一、表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用（论文文献综述）
徐明[1]（2020）在《SPOCK1/SIX1信号轴调控乳腺癌演进的机制研究》文中认为研究背景:乳腺癌是世界女性患者中诊断率最高、最致命的妇科恶性肿瘤,由于其发病率的居高不下而广受关注。尽管针对原发性乳腺癌的治疗已取得重大进展,但现阶段还没有治愈以及预防乳腺癌发生浸润及远处转移的方法。研究数据表明:乳腺癌一旦发生转移,患者的5年生存率仅能达到26%,乳腺癌远处转移是影响患者生存预后最主要的因素,也是患者临床治疗的根本挑战。癌症的侵袭、转移过程涉及到多种基因和细胞内信号传导通路的参与,是多阶段、复杂的生物学过程,也是科研工作者急需攻克的重点、难点。因此,深入研究并阐明乳腺癌细胞增殖、转移的分子机制,寻找新的、特异性高、针对性强的诊断和治疗靶点,为乳腺癌患者的临床治疗提供新的治疗策略,为进一步提高乳腺癌患者的预后提供理论依据。睾丸蛋白聚糖1（SPOCK1）属于多域睾丸蛋白多糖家族,该蛋白家族包括:SPARC、睾丸素-2和睾丸素-3,与细胞增殖和转移有关。SPARC蛋白已在多种癌症中被报道,参与细胞增殖、血管生成、凋亡和上皮细胞向间质转化等过程。近年来,越来越多的学者开始关注SPOCK1是否也在肿瘤发生、发展过程中发挥作用。有研究报道,SPOCK1与肿瘤的远处转移有关,可激活Wnt/β-catenin、mTOR-S6K和NF-κB等信号通路,并参与了肿瘤的增殖、凋亡和转移的过程,证实了 SPOCK1可作为一个新的促癌因子参与调控癌症的发生、发展。另有研究显示,SPOCK1在乳腺癌组织中呈异常高表达,且与其不良预后显着相关,但并未阐明其在乳腺癌进展过程中具体发挥的作用及调控机制。因此,明确SPOCK1诱导乳腺癌演进的潜在机制和功能,为提高乳腺癌患者的预后提供理论基础。同源盒基因1（SIX1）在多种肿瘤细胞中高表达,如肝癌、乳腺癌、结肠癌等,且可提示患者的临床不良预后。已有研究证实,SIX1作为转录因子参与上皮-间质转化的过程,促进肿瘤细胞的侵袭及浸润。然而,SIX1与SPOCK1在乳腺癌演进的机制中是否存在相互作用关系尚不清楚。研究目的:旨在明确SPOCK1、SIX1对乳腺癌演进的影响,并阐明其发挥作用潜在的分子机制:1.评估SPOCK1、SIX1在乳腺癌患者早期诊断和临床预后中的作用及应用价值;2.揭示SPOCK1在乳腺癌细胞周期、增殖、转移及上皮-间质转化过程中发挥的作用及潜在的调控机制;3.探究SPOCK1参与调控的下游靶基因,进一步阐释其参与乳腺癌演进的潜在分子机制。研究方法:1.乳腺癌数据库数据及组织标本染色分析:1)通过Oncomine、HPA（The Human Protein Atlas）和Ualcan数据库检索分析乳腺癌组织中SPOCK1和SIX1的表达情况;2)应用免疫组织化学法评估SPOCK1蛋白在80例人乳腺癌组织切片中的表达情况及其高表达与患者临床病理学参数之间的关系;3)通过Kaplan Meier-plotter和SurvExpress数据库绘制患者生存分析曲线图,分析乳腺癌患者高表达SPOCK1或SIX1在其预后评估中的潜在作用。2.体外实验:1)Western blot实验检测SPOCK1在不同乳腺癌细胞系中的蛋白表达情况;2)选择SPOCK1表达相对较高的MCF7和SKBR3和相对较低的MDA-MB-231和HS 578T细胞系分别构建SPOCK1慢病毒沉默及高表达细胞株;3)通过噻唑蓝实验（MTT）、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（EdU）增殖实验、平板克隆和流式细胞术等实验检测SPOCK1对乳腺癌细胞周期及增殖的影响,同时通过Western blot实验检测细胞增殖及周期相关蛋白的变化;4)应用细胞划痕、侵袭和浸润实验检测差异表达SPOCK1对乳腺癌细胞侵袭、转移能力的影响,同时通过Western blot技术检测EMT相关标志蛋白的变化情况;5)应用UCSC Xena和 GEPIA2（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2）数据库检索,分析SPOCK1与EMT相关标志物的作用关系,随后,采用免疫荧光和Western blot实验进行验证;6)采用Western blot方法评估差异表达SPOCK1对AKT/mTOR通路相关蛋白表达的影响;7)加入PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂Rapamycin后检测由SPOCK1高表达诱导的细胞增殖、转移及EMT的改变;8)免疫荧光细胞共定位及免疫共沉淀实验验证SPOCK1与SIX1的相互作用关系;9)利用小干扰RNA敲减SIX1蛋白的表达,检测其对SPOCK1高表达诱导的细胞周期、增殖、转移及EMT过程的影响。3.体内实验:1)在裸鼠的乳腺脂肪垫内接种慢病毒差异表达SPOCK1的乳腺癌细胞,比较移植瘤的形成情况;2)裸鼠尾静脉内注射慢病毒差异表达SPOCK1的乳腺癌细胞,建立肺转移瘤模型,比较裸鼠肺转移灶形成的情况,进一步通过苏木素-伊红染色进行确认;3)采用免疫组织化学法对裸鼠瘤体组织切片进行染色,比较差异表达SPOCK1时瘤体组织Ki67及EMT标志蛋白E-cadherin和Vimentin的表达变化。结果:1.SPOCK1在乳腺癌中异常高表达,且与患者预后不良相关:SPOCK1在乳腺癌组织中表达的阳性率及强阳性率分别为93.8%和72.5%,显着高于正常乳腺组织（30%,10%）（P<0.001）,且与患者的组织学分化程度和淋巴转移情况相关。SPOCK1高表达的患者较低表达患者的预后风险高且伴随较短的生存期;2.SPOCK1高表达促进乳腺癌增殖及细胞周期进程:高表达SPOCK1可以促进乳腺癌细胞的增殖及克隆形成能力,加快细胞周期进程,并可以促进裸鼠原位移植瘤的生长,而沉默SPOCK1则相反;3.SPOCK1可通过EMT途径促进乳腺癌转移:SPOCK1高表达可提高乳腺癌细胞能动性,促进其迁移、侵袭及浸润能力,加快EMT进程,增加裸鼠乳腺癌细胞肺转移,而沉默SPCOK1时则结果相反;4.SPOCK1通过激活AKT/mTOR信号通路诱导乳腺癌恶性进展:SPOCK1的致癌活性与AKT/mTOR信号通路的活化紧密相关。在加入PI3K和mTOR抑制剂后则逆转由SPOCK1诱导的乳腺癌细胞增殖、转移及EMT进程;5.SIX1在乳腺癌中呈高表达,且与SPOCK1具有相互作用:SIX1在乳腺癌组织中高表达且与患者不良预后有关。差异表达SPOCK1后SIX1的表达也随之改变,进一步免疫共沉淀实验证实二者确实存在相互作用关系;6.SPOCK1/SIX1信号轴通过激活AKT/mTOR信号通路调节乳腺癌演进:敲低SIX1的表达后可显着逆转由高表达SPOCK1诱导的乳腺癌细胞增殖、转移及EMT进程。结论:1.SPOCK1和SIX1在乳腺癌中均呈高表达,并提示患者不良预后;2.SPOCK1高表达可加快细胞周期进程、促进细胞增殖、并可通过EMT途径增强乳腺癌细胞的转移;3.SPOCK1/SIX1信号轴通过活化AKT/mTOR信号通路调控乳腺癌的演进;4.SIX1基因的表达缺失可逆转SPOCK1对乳腺癌恶性行为的促进作用。
颜晨[2]（2016）在《人类乳腺癌与病毒感染相关性以及基因治疗靶点的研究》文中提出乳腺癌已经成为全球范围女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年增高,数据显示,在美国女性中2014年新增癌症病例数中乳腺癌占比达到29%。我国近年来乳腺癌发病率正以每年3%的速度递增,在所有癌症中乳腺癌的发病率位居第一,成为城市中死亡率增长最快的癌症。乳腺癌的发病原因复杂,至今尚不能用已知的单因素或多因素模型来完全解释其发生原因与发展过程。流行病学研究认为乳腺癌的发生与生活环境、生活方式,膳食结构,内分泌等因素有关。近年来,对病毒感染与乳腺癌病因关系的研究成为研究的热点。1995年国际癌症组织发布高风险的人乳头瘤病毒（Human papillomavirus简称HPV）16型和18型具有导致人类癌症的作用,有研究证实HPV的E6和E7基因导入乳腺导管上皮细胞导致细胞永生化或癌变。由于HPV亚型众多,不同的亚型致病力不同,以及检测方法、标本类型、人群地域分布等差异致使文献报道检测结果阳性率的差异,使HPV感染与乳腺癌发生的相关性存在着争议。小鼠乳腺肿瘤病毒（Mouse mammary tumor virus简称MMTV）是一种p逆转录病毒,含有9kb的RNA基因组,其中包含GAG基因、POL基因以及编码病毒进入宿主细胞时需要的包膜蛋白的ENV基因。研究证实90%以上的小鼠乳腺肿瘤与MMTV相关。Indik等学者发现MMTV可感染人类乳腺癌细胞系,这一研究证实了MMTV跨物种传播的可能性。但是,至今没有MMTV感染人类乳腺细胞致瘤的直接证据,更没有以HPVE6和E7病毒基因为靶点的特异性基因治疗的先例。明确病毒基因在乳腺癌组织中的存在以及表达状况,探索以病毒基因为靶点的乳腺癌基因治疗和疫苗研究的新策略,对于预防乳腺癌的发生降低乳腺癌的死亡率具有重要的意义。本研究分为两部分：第一部分是对乳腺癌石蜡包埋组织标本以及乳腺癌细胞系SKBR3进行了人乳头瘤病毒即HPV和小鼠乳腺肿瘤病毒即MMTV的基因筛查；第二部分在筛查结果的基础上应用RNA干扰技术沉默HPV致癌基因,探索以病毒基因为靶点对乳腺癌细胞株的抑制作用。第一部分乳腺癌细胞中人乳头瘤病毒和小鼠乳腺肿瘤病毒基因的筛查收集76例病理学确诊的乳腺癌石蜡包埋组织提取DNA,以乳腺癌细胞系SKBR3为对照,分别设计合成HPV L1、HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18 E6、HPV18 E7以及MMTV-ENV基因的引物,聚合酶链式反应（PCR）扩增基因片段。在76例乳腺癌石蜡包埋组织样本中,HPV16型E6、E7皆为阴性。HPV L1阳性7例（9.21%）。HPV18 E6阳性5例（6.58%）,HPV18 E7阳性18例（23.68%）,在SKBR3细胞系中HPV16E6、E7均为阴性,HPV18E6、E7为阳性,并有HPV18E6、E7的基因表达。对照样本的临床病理资料显示HPV18E6和E7在乳腺癌细胞基因的检出率与年龄无关,而与乳腺癌分级以及乳腺细胞的分化程度有关；在19例HPV18E6、E7阳性的患者中均为浸润性导管癌,随着浸润程度级别的增加,HPV18E6、E7的检出率增加。