2具有负性调控KCs的活性的作用,在内毒素耐受的形成中起重要作用,但并非内毒素耐受的唯一机制,可能还有其它机制在内毒素耐受的形成中发挥作用。第三部分Twist-2特异性RNA干扰对Kupffer细胞内毒素耐受性的影响目的应用RNA干扰技术（RNAi）沉寂Kupffer细胞Twist-2基因表达,观察细胞内毒素耐受性的改变,探讨Twist-2在内毒素耐受形成中的作用。方法应用Twist-2特异性shRNA质粒,转染Kupffer细胞,以载体pGenesil-1转染为阴性对照,分为pTwist-2-shRNA转染组和pGenesil-1组,两组先经10ng/ml LPS预处理后,再用100ng/ml LPS进行孵育;用ELISA检测培养液中的TNF-α水平;RT-PCR检测细胞中的Twist-2 mRNA表达;用TransAM NF-κB Kit检测细胞中NF-κB活性,Western blotting检测其对Twist-2蛋白表达。结果（1） pGenesil-1载体转染对Twist-2 mRNA表达无明显抑制作用,可作为阴性对照。（2） pGenesil-1组中Twist-2 mRNA和Twist-2蛋白水平明显高于pTwist-2-shRNA转染组,而pGenesil-1组细胞培养液中TNF-α水平、NF-κB活性明显低于pTwist-2-shRNA转染组,各项指标比较均有显着性差异。结论RNA干扰抑制Twist-2基因表达后,Kupffer细胞的内毒素耐受性明显减弱,表明Twist-2表达在内毒素耐受的形成机制中发挥着重要的作用。
袁硕[9]（2011）在《SOCS-1和SOCS-3蛋白表达对Galn/LPS诱导急性肝损伤发生的影响》文中进行了进一步梳理目的:利用小鼠内毒素耐受（endotoxin tolerance, ETT）模型,探讨肝脏SOCS-1、SOCS-3蛋白表达对半乳糖胺/脂多糖（Galn/LPS）诱导急性肝损伤发生的影响。方法:实验1.雄性昆明小鼠72随机分为三组,（1）对照组:腹腔注射0.9% NaCl 0.2 ml; （2）Galn /LPS组:腹腔注射（Galn 20 mg/LPS 4μg）/只;（3）内毒素耐受组（ETT）:连续三次间隔24小时腹腔注射LPS 2mg/kg,于LPS第三次注射24小时后腹腔注射Galn/LPS,剂量与Galn/LPS组相同。各组动物分别于注射生理盐水或Galn/LPS后1h、1.5h、3h、6h,在戊巴比妥钠麻醉下经眼内眦采血、开腹取肝,分别用于血浆ALT活性、肝脏TNF-α、IL-10含量测定。实验2动物和分组同实验1,分别于生理盐水或Galn/LPS注射后1h、3h、6h,在戊巴比妥钠麻醉下开腹取肝脏,用Western blotting方法检测肝脏SOCS-1、SOCS-3、p-STAT-3、STAT-3、IRAK-4蛋白的表达。结果:LPS预处理可明显减轻Galn/LPS所致急性肝损伤,与肝损伤组相比经LPS预处理动物血浆ALT活性明显下降,肝脏IL-10含量明显升高,TNF-α含量则显着降低（P <0.05）。ETT组和肝损伤组肝脏SOCS-1和SOCS-3蛋白表达变化趋势基本相同,即Galn/LPS腹腔注射后1h时达到其表达高峰,3h时逐渐开始下调,6h时降至低谷,但ETT组肝脏SOCS-1和SOCS-3蛋白表达在各时间点上均高于肝损伤组（P <0.05）。ETT组肝脏IRAK-4蛋白则于1h开始明显上调,至6h时达到其高峰（P <0.05）。Galn/LPS注射后6h可显着诱导肝损伤组肝脏STAT3蛋白的磷酸化（P <0.05）,而LPS预处理可显着抑制肝脏STAT3蛋白磷酸化水平（P <0.05）。结论:ETT可通过诱导肝脏SOCS–1、SOCS-3、IRAK-4蛋白表达上调,抑制Galn/LPS介导STAT的信号转导,使TNF-α释放减少,IL-10生成增多,减轻Galn/LPS诱导急性肝损伤。
郭建红[10]（2010）在《多次小剂量LPS处理减轻慢性肝损伤的机制研究》文中研究表明内毒素（endotoxin, ET）主要的毒性成分脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）,是革兰氏阴性（Gˉ）细菌细胞壁上的主要成份,也是Gˉ细菌最为重要的致病物质,可激活单核-巨噬细胞系统（mononuclear phagocytic system, MPS）引起肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白三烯（leukotriene）等细胞因子、炎症介质大量释放,导致肝损伤甚至是肝功能衰竭的发生,而机体或细胞经小剂量LPS处理后所诱导的内毒素耐受（endotoxin tolerance,ETT）则对LPS的再次刺激呈低反应性。