其中6例为低分化的乳腺细胞癌。小鼠乳腺肿瘤病毒基因的筛查阳性23例,阳性率为30.26%。这项研究为人乳头瘤病毒感染与乳腺癌的发生存在相关性提供了依据,为探索以病毒基因为靶点的乳腺癌基因治疗和疫苗研究的新策略提供依据,从HPV18E6、E7基因在不同类型乳腺癌中的检出率可以预测以病毒基因为靶点的基因治疗对不同类型乳腺癌的有效性,为临床的应用提供了依据。第二部分探索以病毒基因为靶点对乳腺癌细胞株抑制作用的研究在第一部分研究结果的基础上,以HPV18E6 E7为靶点应用bioinformatics& research computing提供的在线siRNA设计工具设计合成siRNA,构建入pSUPER RNAi System,筛选出最优的siRNA,检测以HPV18 E6、E7为靶点的RNA干扰对乳腺癌细胞的生长活力、克隆形成能力、侵袭能力、细胞周期以及细胞周期调控基因的表达情况分析对乳腺癌细胞的抑制作用。细胞生长活力的检测试验显示,与对照组相比48h时针对HPV18 E6、E7的RNA干扰组抑制率分别是12%和9%（差异显着,P<0.05）。克隆形成试验结果显示,与对照组相比针对HPV18E6 E7的RNA干扰组抑制率分别是61%和64%（差异显着,P<0.01）。细胞侵袭试验显示,与对照组相比针对HPV18 E6、E7的RNA干扰组抑制率分别是59%和65%（差异显着,P<0.01）；应用流式试验测定细胞周期变化,与对照组相比HPV18 E6E7的RNA干扰组的S%降低65%和80%（差异显着,P<0.01）,GO/G1升高26%和35%（差异显着,P<0.01）,G2/M降低50%和72%（差异显着,P<0.01）；应用荧光定量PCR测定细胞株中HPV18 E6、 E7靶基因以及细胞周期调控基因的表达差异,与对照组相比,HPV18 E6的RNA干扰组对E6的抑制率为35%,HPV18 E7的RNA干扰组对E7的抑制率为78%,与对照组相比HPV18 E6、E7的RNA干扰组的TP53-mutant表达降低55%和39%, MDM2表达降低63%和36%, CCNA1表达降低7%和15%, CCND1表达降低18%和23%,BCL-2表达降低39%和77%,RB表达增高94%和109%, VEGFA表达没有发生明显变化。以HPV18E6 E7为靶点的RNA干扰对乳腺癌细胞的抑制作用明显,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶点。
流小舟[3]（2016）在《Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景作为一种恶性的成骨性肿瘤,骨肉瘤的主要来源是骨组织,通常其多见于骨生长活跃的年轻人当中,由于其恶性程度高,侵犯范围较大,而且容易发生早期肺部的转移,因此往往治愈难度大,过去单一治疗效果不够理想,五年内存活率不足两成,尽管有关新辅助化疗以及保肢手术的探究日益深化,愈来愈多的骨肉瘤病患能够保留自身的肢体,延续自己的生命年限。但是在诊断方面,到目前仍然没有可识别性标志物,在骨肉瘤分化比较差的时候仅仅通过观察形态来作出诊断,因此病理判断的精确性不够。同时肿瘤的复发和转移等恶性生物学行为仍然是很大程度上影响着患者的预后、导致骨肉瘤患者生存率不理想,进而导致骨肉瘤患者治疗失败的主要因素。目前相关的基础研究对骨肉瘤病因及转移发展机制仍未有重要的突破,在临床上也没有新的药物和新的治疗模式产生,因此寻找新的研究突破点、探讨人骨肉瘤的侵袭和转移机制显得至关重要。既往针对肿瘤细胞的杀伤主要包括化疗和放疗介导的细胞凋亡,而这正是由肿瘤细胞可以抑制自身凋亡、促进自身存活力增强的共同特征所决定的。正常细胞的凋亡机制受到抑制导致肿瘤的发生,而肿瘤细胞的凋亡机制紊乱导致肿瘤的不断增殖是困扰和限制临床治疗及肿瘤基础学研究进一步发展的核心问题。究其根本,包括IAPs家族在内的多种凋亡抑制基因参与其中、相互协调作用是该问题的关键。IAPs家族负责编码一组结构相似、功能相关的蛋白,这一家族的大多数成员可以借助直观层面的联合与阻止特定的Caspase来抑制细胞凋亡,是调控启动Caspase和效应Caspase的唯一内源性蛋白。迄今为止,在人体新发现的IAPs家族有8个成员,即NAIP、XIAP（ILP-1/MIHA）、cIAP-1（HIAP-2/MIHB）、Survivin（TIAP）、Apollon（Bruce）、cIAP-2（HIAP-1/MI-HC）、ILP-2（Ts-IAP）与Livin（ML-IAP/KIAP）。其中Survivin是近几年发现的一个IAPs家族中的成员,因其在正常人体的组织内均无明显表达,而在恶性肿瘤组织中呈特异性高表达,因此将Survivin作为连接细胞凋亡和细胞周期的纽带,同时作为促进骨肉瘤细胞凋亡、治疗骨肉瘤组织生长的针对性靶点是我们未来研究骨肉瘤靶向疗法的潜在性突破口和该领域研究的热点。Survivin基因由Ambrosini等借助ECPR1内的cDNA自人类基因库内选取,该基因全长15kb,其位置在17q25染色体上,存在的外显子数量是4个,内含子的数量是3个,在进行一定的编码程序以后,就会产生内含142个氨基酸的Survivin蛋白,有别于IAP家族的其他成员,截止到目前,Survivin不仅是家族中最新发现,也是分子量最低的凋亡抑制蛋白。因此其在功能上也一定程度的有别于IAP家族的其他成员,即:干预细胞凋亡的同时也参与细胞有丝分裂及其他细胞阶段性的周期变化,还在肿瘤滋养血管出现和转移性生长进入其它器官的过程中发挥作用:（1）遏制细胞凋亡的功效:①Survivin借助BIR功能区的妨碍凋亡相关的氨基酸残基Trp67、Pro33和Cys84直接作用于Caspase-3、Caspase-7,在干扰他们活力的同时可以进一步起到干扰凋亡的作用。②Survivin借助和细胞附件控制因子CDK4产生Survivin-CDK4,这种混合产物可以使P21自CDK4内能够被释放出来,而P21可以和Caspase-3发生关联,进而能够对Caspase产生一定的约束性,防止细胞出现凋敝的情况。③近几年研究指出,Survivin是周期蛋白激酶p34cdc-cyclinBl在有丝分裂阶段中形成的底物,磷酸化Survivin Thr34之后可以再和Caspase-9发生关联,防止依赖于Caspase-9发挥作用的相关细胞凋亡因子的转导传输。（2）调节细胞周期的功效:Survivin与CDK4结合后,竞争性地抑制CDK4/p16（INK4a）复合物的形成,活化CDK2/cyclin E,磷酸化Rb,从而加快G1期向S期的转换。在G2/M期特异性表达,Survivin因其羧基末端无RING锌指结构,代之以一个长度为6.5nm、由40个氨基酸组成的α螺旋结构,在有丝分裂的初期,Survivin借助这一架构和有丝分裂纺锤体内存在的microtubule结构发生特定可饱和作用,加速有丝分裂、促进恶性肿瘤细胞繁殖的同时避免因先天遗传或后天突变引起的细胞自然或非自然死亡。（3）参与血管形成的功效:VEGF在肿瘤组织中可以导致肿瘤滋养血管的生成,而Survivin在该过程中具有保障血管内皮组织与新生血管出现的关键价值。0’ Connor等指出血管内皮细胞中的Survivin可以在VEGF与bFGF的介导下较呈现高表达状态。Tran等分析认为,在稳定细小血管网架构、保障血管内皮细胞性能、使肿瘤血管内皮细胞产生化疗药物耐药性等方面,Survivin均发挥了一定的作用。Coma等制备了针对Survivin的反义寡核苷酸,在沉默Survivin的表达后发现由TNF介导的VEGF的抗凋亡活性降低,而Survivin的表达与VEGF的表达又呈正相关,提示二者在骨肉瘤的血管生成过程中发挥协同作用。由此可见,肿瘤尤其是骨肉瘤的发生、发展及转移的确是一个十分复杂的过程,目前骨肉瘤发生及转移原因尚未得到阐明。细胞凋亡作为一种高度保守的细胞死亡机制,又被称为程序性细胞死亡,其具有组织、生化和形态学方面特性。由于肿瘤的生长和发展取决于肿瘤细胞的增殖率与凋亡率之间的平衡,这种平衡一旦打破,一方面,那些在生理状态下需要及依赖于凋亡程序发挥作用的组织内环境稳定性及胚胎细胞发育过程会发生紊乱。而另一方面,干扰细胞的凋亡又能够导致细胞存活时间很大程度延长,基因突变体的聚积从而诱发肿瘤的形成、促进肿瘤转移、增强肿瘤化疗耐药性。因此伴随着肿瘤分子遗传学、分子生物学,特别是靶向肿瘤分子学的进步,找到细胞凋亡机制中作用于骨肉瘤的发生、发展、侵袭、转移全过程的有效靶点是现今从事骨肉瘤研究的学者们迫切希望解决的重中之重。从当前的研究我们能够看出,骨肉瘤组织里的Survivin基因的异常表达有可能促使肿瘤细胞脱离生长监控的范围,克制肿瘤细胞的凋亡。有学者提出,Survivin在骨肉瘤组织中的表达水平不仅明显高于骨良性肿瘤,而且骨肉瘤的恶性程度越高、分化等级越差,Survivin在其中的表达就越高。随着骨肉瘤的形成和转移,Survivin在肿瘤组织中的表达水平会出现明显的提升,说明Survivin与骨肉瘤的肿瘤表观形态和恶性生物学行为有关。还有的研究利用Cox多变量回归模型展开剖析,对骨肉瘤病患的Survivin表达程度配合化疗前化疗敏感性的预期展开预估,最终得出Survivin蛋白表达的上调同骨肉瘤组织发生发展密切相关,且Survivin可以作为骨肉瘤诊断和判断预后的一个标志物。Survivin在骨肉瘤组织中的表达水平不仅明显高于骨良性肿瘤,而且骨肉瘤的恶性程度越高、分化等级越差,Survivin在其中的表达就越高。随着骨肉瘤的形成和转移,Survivin在肿瘤组织中的表达水平会出现明显的提升,说明Survivin与骨肉瘤的肿瘤表观形态和恶性生物学行为有关。因为凋亡遏制蛋白Survivin于肿瘤组织中选择性的高表达,我们可以这样进行假设:抑制Survivin有可能导致骨肉瘤细胞的自发性凋亡,我们在既往的实验中证实了在骨肉瘤细胞系U20S、SAOS及MG63中,Survivin的表达明显增加,这在我们后续对比骨肉瘤组织和正常组织中Survivin表达的实验中也得到证实。我们还发现采用Survivin反义寡核苷酸技术可以降低Survivin在骨肉瘤细胞中的表达,显着抑制骨肉瘤细胞增殖并呈现出浓度依赖性,从而诱导骨肉瘤中的细胞凋亡。根据以往研究结果,我们进一步提出假设:是否存在着一种下游信号传导通路元件,Survivin可以通过它产生对骨肉瘤细胞的体外作用;而在体内环境中,抑制Survivin又能否影响骨肉瘤瘤体的生长。肿瘤的转移囊括了肿瘤细胞于间质里移动并且接触脉管、肿瘤细胞突破血管内皮还有内皮下的基底膜展开血流,而且在血液里存活、肿瘤细胞穿出血管,于组织里生长、增殖,产生转移灶。因此我们能够看到,肿瘤的转移和细胞之间、细胞同细胞之外基质二者之间的的粘附作用存在一定关系。但是此类相互辨别以及作用是需要CAMs在其中发挥其介导作用的。整个CAMs家族里的一个关键元素即整合素,它是利用非共价键将α以及β两种亚单位链接所组成的的异二聚体分子。根据该家族中当前所发现的二十五个α亚单位以及十一个β亚单位,可以一起构成不下数十种不一样的整合素。这两种亚基构造有相似之处,都是通过较长的胞外段（氨基端）、跨膜段、较短的胞内段（羧基端）三部分一起组成的。α亚基凭借其胞外段能够对于ECM的RGD序列加以辨别,介导细胞与ECM二者的粘附,而β亚基的胞内段同细胞骨架构连接在一起。整合素与配体结合发挥其功能,故整合素按识别配体的不同又可分为三大类,本文所讨论的整合素α 5属于其中识别非RGD序列的整合素,其配体为基底膜蛋白,例如层黏连蛋白（LN）以及纤维连接蛋白（FN）等,而胶原蛋白正是骨组织的主要细胞外基质成分,近来人们发现骨组织中整合素的表达水平对成骨和吸收具有调控作用,提示整合素与很多骨代谢疾病甚至成骨、溶骨病变的病理机制有关。除了介导细胞与基底膜、细胞与细胞的粘附,整合素同时具有通过与其配体结合后向细胞内传递信号,进而影响基因的表达,最后影响细胞的增殖代谢、基因转导、凋亡等生物学行为的功能。有文献报道,在整合素α 5和Survivin促进骨肉瘤细胞的增殖作用过程中,Caspase-3均起到介导作用;整合素α5和Survivin有可能直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程。三者可能共同参与骨肉瘤细胞的恶性生物学行为。可见,整合素很有可能对骨肉瘤的生长、发展、侵袭、转移过程产生非常重要的影响,而这种影响是在与Survivin相互协调、相互作用中完成的。当前针对Survivin的敲低或敲除实验为骨肉瘤靶向基因治疗提供了理论依据和方向。而相对于反义寡核苷酸技术来说,RNA干扰技术（RNAi）具有转染效率高、转染效果稳定、特异性强、浓度依赖性好、潜在毒性弱、作用时间充分、维持时间较长、实验准备及操作简便的优点。该项技术是由Fire于1998年首先在研究秀丽新小杆线虫（C.elegans）反义RNA的过程中发现并证实是一种由dsRNA介导的同源RNA降解过程,已逐渐成为公认的实验技术和治疗手段。其原理是在生物体细胞内,利用具备同源性的dsRNA诱使序列特异的特定基因的沉默,快速的防止目标基因活性。siRNA就是RNAi途径中间的产物,或者说也是RNAi发挥作用的必不可少的因素,现如今应用在现实治疗过程中的siRNA类型基本上有两种:体外形成的RNA干涉片段以及DNA干涉载体。由于前者转染效率还存在RNAi功效的瞬时性程度不够,现在大多数应用DNA载体于细胞里表达siRNA相关技术。杨彤涛等对于Survivin基因的RNA干涉特异性片段进行合成,利用骨肉瘤细胞体外生长还有体内移植成瘤试验,证明Survivin的特异性siRNA能够大大促进骨肉瘤细胞自行凋亡的过程。能够看出在有关骨肉瘤的实验性治疗过程里,RNAi能够对于癌基因的表达加以遏制、对于突变激活的癌基因进行清除、克制基因扩增的同时,还能够克制融合基因表达、克制其他肿瘤有关基因的表达。Zou等利用干扰RNA技术并且应用依泊托苷、阿霉素等有关的化疗药物,能够很明显的克制MG63细胞的产生,提升化疗的敏感程度,实验的结果显示出关于Survivin的干扰RNA技术能够提升化疗的效果,进而降低所使用化疗药物的数量,降低因药物所产生不良反应的发生,实现对骨肉瘤细胞生长的有效抑制,显示出抑制Survivin基因联合化疗治疗骨肉瘤的优越性。综上所述,我们拟进行对Survivin及整合素α 5与骨肉瘤恶性行为特性的关系的研究,评价针对Survivin的干扰RNA技术治疗后骨肉瘤细胞内整合素α 5表达的变化情况;分析Survivin与整合素α 5的上下游调控关系,观察上述治疗手段对骨肉瘤组织体内生长的影响,明确Survivin能否通过整合素α 5产生对骨肉瘤细胞的体外、体内作用,使Survivin-SiRNA及整合素α5特异性抗体成为骨肉瘤靶向治疗的新手段。第一章:针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株的制备及体外验证研究目的:制备针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株,对比分析转染后Survivin在骨肉瘤细胞中的含量,以验证转染效果。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）和空白对照组（空脂质体转染）,再采用Western blot技术检测三组MG63细胞转染后Survivin蛋白的含量,并进行比较。结果:Western blot检测得出的结果显示出MG63细胞裂解液里具备特异性的Survivin蛋白条带。Survivin-SiRNA能降低MG63细胞内Survivin蛋白的表达,Survivin-SiRNA转染骨肉瘤细胞系MG63后Survivin蛋白的含量相比较于阴性对照组和空白对照组中细胞内Survivin蛋白的含量均是下降的。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着降低了骨肉瘤MG63细胞中Survivin蛋白的含量,进一步证实了 Survivin-SiRNA可以成功抑制Survivin的表达。该转染细胞株的制备为的后续体外细胞学及体内组织学实验积累了相关经验,奠定了理论基础。第二章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响目的:探讨Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭能力、迁移能力的影响。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,再采用Transwell实验及细胞划痕实验检测两组MG63细胞转染后的侵袭和迁移能力,并进行比较。结果:Transwell实验结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞与阴性对照组相比,侵袭细胞数显着减少（P<0.01）。而细胞划痕实验结果也显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞在48h内的划痕区域中细胞迁移率较阴性对照组明显下降（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力。进一步证实了抑制Survivin的表达可以影响骨肉瘤细胞的发生发展,提示Survivin不仅与骨肉瘤原位生长密切相关,而且可能参与了骨肉瘤远处转移的过程。第三章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞中整合素α 5表达水平的影响目的:探讨Survivin-SiRNA对骨肉瘤中整合素α5表达水平的影响,验证整合素α 5是否为Survivin的下游信号传导通路元件。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,再采用免疫染色法,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测两组MG63细胞转染后的整合素α 5表达水平,并进行比较。结果:通过流式细胞术和荧光显微镜进行观察,结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞与阴性对照组相比,整合素α 5的表达水平受到显着抑制（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞中整合素α 5的表达水平。进一步证实了针对性抑制Survivin的表达可以下调骨肉瘤细胞中整合素α 5的表达,这说明Survivin可能是整合素α 5的一种上游调节剂,Survivin可以通过它产生对骨肉瘤细胞的体外作用。第四章:靶向治疗整合素α 5对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响目的:制备针对骨肉瘤MG63细胞系的整合素α5-SiRNA转染细胞株,在验证转染效果后探讨整合素α 5-SiRNA以及靶向抗整合素α 5抗体对骨肉瘤MG63细胞侵袭能力、迁移能力的影响。方法:设计合成特异性靶向整合素α5的整合素α5-SiRNA对MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scrαmble RNA转染）,采用免疫染色法,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测两组MG63细胞转染后的整合素α 5表达水平以验证转染效果,之后利用Transwell实验及细胞划痕实验检测两组MG63细胞转染后的侵袭和迁移能力,并进行比较。再使用靶向抗整合素α 5抗体（M200）作用于骨肉瘤MG63细胞,通过Transwell实验及细胞划痕实验继续观察、比较靶向治疗后MG63细胞的侵袭和迁移能力。结果:Transwell实验结果显示经转染整合素α 5-SiRNA后以及抗整合素α 5抗体治疗后的骨肉瘤MG63细胞分别与阴性对照组进行比较,发现侵袭细胞数均显着减少（P<0.01）。而细胞划痕实验结果也显示抗整合素α 5抗体治疗后的骨肉瘤MG63细胞在48h内的划痕区域中细胞迁移率较阴性对照组明显下降（P<0.01）;而阴性对照组在48h内的划痕区域中细胞迁移率甚至超出转染整合素α5-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞的两倍之多（P<0.01）。结论:无论是靶向干扰RNA还是靶向抗体治疗均显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力。一方面证明了整合素α 5的表达与骨肉瘤细胞侵袭和转移的相关性。另一方面也提示靶向抑制整合素α 5的表达可以直接达到治疗效果,从而为更新骨肉瘤临床治疗方案提供了理论依据。第五章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞体内实验的影响目的:将针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株移植到裸鼠体内,建立了骨肉瘤动物模型,观察其体内生长成瘤情况。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,之后将两组细胞分别接种至裸鼠腹部的左、右两侧皮下。接种三个星期后,处死小鼠并称重肿瘤。观察肿瘤体积,计算肿瘤的平均重量,并进行比较。结果:通过肿瘤称重和肉眼观察,结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞成瘤体积和重量均较阴性对照组明显缩小和下降（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的体内生长成瘤情况。进一步证实了抑制Survivin的表达可以减缓异种移植瘤的生长,提示Survivin在骨肉瘤增殖繁衍过程中的重要作用。