目前认为,内毒素耐受是生物在长期进化过程中形成的一种负反馈调节机制,是一种适应性应答,能避免机体对LPS刺激的持续过度反应,是机体防御机制的重要组成部分。这就提示如能调动机体的内源性抗损伤机制,使其在随后受到细菌或毒素感染时,即能发挥抗感染的有益作用,又不致于引发过度炎症反应,无疑对肝损伤的防治具有重要作用。我所诸多动物实验和临床研究发现,各种慢性肝炎、肝硬化动物和患者均伴有肠源性内毒素血症（IETM）,有报道认为,小剂量LPS处理可以减轻急性肝损伤,而多次小剂量LPS处理与慢性肝损伤的关系及机制国内外报道尚属罕见,值得进一步研究。本论文共分两部分。第一部分：多次小剂量LPS处理对CCl4诱导的慢性肝损伤的影响及其相关信号分子的变化；第二部分：多次小剂量LPS处理对非酒精性脂肪性肝炎发生发展的影响及其机制研究。第一部分探讨多次小剂量LPS处理对CCl4诱导的慢性肝损伤的影响及其相关信号分子的变化实验一多次小剂量LPS处理对CCl4诱导的慢性肝损伤的影响选取雄性Wistar大鼠34只,随机分为正常对照组、肝损伤组和LPS处理组。肝损伤组经皮下注射CCl4并同时饲以高脂饮食诱导慢性肝损伤,LPS处理组经腹腔注射小剂量LPS,余同肝损伤组。实验第4周末大鼠在1%戊巴比妥钠麻醉下,无菌无热原条件下取腹主动脉血,用于测定内毒素水平和ALT活性；取肝组织测定TNF-α水平；制备肝脏切片,观察肝脏病理改变。结果：肝损伤组血浆内毒素水平、ALT活性、肝匀浆TNF-α水平均明显高于正常对照组；而经小剂量LPS处理后血浆ALT活性、肝匀浆TNF-α水平显着低于肝损伤组；肝组织切片HE染色结果发现,肝损伤组肝细胞出现严重的脂肪变性,可见细胞核被挤压在细胞边缘；肝组织内可见肝细胞点状及灶状坏死,坏死区有以淋巴细胞为主的慢性炎细胞浸润；而LPS处理组肝细胞内脂肪空泡以小空泡为主、数量少,肝脂肪变性明显减轻,同时肝组织淋巴细胞浸润少。经统计学处理后提示CCl4所致肝损伤伴有肠源性内毒素血症；经多次小剂量LPS处理可以减轻肝损伤。实验二TLR4在多次小剂量LPS处理减轻CCl4诱导的慢性肝损伤中的作用本部分实验采用Western blotting测定各组肝组织中TLR4表达。实验动物同实验一。结果表明,肝损伤组TLR4表达与正常对照相比,明显增强；经多次小剂量LPS处理后肝组织中TLR4表达明显下调,与肝损伤组相比差异有显着性。实验三在多次小剂量LPS处理减轻CCl4诱导的慢性肝损伤中p38MAPK的表达该实验采用Western blotting观察各组肝组织中p38MAPK表达的变化。实验动物同实验一。结果显示,各组总p38MAPK表达一致,而pp38MAPK在肝损伤组的表达明显增强,经多次小剂量LPS处理后,显着减弱。实验四在多次小剂量LPS处理减轻CCl4诱导的慢性肝损伤中NF-κB与IκB的表达该实验主要采用Western blotting观察各组肝组织中NF-κB与IκB表达的变化。实验动物同实验一。结果：肝损伤组与正常对照组相比,NF-κB表达明显增强,IκB表达明显减弱；而LPS处理组NF-κB表达明显减弱,IκB表达明显增强。实验五在多次小剂量LPS处理减轻CCl4诱导的慢性肝损伤中IRAK-M的表达该实验主要采用Western blotting观察各组肝组织中IRAK-M表达的变化。实验动物同实验一。结果：小剂量LPS处理可明显增强肝组织IRAK-M表达水平,与肝损伤组相比差异有显着性。综合第一部分的实验结果,归纳如下：①CCl4诱导的慢性肝损伤大鼠模型体内存在肠源性内毒素血症,肠源性内毒素也是造成慢性肝损伤的重要原因。②经多次小剂量LPS处理可以减轻CCl4诱导的慢性肝损伤；③TLR4表达下调是LPS处理减轻慢性肝损伤的机制之一。④LPS处理可能通过上调IRAK-M水平,阻碍了MAPK信号转导通路,从而使致炎因子,尤其是TNF-α产生减少,从而减轻了CCL4诱导的慢性肝损伤。第二部分多次小剂量LPS处理对非酒精性脂肪性肝炎的影响及其机制研究实验六多次小剂量LPS处理对高糖高脂诱导的非酒精性脂肪性肝炎的影响随机将雄性Wistar大鼠分为正常对照组、肝损伤组和LPS处理组。肝损伤组饲以高糖高脂饮食,LPS处理组隔日经皮下注射小剂量LPS,余同肝损伤组。分别在实验第4周末、第9周末,1%戊巴比妥钠麻醉下,无菌无热原条件下取腹主动脉血,离心后检测血浆ET、ALT、TNF-α、IL-10、APN、FPG, FINS水平。取肝左叶10%福尔马林固定,石蜡包埋,5μm切片,做HE染色光镜观察肝组织病理变化,作TUNEL染色观察各组肝细胞凋亡变化。