白文栋[4]（2015）在《MiR-200c通过靶向ZNF217与ZEB1抑制TGF-β信号并调控乳腺癌trastuzumab耐药与转移》文中研究指明【背景】目前,乳腺癌已经成为最为主要的威胁女性生命健康的恶性疾病之一,该病防治是肿瘤研究领域的热点问题之一。人表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2）过表达于20%25%乳腺癌,患者治疗预后差,易发生转移,HER2已经成为治疗乳腺癌的重要靶点。曲妥珠单抗（trastuzumab,商品名:herceptin,赫赛汀）是靶向HER2的人源化单克隆抗体,在HER2阳性乳腺癌早期治疗及转移治疗中取得较大成功。然而,trastuzumab耐药以及由此而导致的潜在转移性增加却一直困扰临床医生。近年来,乳腺癌trastuzumab耐药与乳腺癌转移研究取得显着进步,然而,乳腺癌trastuzumab耐药与转移相关性及其具体的分子机制尚需进一步阐明。TGF-β信号在肿瘤发生发展中具有重要作用并扮演着双重角色,一方面,其在肿瘤早期发挥增殖抑制与促凋亡作用,另一方面,其在肿瘤晚期可有效诱导肿瘤细胞发生并维持上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,从而促进肿瘤侵袭与转移。此外,TGF-β信号在多种肿瘤放射与药物治疗抵抗中的作用逐渐引起重视,成为肿瘤研究领域的热点。越来越多的证据表明,TGF-β信号在肿瘤耐药与转移中具有重要作用,有望成为重要的肿瘤治疗靶点。然而,关于TGF-β信号在乳腺癌trastuzumab耐药及伴随潜在转移性增加中的作用及其自身调控机制尚不明确。Mi RNAs是一类小分子RNA,通过靶向调控蛋白质而广泛参与肿瘤发生、发展。因此,阐明mi RNA在介导TGF-β信号调控HER2阳性乳腺癌trastuzumab耐药和转移中的潜在作用及其分子机制,将为乳腺癌多重恶性表型的逆转提供新的思路,对于乳腺癌临床治疗具有重要意义。【目的】阐明mi RNA参与TGF-β信号调节并调控乳腺癌trastuzumab耐药与转移的潜在作用机制,为trastuzumab耐药或者转移乳腺癌治疗提供新的思路。【方法】通过持续加药培养野生型（wide type,WT）乳腺癌细胞的方法建立体外乳腺癌trastuzumab耐药（trastuzumab resistant,TR）细胞模型,MTT检测分析乳腺癌WT与TR乳腺癌细胞对trastuzumab药物敏感性。软琼脂克隆形成实验分析WT与TR乳腺癌细胞非锚定依赖生长能力;transwell侵袭实验分析WT与TR乳腺癌细胞侵袭能力;对WT与TR乳腺癌细胞进行形态学观察,实时定量PCR（quantitative realtime PCR,q PCR）检测EMT转录因子水平,WB检测EMT标记分子,以观察细胞诱发EMT。WB检测乳腺癌WT与TR乳腺癌细胞TGF-β信号激活状态,q PCR与ELISA检测分析TGF-β的表达。RNA干涉TGF-β受体Ⅱ（TGF-βreceptorⅡ,TGFBR2）后,MTT检测TR乳腺癌细胞trastuzumab敏感性,transwell实验检测TR乳腺癌细胞侵袭力,q PCR检测EMT相关转录因子水平变化。通过mi RNA芯片分析筛选WT与TR乳腺癌细胞中显着差异表达的mi RNAs。MTT与流式细胞术凋亡检测分析mi R-200c对乳腺癌细胞trastuzumab敏感性的影响。Traswell与划痕实验分析mi R-200c对乳腺癌细胞侵袭与迁移能力的影响。形态学观察分析与WB检测分析mi R-200c对EMT形态及标记分子的影响。WB检测分析mi R-200c对乳腺癌细胞TGF-β信号的影响,q PCR与ELISA检测分析mi R-200c对TGF-β表达的影响。裸鼠体内成瘤与肺转移实验分析mi R-200c对乳腺癌在动物体内trastuzumab耐药与转移的影响。软件预测mi R-200c靶蛋白并使用双荧光素酶报告基因、q PCR及WB等实验进行靶标验证。MTT与流式细胞术凋亡检测验证靶蛋白对trastuzumab敏感性的影响,Traswell与划痕实验验证靶蛋白对乳腺癌细胞侵袭与迁移能力的影响,形态学观察靶蛋白对EMT形态影响,WB分析靶蛋白对EMT标记分子的影响。QPCR、WB与ELISA方法分析细胞中是否存在调控乳腺癌trastuzumab耐药的mi R-200c/ZEB1与mi R-200c/ZNF217/TGF-β/ZEB1巢式环路。【结果】通过对乳腺癌细胞施加5μg/m L trastuzumab持续药物筛选约6个月,成功建立体外TR乳腺癌细胞模型。相较于WT乳腺癌细胞,MTT结果表明TR乳腺癌细胞对trastuzumab敏感性显着减低;软琼脂克隆形成实验与transwell结果表明,TR乳腺癌细胞非锚定依赖生长能力与侵袭力显着增加;形态学观察、WB检测EMT标记物、q PCR检测EMT相关转录因子结果均表明TR乳腺癌细胞发生并维持明显EMT。相较于WT乳腺癌细胞,WB结果表明,TR乳腺癌细胞TGF-β信号激活水平显着升高;q PCR与ELISA结果表明,TR乳腺癌细胞TGF-βm RNA水平与分泌水平均显着升高。Si RNA干涉TGFBR2后,MTT结果表明TR乳腺癌细胞trastuzumab敏感性显着提高,transwell结果表明TR乳腺癌细胞侵袭力显着下降,q PCR结果表明TR乳腺癌细胞中EMT相关转录因子显着下调。Mi RNA芯片结果表明mi R-200c在TR乳腺癌细胞中降低最为显着。MTT与流式细胞术凋亡检测结果表明,mi R-200c可使TR乳腺癌细胞对trastuzumab敏感性显着提高;transwell与划痕实验结果表明,mi R-200c可显着降低TR乳腺癌细胞侵袭与迁移能力;形态学观察与WB结果表明,mi R-200c可有效逆转TR乳腺癌细胞EMT;WB结果表明,mi R-200c可显着抑制TGF-β信号;q PCR与ELISA结果表明,mi R-200c可显着下调TR乳腺癌细胞中TGF-β2与TGF-β3的m RNA水平与分泌蛋白水平。裸鼠体内成瘤与尾静脉肺转移实验结果表明,mi R-200c可在体内使TR乳腺癌细胞对trastuzumab敏感性提高并抑制其转移。软件预测、双荧光素酶报告基因检测、q PCR及WB结果表明,mi R-200c直接靶向锌指蛋白ZNF217与转录因子ZEB1。Si RNA干涉ZNF217与ZEB1均可逆转TR细胞trastuzumab耐药和EMT,并降低其侵袭与迁移能力。此外,q PCR、WB及ELISA结果表明乳腺癌中mi R-200c、ZNF217、TGF-β、ZEB1共同构成mi-R200c/ZEB1与mi R-200c/ZNF217/TGF-β/ZEB1巢式调节环路。【结论】本研究发现乳腺癌诱发trastuzumab耐药的同时,伴发EMT、非锚定依赖生长能力与侵袭能力的增强等恶性表型。TGF-β信号同时在乳腺癌trastuzumab耐药细胞的耐药性、EMT及侵袭力增强等多种恶性表型的诱导与维持中具有重要作用。通过进一步研究发现,mi R-200c通过靶向ZNF217与ZEB1调控TGF-β信号,逆转乳腺癌trastuzumab耐药并同时抑制乳腺癌转移。最后,我们还发现,在乳腺癌中,mi R-200c、ZNF217、TGF-β、ZEB1共同构成mi R-200c/ZEB1与mi R-200c/ZNF217/TGF-β/ZEB1巢式调节环路。这些研究结果阐释了调控乳腺癌恶性表型诱导与维持的新机制,并为其治疗提供了新的理论依据。
黄菁草[5]（2014）在《乳腺癌和急性髓系白血病的靶向治疗》文中认为背景及目的：在约25%的浸润性乳腺癌患者中,存在erbB2基因扩增和／或过表达,这与乳腺癌患者的不良预后密切相关。ErbB3受体在erbB2阳性乳腺癌中发挥重要作用,erbB3表达量的增加可引起对trastuzumab等治疗药物耐受的发生。我们之前研究显示,在对trastuzumab耐受的乳腺癌细胞中,erbB3可以与erbB2和IGF-1受体共同形成异源三聚体,从而介导对trastuzumab的耐受。因此,本实验旨在研究人源化erbB3抗体MM-121,在体外和体内对于erbB2阳性乳腺癌细胞的抗肿瘤作用。方法：MTS测定细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,Western Blot检测处理后相关蛋白的表达量及活化状态的改变。用Trastuzumab耐受乳腺癌细胞BT474-HR20建立裸鼠皮下异位移植瘤模型,对成瘤裸鼠腹腔注射trastuzumab和/或MM-121,探寻MM-121和trastuzumab在体内的治疗作用。免疫组织化学法比较移植瘤的erbB3,erbB2,Ki67及活化型Caspase-3的表达在各个治疗组中的差异。结果：细胞增殖实验显示,在对trastuzumab敏感和耐受的乳腺癌细胞中,MM-121均显着地增强了trastuzumab介导的生长抑制。MM-121联合trastuzumab主要显着下调了磷酸化erbB3（P-erbB3）及其下游P-Akt的水平。在体外的细胞实验中,MM-121联合trastuzumab并未引起对trastuzumab耐受细胞的凋亡,而是导致了其细胞周期G1期阻滞,且伴随p27kipl的上调及E2F-1的轻微下调。有趣的是,在由trastuzumab耐受的乳腺癌细胞建立的裸鼠皮下异位移植瘤模型中,MM-121联合trastuzumab的作用明显优于任一单一处理,联合用药组显着地抑制了移植瘤的生长,且免疫组织化学结果显示Ki67的减少及活化型Caspase-3的增加与移植瘤的生长趋势相对应。以上结果显示,MM-121联合trastuzumab不仅抑制trastuzumab耐受细胞的生长,还能够在体内导致肿瘤细胞的凋亡。结论：本实验证明了MM-121联合trastuzumab在体外和体内都发挥了强有力的抗肿瘤作用。因此,MM121有望在对erbB2阳性且已经对trastuzumab产生耐受的乳腺癌患者的治疗中发挥作用。背景及目的：Survivin（由BIRC5基因编码）是哺乳动物凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins,IAP）最小的成员,具有抗凋亡和调节细胞周期的双重功能。Survivin在胚胎发育过程中表达,而在成熟分化的组织和细胞中表达很少,但在很多肿瘤细胞中存在survivin高表达的情况,survivin的高表达同肿瘤的不良预后、复发以及对治疗的耐受等密切正相关。Survivin在正常造血过程中发挥重要功能,而在很多血液系统肿瘤中均有survivin表达增高并与不良预后相关的报道。对急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）患者的研究显示,survivin的高表达与AML患者的不良预后密切相关。目前对于靶向下调survivin治疗AML的研究还很有限,靶向下调survivin后AML对化疗药物的反应也还不清楚。本文希望通过应用shRNA沉默survivin在AML细胞中的表达,研究survivin对于AML细胞的作用及其对化疗药物敏感性的影响,同时研究survivin的小分子抑制剂YM155作为单药以及联合其他化疗药物对于AML的治疗作用。希望通过该研究为临床对AML进行survivin靶向治疗提供理论依据。方法：半定量PCR和实时荧光定量PCR检测AML细胞系中survivin mRNA表达水平；VVestern blot检测AML细胞survivin蛋白表达水平,以及对细胞进行处理后相关蛋白表达量或活化水平的改变；细胞死亡相关酶联免疫吸附反应定量检测处理后细胞死亡情况；流式细胞术检测AML细胞在survivin特异性沉默后或YM155处理后细胞周期改变；细胞增殖实验（MTS）用于检测survivin特异性沉默后细胞的增殖速度,以及化疗药物、YM155单独或联合使用时对AML细胞增殖能力的影响。结果：在所检测的AML细胞系中,Kasumi-1和HL-60细胞survivin表达量最高。利用survivin特异的shRNA沉默Kasumi-1和HL-60细胞中survivin的表达后：细胞增殖实验显示细胞增殖受抑制；流式细胞术分析发现细胞周期G2/M期阻滞；Western blot显示DNA损伤和细胞凋亡蛋白水平增加；细胞死亡相关酶联免疫吸附反应同样显示细胞凋亡水平增加。利用survivin特异的shRNA沉默Kasumi-1和HL-60细胞中survivin的表达后,联合化疗药物：与对照组相比,Western blot显示药物处理后survivin沉默组DNA损伤和细胞凋亡蛋白水平增加。利用survivin的小分子抑制剂YM155处理Kasumi-1和HL-60细胞后,可引起：survivin表达量呈剂量和时间依赖性降低,细胞呈现剂量和时间依赖的凋亡。YM155联合化疗药物处理AML细胞,细胞增殖实验检测发现YM155与化疗药物联合,可以呈现出相互协同的作用,也可以表现为相互拮抗,依赖于具体药物和所作用的细胞。结论：本实验证明了survivin对于AML细胞的增殖和维持具有重要作用,在AML细胞中特异性沉默survivin可以提高其对于化疗药物的敏感性,survivin的小分子抑制剂YM155对AML细胞中survivin的表达降低和细胞凋亡作用呈剂量和时间依赖,YM155与化疗药物联合作用时,联合用药效果依赖于具体药物和所作用的细胞。本文为使用survivin作为AML治疗的靶点提供了新的思路和策略,为今后体内及临床试验的开展提供了依据。
钱红[6]（2014）在《慢病毒载体介导的人乳腺癌SKBR-3细胞HER2基因沉默的实验及显像研究》文中指出目的：研究特异性HER2-shRNA慢病毒载体体外感染乳腺癌细胞SKBR-3后人表皮生长因子受体2（HER2）基因的沉默对肿瘤细胞生物学行为的影响，并通过体内移植瘤实验研究靶向沉默HER2基因后对肿瘤的基因治疗作用以及SPECT显像活体评价RNA干扰（RNA interference，RNAi）效能的可行性，初步探索SPECT分子影像技术在基因治疗领域的应用前景。方法：①利用本实验室保存的有效HER2-短发夹状（sh）RNA（HER2-shorthairpin RNA，HER2-shRNA）慢病毒表达载体和一条随机序列阴性对照慢病毒载体感染乳腺癌SKBR-3细胞株，通过嘌呤霉素筛选建立稳定表达HER2-小干扰（si）RNA（HER2-small interfering RNA，HER2-siRNA）的SKBR-3细胞株及阴性对照细胞株，组成KD组和NC组，并将未感染的SKBR-3细胞作为CON组。②通过Real time PCR、流式细胞仪及Western blot检测各组细胞HER2mRNA及蛋白的表达，流式细胞仪、MTT法、Transwell细胞侵袭实验及划痕实验分别检测各组细胞的凋亡、增殖、侵袭及迁移能力。③将各实验组细胞接种于裸鼠，建立荷人乳腺癌裸鼠模型实验（KD）组和阴性对照（NC）组，并以未感染的SKBR-3细胞株裸鼠模型作为空白对照（CON）组，观察各组移植瘤的生长状况，监测瘤体大小，免疫组织化学法测定各实验组离体移植瘤HER2蛋白的表达情况。④通过131I-曲妥珠单克隆抗体（Herceptin）对乳腺癌裸鼠进行SPECT放射免疫显像，追踪观察肿瘤显影情况，比较各实验组T/B（肿瘤/本底）比值。结果：①经嘌呤霉素筛选获得稳定表达有效干扰序列和阴性对照序列的实验细胞株，经流式细胞仪检测，NC组和KD组的荧光表达率均大于80%。②Real time PCR检测结果显示CON、NC、KD组细胞HER2mRNA的相对含量（HER2/β-actin）分别为1.000、1.081、0.326，KD组与CON和NC组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），KD组的HER2mRNA抑制率为67.4%；此外，应用流式细胞仪测得CON组、NC组和KD组HER2蛋白的表达率分别为（92.40±2.01）%、（92.97±2.44）%、和（55.13±1.65）%，KD组明显低于NC和CON组，差异有显着性（P＜0.01），其HER2蛋白的抑制率为（40.58±0.96）%；Western blot结果显示CON组和NC组HER2蛋白的相对表达量分别为（0.5481±0.0102）和（0.5494±0.0135），而KD组明显下降，仅为（0.2784±0.0099），差异有统计学意义（P＜0.01）；MTT检测结果显示与CON组和NC组相比，KD组细胞增殖明显减慢（P＜0.01）；KD组细胞早期凋亡为（12.8±0.82）%，显着高于CON组（2.67±0.15）%及NC组（3.27±0.35）%（P＜0.01）；Transwell及细胞划痕实验显示KD组较其他两组的侵袭和迁移能力显着下降。③体内动物实验结果显示与CON组和NC组相比，KD组乳腺癌移植瘤平均瘤体体积、瘤体重量明显减小（P＜0.05）；免疫组化结果亦显示KD组HER2蛋白的表达明显下调；裸鼠经尾静脉注射131I-Herceptin后多次追踪显像，移植瘤部位的放射性随时间的延长逐渐浓聚，各时间点T/B值经组织厚度校正后， KD组均小于CON和NC组。除1h的首次显像外，其余各时间点差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：特异性HER2-shRNA慢病毒载体感染乳腺癌SKBR-3细胞后，可以显着抑制肿瘤细胞株的HER2基因表达及恶性生物学行为；以131I-Herceptin为显像剂的分子影像能在一定程度上反映活体内HER2蛋白的表达情况，为SPECT分子影像技术用于针对HER2靶点的RNA干扰肿瘤生物治疗的疗效评估及监测提供了可行性实验数据。
朱珊[7]（2012）在《JMJD2B基因参与前列腺癌细胞凋亡与RAD21基因参与乳腺癌细胞衰老的分子机制研究》文中认为本论文的研究工作由以下两部分组成。第一部分，我们对JMJD2B在TSA诱导前列腺癌细胞LNCap凋亡过程中的作用及机制进行了研究。组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为一类效果突出的抗肿瘤药物，可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡进而起到抑癌的功效。有文献报道，用相应浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理肿瘤细胞会影响众多基因的表达，但其中具体机制还不十分清楚。我们在研究中发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂可影响JMJD2B基因的表达，本实验着重探讨，JMJD2B在组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA诱导下表达水平下调启动凋亡途径的机制。我们的实验结果显示，组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可浓度和时间依赖的下调JMJD2B基因的表达水平，利用siRNA干涉JMJD2B表达能够促进TSA诱导的细胞凋亡。其中的机制是，TSA对抗凋亡蛋白survivin蛋白水平的下调是依赖JMJD2B的表达降低；Cyclin B1参与JMJD2B对survivin的调控，干涉JMJD2B促进Cyclin B1蛋白的降解。以上实验为应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂如TSA协同基因治疗癌症提供了分子理论基础。第二部分，我们发现了干涉RAD21基因可诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231衰老，并对其分子机制做了研究。细胞衰老是细胞在形态、结构和功能发生一系列不可逆转的退行性变化并最终走向死亡的过程。