结果：4周肝损伤组内毒素、ALT水平均略高于正常组,差异没有显着性；9周肝损伤组血浆内毒素水平、ALT水平均明显高于正常对照组,提示肝损伤组大鼠体内形成了肠源性内毒素血症,肝组织损伤明显,肝组织切片HE染色也显示,9周肝损伤组肝脏出现以大泡性脂滴为主的脂肪变性,肝小叶和汇管区有大量炎细胞浸润,可见点状和灶状坏死,而9周LPS处理组血浆ALT水平明显降低,脂肪数量少、空泡小,脂肪变性明显减轻；LPS处理组促炎因子TNF-α水平降低,抗炎因子IL-10水平升高,Th1/Th2降低。肝细胞作为LPS的靶细胞,经小剂量LPS处理,凋亡率低于肝损伤组,差异有显着性。试验七多次小剂量LPS处理对胰岛素抵抗和胰岛β细胞凋亡的影响该实验通过采用TUNEL法观察胰岛β细胞凋亡的改变。结果,经小剂量LPS处理后,β细胞凋亡明显减少；胰岛素抵抗指数比肝损伤组有所降低,但差异没有显着性,可能与试验时间短有关。综合第二部分的实验结果,归纳如下：①高糖高脂诱导的非酒精性脂肪性肝炎存在肠源性内毒素血症,肠源性内毒素可能是非酒精性脂肪性肝炎发生发展的重要原因；②多次小剂量LPS处理可以减轻非酒精性脂肪性肝炎；③TH1/TH2下降可能是多次小剂量LPS处理减轻肝损伤的机制之一；④肝细胞凋亡下降与肝损伤减轻相关；⑤多次小剂量LPS处理可使胰岛β细胞凋亡减少、胰岛素抵抗指数下降。综上所述,得出以下结论：1、经多次小剂量LPS处理均可减轻CCl4及高糖高脂对大鼠所致的慢性肝损伤。2、多次小剂量LPS处理减轻CCl4所致的慢性肝损伤与受体和信号转导通路受阻致使致炎因子,主要是TNF-α的减少有关。3、多次小剂量LPS处理减轻高糖高脂所致的非酒精性脂肪肝炎及其相关的胰岛素抵抗和p细胞凋亡下降与M1/M2（与TH1/TH2相对应）比值下降有关。4、无论CCl4还是高糖高脂所致的肝损伤均与激活巨噬细胞相关,而多次小剂量LPS处理减轻肝损伤可能都是通过抑制巨噬细胞实现的。
二、巨噬细胞内毒素耐受时TLR4/MD-2的基因表达调节作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、巨噬细胞内毒素耐受时TLR4/MD-2的基因表达调节作用（论文提纲范文）
（1）lsgB基因介导的脂寡糖α2，3-唾液酸化在副猪革拉瑟氏菌致病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 副猪革拉瑟氏菌研究进展 |
| 1.1.1 副猪革拉瑟氏菌病原学及流行病学 |
| 1.1.2 副猪革拉瑟氏菌致病机制研究进展 |
| 1.1.3 副猪革拉瑟氏菌LOS及其修饰机制 |
| 1.1.4 小结与展望 |
| 1.2 唾液酸化研究进展 |
| 1.2.1 唾液酸简述 |
| 1.2.2 微生物唾液酸和类唾液酸分子合成机制的追溯 |
| 1.2.3 唾液酸转移酶研究进展 |
| 1.2.4 唾液酸化的生物学意义 |
| 1.2.5 小结与展望 |
| 1.3 唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素Siglecs |
| 1.3.1 Siglecs家族简述 |
| 1.3.2 Siglec1简述 |
| 1.3.3 Siglecs参与病原体免疫反应的研究进展 |
| 1.3.4 小结与展望 |
| 1.4 呼吸道屏障简述 |
| 1.4.1 呼吸道黏液屏障 |
| 1.4.2 呼吸道上皮细胞屏障 |
| 1.4.3 呼吸道病原菌的竞争及屏障破坏 |
| 1.4.4 胞外基质与呼吸道屏障 |
| 1.4.5 小结与展望 |
| 1.5 转化生长因子研究进展简述 |
| 1.5.1 转化生长因子简述 |
| 1.5.2 TGF-β1信号转导 |
| 1.5.3 转化生长因子的主要功能 |
| 1.5.4 小结与展望 |
| 1.6 内毒素耐受研究进展 |
| 1.6.1 内毒素耐受简述 |
| 1.6.2 内毒素耐受分子机制 |
| 1.6.3 内毒素耐受对疾病的影响 |
| 1.6.4 小结与展望 |
| 第2章 目的与意义 |
| 第3章 副猪革拉瑟氏菌lsgB基因功能的初步研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和细胞 |
| 3.1.2 相关质粒 |
| 3.1.3 试剂和试剂盒 |
| 3.1.4 培养基及抗生素的配制 |
| 3.1.5 主要溶液及其配制 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.1.7 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 副猪革拉瑟氏菌株的复苏和传代培养 |
| 3.2.2 p KWHK自杀性质粒的构建 |
| 3.2.3 lsgB基因缺失菌株的筛选 |
| 3.2.4 lsgB缺失菌株的RT-PCR鉴定 |
| 3.2.5 p SWHG穿梭质粒的构建 |
| 3.2.6 lsgB互补菌株的构建 |
| 3.2.7 野生菌株、缺失菌株及互补菌株生长曲线比较 |
| 3.2.8 野生菌株、缺失菌株及互补菌株的血清杀菌实验 |
| 3.2.9 热酚-水法(hot phenol-water)提取细菌内毒素(大量制备) |
| 3.2.10 鲎试剂终点显色法测定内毒素活性 |
| 3.2.11 脂多糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染 |
| 3.2.12 野生菌株、缺失菌株及互补菌株的自身凝集能力检测 |
| 3.2.13 野生菌株、缺失菌株及互补菌株对细胞黏附及侵入能力检测 |
| 3.2.14 野生菌株、缺失菌株及互补菌株与血清补体抑制因子f H结合实验 |
| 3.2.15 流式细胞术 |
| 3.2.16 黏附抑制实验 |
| 3.2.17 毒力评估实验 |
| 3.2.18 高效液相色谱检测唾液酸含量 |
| 3.2.19 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 缺失菌株缺失长度的选择 |
| 3.3.2 pKWHK和pSWHG重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.3 lsgB基因缺失菌株及互补菌株的PCR鉴定 |
| 3.3.4 lsgB基因缺失菌株RT-PCR和qPCR鉴定 |
| 3.3.5 lsgB基因缺失不影响GPS菌株的生长 |
| 3.3.6 lsgB基因缺失影响GPS菌株LOS末端的唾液酸化 |
| 3.3.7 lsgB基因缺失影响GPS菌株抵抗血清杀伤的能力 |
| 3.3.8 lsgB基因缺失影响GPS菌株对细胞的黏附和侵入 |
| 3.3.9 lsgB基因缺失影响GPS菌株的自身凝集 |
| 3.3.10 LOS唾液酸化影响补体fH因子在GPS菌株表面的沉积 |
| 3.3.11 LOS唾液酸化影响GPS菌株的毒力 |
| 第4章 lsgB-介导的LOS唾液酸化在GPS突破气管上皮屏障中的作用探究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和细胞 |
| 4.1.2 相关质粒 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细菌侵入和Transwell实验 |
| 4.2.2 ELISA试剂盒测定TGF-β1分泌量 |
| 4.2.3 免疫组化 |
| 4.2.4 细菌与重组蛋白pull-down实验 |
| 4.2.5 Western Blot |
| 4.2.6 荧光定量PCR(qPCR) |
| 4.2.7 免疫共沉淀 |
| 4.2.8 siRNA干扰 |
| 4.2.9 细胞的转染及co-IP |
| 4.2.10 LOS-ELISA |
| 4.2.11 流式细胞术 |
| 4.2.12 双荧光素酶实验 |
| 4.2.13 利用CRISPR-Cas9技术在NPTr细胞中构建基因缺失细胞系 |
| 4.2.14 ECIS测定细胞的跨细胞电阻值 |
| 4.2.15 感染动物组织采样 |
| 4.2.16 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 LOS唾液酸化诱导巨噬细胞Siglec1分子的高表达 |
| 4.3.2 LOS唾液酸化诱导肺泡巨噬细胞产生TGF-β1 |
| 4.3.3 唾液酸化的LOS通过Siglec1/DAP12/Syk轴促进TGF-β1分泌 |
| 4.3.4 猪源Siglec1胞内存在ITAM-like基序 |
| 4.3.5 p38参与Siglec1/DAP12/Syk介导的TGF-β1产生 |
| 4.3.6 TGF-β1影响气管上皮细胞屏障功能 |
| 4.3.7 LOS唾液酸化调控TGF-β1的产生来促进GPS的跨细胞迁移 |
| 4.3.8 LOS唾液酸化调控TGF-β1的产生来促进GPS侵入细胞 |
| 第5章 LOS唾液酸化在诱导免疫细胞耐受中的作用及机制 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株和细胞 |
| 5.1.2 相关质粒 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 GPS和HI的LOS提取及去唾液酸化 |