已证实，肿瘤发生的主要事件是肿瘤细胞逃逸衰老而进入永生化，因此诱导肿瘤细胞重新获得衰老特性是抑制肿瘤的重要途径之一。为了确定新的诱导肿瘤细胞衰老的基因事件，我们利用siRNA library在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中进行高通量筛选，确定了5个重要基因参与肿瘤细胞衰老的诱发和调控过程，并选取其中的RAD21基因，对干涉RAD21诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231衰老事件的发生及其可能的机制进行了深入的研究。我们的工作证实，利用人工合成siRNA干涉内源RAD21的表达能诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231衰老样变化，包括抑制细胞增殖，增强衰老相关β-半乳糖苷酶的活性和促进特征异染色质的形成，p21表达水平的上调和pRb磷酸化水平的降低对这一过程至关重要。干涉RAD21可激活pRb-E2F途径，具体机制为，c-Myc的下调参与了pRb的磷酸化调控。报告基因荧光素酶活性分析表明，干涉RAD21是通过抑制c-Myc靶分子CDK4启动子的活性影响CDK4的表达进而阻止其对pRb进行磷酸化。免疫共沉淀（CoIP）和免疫荧光共聚焦实验证实，干涉RAD21促进PML核体形成，PML核体与c-Myc共定位，启动蛋白酶体对c-Myc的降解过程。此外，还发现，p38MAPK信号通路涉及干涉RAD21诱导衰老的过程。我们的研究工作揭示了RAD21未曾报道的新功能，将有助于更好的阐述肿瘤细胞衰老过程中c-Myc下调参与基因调控的模式，并为基于干涉RAD21的分子治疗提供重要的理论基础。综上，我们的研究表明，JMJD2B参与组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导的前列腺癌细胞的凋亡过程；RAD21可能是乳腺癌治疗的一个潜在的有效靶点。
李昆仑[8]（2012）在《RNAi抑制Survivin基因的表达对乳腺癌SKBr-3细胞的影响性研究》文中研究表明目的应用RNA干扰技术抑制人survivin基因的表达,观察其对乳腺癌SKBr-3细胞增殖和凋亡的影响。方法根据survivin编码框采用生物信息学,设计2组siRNA相关基因片段和1组阴性对照siRNA片段,序列经BLAST查询,确定为survivin特异性序列,排除与其他基因同源,把所得序列交Sigma生物公司体外合成。应用脂质体转染法将基因转染入乳腺癌SKBr-3细胞,采用MTT（四甲基偶氮唑盐）比色法分析检测各组细胞在不同时间段的细胞增殖率、RT-PCR和western blot法观察阻断survivin表达后对乳腺癌细胞survivin mRNA和蛋白质表达的抑制率、Annexin V-PE/7-AAD法流式细胞（FCM）检测各组细胞凋亡率。统计学数据处理用均数±标准差（x±s）表示,应用SPSS17统计软件处理数据,多组均数间的比较采用单因素方差分析,然后用SNK进行两两比较,两样本均数的比较采用独立样本的t检验,P<0.05表示有显着性差异。结果取对数生长期的SKBr-3细胞铺板,siRNA通过脂质体转染SKBr-3细胞,在倒置显微镜下观察见：细胞出现明显的细胞皱缩、形态变圆、核分裂相减少、漂浮细胞增多等凋亡改变;MTT法显示2组siRNA对SKBr-3细胞增殖有抑制作用,抑制率明显高于空白对照组及阴性对照组（p<0.01）,且抑制作用具有时间依赖性,其作用最佳时间为转染后48h,其细胞抑制率为（43.1±0.3）%；RT-PCR试验显示2组siRNA组作用于SKBr-3细胞48h后survivin mRNA表达明显下调（p<0.01）,survivin mRNA表达的条带亮度低于其余各组,其mRNA相对表达量分别为：0.203±0.018、0.229±0.019,抑制率分别为55.2%、49.4%。而空白对照组和阴性对照组survivin mRNA水平无明显变化；western blot实验见2组siRNA转染组survivin蛋白表达显着下调（p<0.01）,蛋白条带的灰度低于其余各组,其蛋白相对表达量分别为：0.702±0.007、0.684±0.016,抑制率分别为34.8%、36.4%；于转染48h后收集细胞,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示2组siRNA转染组细胞凋亡率分别为（14.2±1.4）%、（16.8±0.6）%,明显高于其他2组,统计学分析差异有显着性（p<0.01）,而该两组间细胞的增殖与凋亡无明显差别。结论1、本实验针对survivin构建的2组siRNA,确实能有效封闭survivin的表达,抑制SKBr-3细胞增殖并诱导细胞凋亡。一方面提示survivin与乳腺癌的发生、发展、治疗及预后有密切的关系；另一方面提示RNA干扰可用于特异性阻断survivin表达,为靶向诱导乳腺癌细胞凋亡治疗提供了实验依据,为乳腺癌的基因治疗提供了理论基础。2、与survivin mRNA无同源性的阴性对照则对SKBr-3乳腺癌细胞的增殖和凋亡无明显影响,体现了RNAi的特异性优点。3、下调survivin基因的表达来抑制细胞增殖,是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现。4、下调survivin基因的表达,可明显改善肿瘤细胞的异常生物学行为。5、RNAi技术具有高效率、高特异性和显效快等优点,可以作为肿瘤基因治疗的理想技术方法。
李友建[9]（2012）在《三氧化二砷调控Notchl信号通路抑制人乳腺癌细胞生长作用的研究》文中提出目的：探讨三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）对不同人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3细胞增殖和迁移及Notch1和其下游基因NF-κB、Bcl-2表达的影响；探讨As2O3对已转染Notch1siRNA人乳腺癌SKBR-3细胞增殖和Notch1表达及其下游基因NF-κB、Bcl-2表达的影响。方法：（1）以MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3细胞为研究对象，以不同浓度As2O3培养24h和终浓度8.0μmol/L培养24、48、72h后，MTT比色法检测As2O3对细胞增殖的影响；Transwell检测As2O3对MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3细胞迁移的影响；RT-PCR检测Notch1、NF-κB、Bcl-2mRNA表达； Western blot检测Notch1、NF-κB、Bcl-2蛋白表达。（2）以SKBR-3细胞为研究对象，应用DMRIE-C Reagent将siRNA片断转染各组SKBR-3细胞培养48h后，RT-PCR、Western-blot检测Notch1、NF-κB、Bcl-2mRNA和蛋白表达；转染siRNA片段后培养24、48、72h后，MTT比色法检测As2O3对细胞增殖的影响。结果：（1）As2O3能显着抑制人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3细胞增殖，且呈现浓度、时间依赖关系（P<0.01）；并能抑制MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3细胞的迁移（P<0.01）；RT-PCR及Western blot结果显示As2O3作用MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3细胞后，可使Notch1、NF-κB、Bcl-2mRNA和蛋白的表达水平明显下降（P<0.05P<0.01）。（2）RT-PCR及Western blot结果显示As2O3能显着抑制已转染Notch1siRNASKBR-3细胞的Notch1、NF-κB、Bcl-2mRNA和蛋白的表达（P<0.05P<0.01）；As2O3能显着抑制已转染Notch1siRNA SKBR-3细胞增殖（P<0.01）。结论：As2O3能够显着抑制人乳腺癌细胞Notch1、NF-κB、Bcl-2表达及抑制细胞增殖和迁移，初步揭示As2O3可能是通过Notch1信号通路影响人乳腺癌细胞生物学行为，从而为临床砷剂治疗乳腺癌提供理论和实验依据。
李昆仑,崔明,刘嘉,冯雁康,马彦光,朱俊[10]（2012）在《RNAi抑制Survivin基因的表达对乳腺癌SKBr-3细胞的影响》文中研究指明目的应用RNA干扰技术抑制人Survivin基因表达,观察其对乳腺癌SKBr-3细胞增殖和凋亡的影响.方法设计、合成靶向Survivin基因的siRNA基因片段,应用脂质体包埋转染乳腺癌SKBr-3细胞,采用MTT比色法检测细胞增殖率、RT-PCR和Western blot法观察乳腺癌细胞Survivin mRNA和蛋白质的表达、流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 MTT检测显示Survivin-siRNA组对细胞增殖有明显抑制作用（P<0.05）,其细胞最高抑制率为（43.1±0.3）%;RT-PCR检测显示Survivin-siRNA组mRNA表达明显下调（P<0.01）,其相对表达量分别为0.203±0.018、0.229±0.019,抑制率分别为55.2%、49.4%;Western blot检测显示Survivin-siRNA组蛋白表达下调（P<0.01）,其蛋白相对表达量分别为0.702±0.007、0.684±0.016,抑制率分别为34.8%、36.4%;流式细胞仪检测显示Survivin-siRNA组细胞凋亡率明显增高（P<0.01）,分别为（14.2±1.4）%、（16.8±0.6）%.结论 Survivin-siRNA能有效封闭Survivin的表达,抑制SKBr-3细胞增殖并诱导细胞凋亡,推测Sur-vivin基因可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点.
二、表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用（论文提纲范文）