| 5.2.2 内毒素耐受动物模型和细胞模型 |
| 5.2.3 小鼠脾脏单细胞悬液的制备 |
| 5.2.4 脾脏单细胞表面的染色 |
| 5.2.5 RAW264.7细胞免疫荧光染色及激光共聚焦 |
| 5.2.6 统计学分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 去唾液酸化的LOS降低巨噬细胞内毒素耐受能力 |
| 5.3.2 去唾液酸化减弱耐受细胞Siglec1和SHIP的表达及其相互作用 |
| 5.3.3 Siglec1是内毒素耐受潜在分子靶标 |
| 5.3.4 DAP12对下游信号的特异性调控 |
| 第6章 讨论 |
| 6.1 lsgB基因功能的初步探索 |
| 6.2 Siglecs与细菌感染的“磋商” |
| 6.3 唾液酸在机会致病菌中的“变装” |
| 6.4 机会致病菌的“无声”入侵 |
| 6.5 小结与展望 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）PKM2四聚体调控巨噬细胞内毒素耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 PKM2四聚体对巨噬细胞内毒素耐受的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 内毒素耐受和非耐受小鼠PMs和KCs中PKM2表达变化 |
| 2.2 不同巨噬细胞内毒素耐受和非耐受时PKM2表达变化 |
| 2.3 PKM2四聚体对巨噬细胞内毒素耐受形成的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TEPP-46介导的PKM2四聚体形成调控巨噬细胞内毒素耐受的 分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TEPP-46介导的PKM2四聚体形成对线粒体功能的影响 |
| 2.2 线粒体生物合成对PKM2四聚体诱导的巨噬细胞内毒素耐受的调控作用 |
| 2.3 PGC-1α对PKM2四聚体诱导的线粒体生物合成和巨噬细胞内毒素耐受的调控作用 |
| 2.4 PI3K/Akt信号通路是四聚体的PKM2促进PGC-1α表达的关键桥梁 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TEPP-46介导的PKM2四聚体形成对脓毒症小鼠内毒素耐受的调控作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TEPP-46对小鼠单核巨噬细胞PKM2表达的影响 |
| 2.2 TEPP-46对LPS诱导的脓毒症小鼠的调控作用 |
| 2.3 TEPP-46对CLP诱导的脓毒症小鼠的调控作用 |
| 2.4 TEPP-46通过诱导巨噬细胞PKM2四聚体形成促进小鼠内毒素耐受 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 PKM2依赖的代谢重编程在炎症相关性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文和参与的课题 |
（3）脂多糖诱导Kupffer细胞激活、焦亡及耐受机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 LPS诱导Kupffer细胞激活的信号通路 |
| 1.1 细胞外LPS激活Kupffer细胞的信号通路 |
| 1.2 细胞内LPS激活Kupffer细胞的信号通路 |
| 2 细胞内LPS诱导的Kupffer细胞焦亡 |
| 3 Kupffer细胞内毒素耐受机制的研究进展 |
| 3.1 内毒素耐受概念及TLRs通路上的负性调控因子 |
| 3.2 TRAF3的泛素化修饰在Kupffer细胞内毒素耐受中的作用 |
| 3.3 非编码RNA对TLRs信号通路的调控在Kuffer细胞内毒素耐受中的作用 |
| 3.3.1 微RNA(microRNA,miRNA）对Kuffer细胞内毒素耐受的调控 |
| 3.3.2 长链非编码RNA(LncRNA）对内毒素耐受的调控 |
| 4 总结与展望 |
（4）内毒素耐受及相关机制探讨（论文提纲范文）
| 1 TLR通路 |
| 2 TLR4信号转导通路与内毒素耐受 |
| 2.1 LPS结合蛋白(LPS binding protein,LBP)、CD14与内毒素耐受 |
| 2.2 TLR4/MyD88依赖型信号通路与内毒素耐受 |
| 2.2.1 TLR4与内毒素耐受 |
| 2.2.2 MyD88与内毒素耐受 |
| 2.2.3 IRAK与LPS耐受 |
| 2.2.4 MAPK与内毒素耐受 |
| 2.2.5 NF-КB与内毒素耐受 |
| 2.3 TLR4/MyD88非依赖型信号通路与内毒素耐受 |
| 3 与内毒素耐受相关的负性调节分子 |
| 4 内毒素耐受与儿童内毒素血症及脓毒症 |
（5）蒙古马免疫相关基因表达研究及脾脏表达谱分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 蒙古马与纯血马品种间抗病力差异 |
| 1.2 抗病力与抗病育种 |
| 1.2.1 抗性 |
| 1.2.2 抗病育种 |
| 1.3 马免疫系统概述 |
| 1.3.1 免疫器官 |
| 1.3.2 免疫细胞 |
| 1.3.3 免疫分子 |
| 1.3.4 免疫应答 |
| 1.4 Toll 样受体概述 |
| 1.4.1 Toll 样受体的结构 |
| 1.4.2 Toll 样受体家族成员 |
| 1.4.3 Toll 样受体信号传导途径 |
| 1.5 免疫学检测方法及免疫相关基因研究技术手段 |
| 1.5.1 免疫学检测方法 |
| 1.5.2 免疫相关基因多态性研究技术手段 |
| 1.5.3 免疫相关基因表达研究技术手段 |
| 1.6 本研究的目的、意义及主要研究内容 |
| 1.6.1 本研究的目的和意义 |
| 1.6.2 本研究的主要内容与技术路线 |
| 2 实验一蒙古马血液生化、免疫和抗氧化指标的检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血液样品的采集与处理 |
| 2.2.2 血清不同指标的测定方法 |
| 2.2.3 数据处理及分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 蒙古马与纯血马血清生化指标测定结果 |
| 2.3.2 蒙古马与纯血马血清免疫指标测定结果 |
| 2.3.3 蒙古马与纯血马血清抗氧化指标测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 蒙古马与纯血马血清生化指标比较 |
| 2.4.2 蒙古马与纯血马血清免疫指标比较 |
| 2.4.3 蒙古马与纯血马血清抗氧化指标比较 |
| 3 实验二蒙古马 TLR2、TLR4 基因多态性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 血液基因组 DNA 的提取及检测 |
| 3.2.2 PCR 反应体系及过程 |
| 3.2.3 TLR2 基因和 TLR4 基因多态性检测方法 |
| 3.2.4 不同基因型的克隆与测序 |
| 3.2.5 数据处理及分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 血液基因组 DNA 提取结果 |
| 3.3.2 TLR2 基因多态性结果 |
| 3.3.3 TLR4 基因多态性结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 TLR2 基因多态性分析 |
| 3.4.2 TLR4 基因多态性分析 |
| 4 实验三蒙古马不同组织 TLRs mRNA 转录水平研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物及其组织样品 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 组织样品总 RNA 的提取 |
| 4.2.2 RT-qPCR 反应 |
| 4.2.3 标准品的制备及标准曲线的制作 |
| 4.2.4 数据处理及分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 组织样品总 RNA 的提取结果 |
| 4.3.2 TLRs 基因 PCR 扩增结果 |
| 4.3.3 标准曲线的绘制 |
| 4.3.4 蒙古马与纯血马 TLRs 基因的组织差异表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 实时荧光定量 PCR 结果的评估 |
| 4.4.2 TLRs mRNA 转录水平的分析 |
| 5 实验四 LPS 诱导蒙古马单核细胞免疫相关基因的表达 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要仪器和设备 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 实验步骤 |