（1）SPOCK1/SIX1信号轴调控乳腺癌演进的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 乳腺癌概况 |
| 1.2 SPOCK1基因基本概况 |
| 1.2.1 SPOCK1的分子结构及功能 |
| 1.2.2 SPOCK1与肿瘤 |
| 1.3 SIX1基因基本概况 |
| 1.3.1 SIX1的分子结构及功能 |
| 1.3.2 SIX1与肿瘤 |
| 1.4 上皮-间质转化(EMT)简介 |
| 1.4.1 EMT概念及特征 |
| 1.4.2 EMT相关的调节因子 |
| 1.4.3 EMT相关信号通路 |
| 1.4.4 SIX1在EMT过程中发挥的作用 |
| 1.4.5 SPOCK1在EMT过程中发挥的作用 |
| 1.5 PI3K/AKT/mTOR信号通路简介 |
| 1.5.1 PI3K/AKT/mTOR信号通路及其小分子抑制剂 |
| 1.5.2 PI3K/AKT/mTOR信号通路参与乳腺癌EMT过程 |
| 1.6 实验设计 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 乳腺癌细胞系及组织切片 |
| 2.1.2 主要抗体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 生物信息数据分析 |
| 2.2.3 SPOCK1慢病毒转染实验 |
| 2.2.4 MTT实验 |
| 2.2.5 EdU细胞增殖实验 |
| 2.2.6 平板克隆实验 |
| 2.2.7 流式细胞术 |
| 2.2.8 Western blot实验 |
| 2.2.9 细胞划痕实验 |
| 2.2.10 Transwell细胞迁移、侵袭实验 |
| 2.2.11 细胞免疫荧光实验 |
| 2.2.12 建立裸鼠异种移植瘤模型 |
| 2.2.13 裸鼠肺转移模型的建立 |
| 2.2.14 苏木素-伊红染色(HE染色) |
| 2.2.15 S-P法免疫组织化学染色 |
| 2.2.16 免疫共沉淀实验(Co-IP实验) |
| 2.2.17 SIX1小干扰RNA细胞转染 |
| 2.2.18 数据处理与统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SPOCK1在乳腺癌中异常高表达,且患者预后不良相关 |
| 3.2 SPOCK1高表达促进乳腺癌增殖及细胞周期进程 |
| 3.3 SPOCK1可通过EMT途径促进乳腺癌转移 |
| 3.4 SPOCK1通过激活AKT/mTOR信号通路促进乳腺恶性进展 |
| 3.5 SIX1在乳腺癌中高表达,且与SPOCK1具有相互作用 |
| 3.6 SPOCK1/SIX1信号轴通过激活AKT/mTOR信号通路调节乳腺癌演进 |
| 4 讨论 |
| 5 总结与展望 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的科研成绩 |
| 致谢 |
（2）人类乳腺癌与病毒感染相关性以及基因治疗靶点的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 乳腺癌细胞中人乳头瘤病毒和小鼠乳腺肿瘤病毒基因的筛查 |
| 材料和方法 |
| 试验材料 |
| 试验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 探索以病毒基因为靶点对乳腺癌细胞株抑制作用的研究 |
| 试验材料 |
| 试验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 针对骨肉瘤MG63细胞系的SURVIVIN-SIRNA转染细胞株的制备及体外验证研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料及步骤 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及步骤 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞中整合素A5表达水平的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及步骤 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 靶向治疗整合素A5对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料及步骤 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞体内实验的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料及步骤 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录 |
| 附件 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（4）MiR-200c通过靶向ZNF217与ZEB1抑制TGF-β信号并调控乳腺癌trastuzumab耐药与转移（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 Trastuzumab耐药乳腺癌恶性表型鉴定及TGF-β信号的调控作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 MiR-200c调控乳腺癌trastuzumab耐药、转移及TGF-β信号 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 MiR-200c调控乳腺癌trastuzumab耐药、转移及TGF-β信号的分子机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）乳腺癌和急性髓系白血病的靶向治疗（论文提纲范文）
| 第一部分 抗ErbB3抗体MM-121/SAR256212联合曲妥珠单抗(trastuzumab)对trastuzumab耐药乳腺癌的治疗作用 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Survivin作为治疗急性髓系白血病的治疗靶点的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的文章题录 |
| 致谢 |
（6）慢病毒载体介导的人乳腺癌SKBR-3细胞HER2基因沉默的实验及显像研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验流程 |
| 第一部分 HER2-SHRNA 慢病毒载体对人乳腺癌细胞株 SKBR-3 的体外实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 HER2-SHRNA 慢病毒载体对人乳腺癌细胞株 SKBR-3 的体内实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表论文 |
| 致谢 |
（7）JMJD2B基因参与前列腺癌细胞凋亡与RAD21基因参与乳腺癌细胞衰老的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 JMJD2B在TSA诱导前列腺癌细胞LNCap凋亡过程中的作用及机制研究 |
| 引言 |
| 一. JMJD2 亚家族基因及其研究进展 |
| （一）JMJD2 亚家族成员 |
| （二）JMJD2 家族蛋白与肿瘤发生发展 |
| （三）JMJD2B基因及其功能研究 |
| 二、组蛋白去乙酰化酶抑制剂与肿瘤细胞凋亡 |
| （一）组蛋白去乙酰化酶抑制剂概述 |
| （二）组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA简介 |
| （三）细胞凋亡研究背景 |
| （四）细胞凋亡相关基因 |
| 三、本部分研究的内容与意义 |
| （一）立题依据 |
| （二）研究内容和意义 |
| 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| （一）质粒 |
| （二）抗体 |
| （三）siRNA及转染试剂的订购 |
| （四）哺乳动物细胞系 |
| （五）试剂 |
| （六）实验仪器 |
| 二、实验方法 |
| Ⅰ. 分子生物学实验方法 |
| （一）分子克隆 |
| （二）DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| （三）质粒大量制备的方法 |
| （四）哺乳动物细胞总RNA的提取和反转录 |
| （五）PCR和荧光实时定量（Real-time）PCR |
| Ⅱ. 细胞生物学实验方法 |
| （一）哺乳动物细胞系的培养 |
| （二）Western blotting检测 |
| （三）MTT法检测细胞增殖能力 |
| （四）流式细胞术检测细胞周期 |
| （五）流式细胞术检测细胞凋亡 |
| （六）免疫荧光 |
| （七）免疫共沉淀（coimmuno-precipitation assay, CoIP） |
| Ш、统计分析 |
| 实验结果与分析 |
| 一、组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导前列腺癌细胞LNCap凋亡过程中JMJD2B基因表达的变化 |
| 二、 TSA诱导肿瘤细胞凋亡过程中survivin蛋白水平降低依赖于JMJD2B的下调 |
| （一）TSA诱导肿瘤细胞凋亡过程中survivin蛋白水平降低 |
| （二）TSA诱导肿瘤细胞凋亡过程中survivin蛋白水平降低依赖于JMJD2B的下调 |
| （三）JMJD2B调控survivin蛋白的机制 |
| 三、 Cyclin B1 参与JMJD2B对survivin的调控，以及JMJD2B对Cyclin B1 蛋白的调控 |
| （一）干涉 JMJD2B对Cdc2 和Cyclin B1 的蛋白和mRNA的影响 |
| （二）JMJD2B影响Cyclin B1 蛋白的稳定性 |