| 5.2.1 外周血单个核细胞的分离 |
| 5.2.2 单核细胞的分离和培养 |
| 5.2.3 细胞上清液中细胞因子的检测 |
| 5.2.4 单核细胞的鉴定 |
| 5.2.5 单核细胞总 RNA 提取 |
| 5.2.6 RT-qPCR 反应 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 单核细胞的形态特征 |
| 5.3.2 单核细胞总 RNA 的提取结果 |
| 5.3.3 TLRs 基因 PCR 扩增结果 |
| 5.3.4 标准曲线的绘制 |
| 5.3.5 LPS 刺激对蒙古马与纯血马单核细胞中免疫相关基因表达量的影响 |
| 5.3.6 细胞上清液中细胞因子的检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 6 实验五蒙古马-脾脏与纯血马-脾脏差异表达基因的筛选 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 主要仪器和设备 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.2 实验步骤 |
| 6.2.1 总 RNA 提取和检测 |
| 6.2.2 测序文库制备 |
| 6.2.3 文库测序 |
| 6.2.4 基因表达谱数据可靠性验证 |
| 6.2.5 数据处理及分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 测序文库建立 |
| 6.3.2 测序数据处理和分析结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 RNA 测序质量分析 |
| 6.4.2 Reads 染色体定位 |
| 6.4.3 基因差异表达分析 |
| 6.4.4 差异表达基因 GO 富集分析 |
| 6.4.5 差异表达基因 KEGG 富集分析 |
| 7 全文总体结论、创新点及进一步研究的问题 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 进一步研究的问题 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（6）鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19诱导RAW264.7细胞内毒素耐受的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 CLP-19 诱导 RAW264.7 细胞内毒素耐受的时间效应和剂量效应研究 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CLP-19 诱导 RAW264.7 细胞内毒素耐受的分子机制研究 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 内毒素耐受研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间论文情况 |
| 致谢 |
（7）Toll样受体2,4与人牙龈上皮细胞内毒素耐受的关系初探（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人牙龈上皮细胞的分离培养 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 HGECs内毒素耐受模型的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 内毒素耐受对HGECs表达TLR2,4的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 已发表论文扫描件 |
| 致谢 |
（8）Twist-2在Kupffer细胞内毒素耐受形成机制的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 摘要 ABSTRACT 前言 参考文献 第一部分 |
| Twist-2 |
| 在内毒素耐受小鼠肝组织中表达变化及意义的研究 材料与方法 结果 讨论 小结 参考文献 第二部分 |
| Twist-2 |
| 在内毒素耐受Kupffer |
| 细胞中的表达变化及意义 材料与方法 结果 讨论 小结 参考文献 第三部分 |
| Twist-2 |
| 特异性RNA |
| 干扰对Kupffer |