| （三）JMJD2B蛋白与Cyclin B1 蛋白的结合情况 |
| 四、干涉JMJD2B对TSA诱导细胞凋亡的影响 |
| （一）TSA诱导前列腺癌细胞LNCap凋亡的验证 |
| （二）干涉JMJD2B促进TSA诱导细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 一. 干涉JMJD2B抑制survivin通路，增强TSA诱导前列腺癌细胞的凋亡，部分抑制前列腺癌细胞的增殖 |
| 二. JMJD2B表达下调与组蛋白去乙酰化酶抑制剂作用机制的关系 |
| 第二部分 干涉RAD21 基因诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231 衰老的发现及其分子机制研究 |
| 前言 |
| 一、RAD21 基因家族简介 |
| （一）RAD21 家族成员与功能 |
| （二）RAD21 基因及其研究进展 |
| 二、细胞衰老与肿瘤 |
| （一）细胞衰老的介绍 |
| （二）衰老与肿瘤的研究进展 |
| 三、本部分研究的内容与意义 |
| （一）立题依据 |
| （二）研究内容和意义 |
| 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| （一）质粒 |
| （二）抗体 |
| （三）siRNA的订购 |
| （四）哺乳动物细胞系 |
| （五）试剂 |
| （六）实验仪器 |
| 二.实验方法 |
| Ⅰ. 分子生物学实验方法 |
| （一）分子克隆 |
| （二）DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| （三）质粒大量制备的方法 |
| （四）哺乳动物细胞总RNA的提取和反转录 |
| （五）PCR和荧光实时定量（Real-time）PCR |
| Ⅱ. 细胞生物学实验方法 |
| （一）哺乳动物细胞系的培养 |
| （二）真核生物细胞的瞬时转染和荧光素酶报告基因检测 |
| （三）Western blotting检测 |
| （四）MTT法检测细胞增殖能力 |
| （五）衰老染色实验 |
| （六）免疫荧光 |
| （七）免疫共沉淀（coimmuno-precipitation assay, CoIP） |
| Ⅲ、统计分析 |
| 实验结果与分析 |
| 一. 干涉内源RAD21 基因的表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231 的影响 |
| （一）RAD21 siRNA干涉效果的验证 |
| （二）干涉RAD21 抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231 的增殖及DNA合成 |
| （三）干涉RAD21 诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231 衰老相关的β-半乳糖苷酶活性提高，细胞核内形成特殊异染色质凝集现象 |
| 二、p21 和pRb蛋白参与干涉RAD21 诱导的细胞衰老 |
| （一）干涉RAD21 上调p21 表达，下调pRb的磷酸化水平 |
| （二）干涉p21 和pRb蛋白对干涉RAD21 诱导细胞衰老的影响 |
| 三、c-Myc对干涉RAD21 诱导衰老中pRb-E2F信号通路的影响 |
| （一）干涉RAD21 下调pRb-E2F通路下游靶基因 |
| （二）c-Myc参与干涉RAD21 对pRb-E2F通路的调控 |
| （三）干涉RAD21 下调c-Myc下游pRb调控因子CDK4 的表达水平 |
| （四）干涉RAD21 降低c-Myc下游效应子CDK4 的启动子活性 |
| 四、PML参与干涉RAD21 对c-Myc调控的分子机制 |
| （一）蛋白酶体抑制剂MG-132 抑制了干涉RAD21 诱发的c-Myc蛋白降解 |
| （二）PML小体和c-Myc在干涉RAD21 诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231 衰老过程中的结合情况 |
| 五、p38MAPK信号途径参与干涉RAD21 诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231 的衰老作用 |
| （一）干涉RAD21 促进p38 MAPK蛋白磷酸化水平增加，而不影响ERK1/2 的磷酸化水平 |
| （二）阻断p38MAPK信号途径可以部分抵制干涉RAD21 诱导的细胞衰老 |
| 讨论 |
| 一、RAD21 参与肿瘤细胞衰老事件的探讨 |
| 二、pRb蛋白和p21 蛋白参与干涉RAD21 诱导MDA-MB-231 细胞衰老 |
| 三、p38MAPK信号转导途径参与干涉RAD21 诱导MDA-MB-231 细胞衰老 |
| 主要结论和创新点 |
| 一、主要结论 |
| 二、主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（8）RNAi抑制Survivin基因的表达对乳腺癌SKBr-3细胞的影响性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一、材料 |
| 1. 细胞系 |
| 2. 主要试剂 |
| 3. 主要试剂配制 |
| 4. 主要仪器 |
| 二、方法 |
| 1. 细胞培养及传代 |
| 2. 细胞计数与存活测试 |
| 3. siRNA转染 |
| 3.1 脂质体转染原理 |
| 3.2 转染步骤 |
| 4. MTT法检测RNAi后的细胞增殖情况 |
| 4.1 MTT法原理 |
| 4.2 MTT法操作步骤 |
| 4.3 结果处理 |
| 5. 半定量RT-PCR检测survivin基因mRNA的表达 |
| 5.1 原理及应用 |
| 5.2 引物和内参合成 |
| 5.3 细胞转染及总RNA提取 |
| 5.4 1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 5.5 cDNA合成 |
| 5.6 PCR反应 |
| 5.7 凝胶电泳 |
| 5.8 数据分析 |
| 6. Western印迹法检测RNAi后survivin蛋白的表达 |
| 6.1 Western印迹法原理 |
| 6.2 实验步骤 |
| 7. Annexin V-PE/7-AAD法流式细胞(FCM)检测凋亡率 |
| 7.1 Annexin V-PE/7-AAD法流式细胞检测凋亡原理 |
| 7.2 实验步骤 |
| 7.3 结果分析 |
| 8. 统计学处理 |
| 三、结果 |
| 1. 细胞形态学观察 |
| 2. MTT法检测细胞增殖 |
| 3. RT-PCR检测survivin mRNA表达水平 |
| 4. 免疫蛋白印记(Western Blot)检测survivin蛋白表达水平 |
| 5. 转染48小时后siRNA诱导SKBr-3细胞的凋亡率 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 攻读学位期间参与科研情况 |
| 致谢 |
（9）三氧化二砷调控Notchl信号通路抑制人乳腺癌细胞生长作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与仪器 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| A 英文缩略词表 |
| B 个人简介及发表文章 |
| C 综述 |
（10）RNAi抑制Survivin基因的表达对乳腺癌SKBr-3细胞的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 siRNA寡核苷酸的合成 |
| 1.2.2 细胞培养及传代 |
| 1.2.4 MTT法检测RNAi后的细胞增殖情况 |
| 1.2.5 半定量RT-PCR检测Su r vivin基因mR-NA的表达 |
| 1.2.6 We st e r n blot印迹法检测s urvivin蛋白表达 |
| 1.2.7 An n e x in V-PE/7-AAD法流式细胞仪（FCM）检测凋亡率 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 MTT法检测细胞增殖 |
| 2.2 RT-PCR检测Su r vivin mRNA表达水平 |
| 2.3 免疫蛋白印记（We st e r n Blot）检测su r-vivin蛋白表达水平 |
| 2.4 流式细胞仪（F CM）检测凋亡率 |
| 3 讨论 |
四、表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用（论文参考文献）
- [1]SPOCK1/SIX1信号轴调控乳腺癌演进的机制研究[D]. 徐明. 延边大学, 2020(05)
- [2]人类乳腺癌与病毒感染相关性以及基因治疗靶点的研究[D]. 颜晨. 中国疾病预防控制中心, 2016(03)
- [3]Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究[D]. 流小舟. 南方医科大学, 2016(04)
- [4]MiR-200c通过靶向ZNF217与ZEB1抑制TGF-β信号并调控乳腺癌trastuzumab耐药与转移[D]. 白文栋. 第四军医大学, 2015(03)
- [5]乳腺癌和急性髓系白血病的靶向治疗[D]. 黄菁草. 北京协和医学院, 2014(11)
- [6]慢病毒载体介导的人乳腺癌SKBR-3细胞HER2基因沉默的实验及显像研究[D]. 钱红. 苏州大学, 2014(11)
- [7]JMJD2B基因参与前列腺癌细胞凋亡与RAD21基因参与乳腺癌细胞衰老的分子机制研究[D]. 朱珊. 东北师范大学, 2012(05)
- [8]RNAi抑制Survivin基因的表达对乳腺癌SKBr-3细胞的影响性研究[D]. 李昆仑. 昆明医科大学, 2012(11)
- [9]三氧化二砷调控Notchl信号通路抑制人乳腺癌细胞生长作用的研究[D]. 李友建. 蚌埠医学院, 2012(S2)
- [10]RNAi抑制Survivin基因的表达对乳腺癌SKBr-3细胞的影响[J]. 李昆仑,崔明,刘嘉,冯雁康,马彦光,朱俊. 昆明医学院学报, 2012(02)