| 细胞内毒素耐受性的影响 材料与方法 结果 讨论 小结 参考文献 全文总结 附图 文献综述一 |
| 泛素化在TRAF2 |
| 介导的NF-κB |
| 信号通路中的作用 参考文献 文献综述二 |
| TOLL |
| 样受体4 |
| 在肝脏缺血再灌注损伤中的作用 参考文献 致谢 攻读博士学位期间发表的学术论文 攻读博士学位期间负责和参与的科研课题 |
（9）SOCS-1和SOCS-3蛋白表达对Galn/LPS诱导急性肝损伤发生的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写和中英文对照 |
| 前言 |
| 实验一 内毒素耐受对Galn/LPS诱导的小鼠急性肝损伤发生的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 验二 内毒素耐受对LPS介导的肝脏信号转导的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（10）多次小剂量LPS处理减轻慢性肝损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 多次小剂量LPS处理对CCl_4诱导的慢性肝损伤的影响及机制研究 |
| 实验一 多次小剂量LPS处理对CCl_4诱导的慢性肝损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 TLR4在多次小剂量LPS处理减轻CCl_4诱导的慢性肝损伤中的作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 实验三 在多次小剂量LPS处理减轻CCl_4诱导的慢性肝损伤中p38MAPK的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验四 在多次小剂量LPS处理减轻CCl_4诱导的慢性肝损伤中NF-κB与IκB的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验五 在多次小剂量LPS处理减轻CCl_4诱导的慢性肝损伤中IRAK-M的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 多次小剂量LPS处理对非酒精性脂肪性肝炎的影响及其机制研究 |
| 实验六 多次小剂量LPS处理对高糖高脂诱导的非酒精性脂肪性肝炎的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验七 多次小剂量LPS处理对胰岛素抵抗和胰岛β细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩写和中英文对照 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、巨噬细胞内毒素耐受时TLR4/MD-2的基因表达调节作用（论文参考文献）
- [1]lsgB基因介导的脂寡糖α2，3-唾液酸化在副猪革拉瑟氏菌致病中的作用及机制研究[D]. 王欢. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]PKM2四聚体调控巨噬细胞内毒素耐受的机制研究[D]. 易竹君. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]脂多糖诱导Kupffer细胞激活、焦亡及耐受机制研究进展[J]. 谭定勇,秦凡博,程瑶,龚建平. 重庆医学, 2019(15)
- [4]内毒素耐受及相关机制探讨[J]. 杨虎,李运璧. 实用医院临床杂志, 2013(05)
- [5]蒙古马免疫相关基因表达研究及脾脏表达谱分析[D]. 赵一萍. 内蒙古农业大学, 2013(10)
- [6]鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19诱导RAW264.7细胞内毒素耐受的实验研究[D]. 杨雅. 第三军医大学, 2013(02)
- [7]Toll样受体2,4与人牙龈上皮细胞内毒素耐受的关系初探[D]. 李慧. 南京医科大学, 2012(07)
- [8]Twist-2在Kupffer细胞内毒素耐受形成机制的实验研究[D]. 游海波. 重庆医科大学, 2011(11)
- [9]SOCS-1和SOCS-3蛋白表达对Galn/LPS诱导急性肝损伤发生的影响[D]. 袁硕. 山西医科大学, 2011(08)
- [10]多次小剂量LPS处理减轻慢性肝损伤的机制研究[D]. 郭建红. 山西医科大学, 2010(12)