一、抗慢性粒细胞性白血病bcr/abl mRNA真核表达载体的构建（论文文献综述）
陈晓文[1]（2021）在《Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究》文中研究指明研究背景:慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是临床常见的血液系统恶性肿瘤,主要特征为骨髓造血生成大量未成熟的白细胞,其发病率高达新发成人白血病的20%。BCR-ABL融合基因目前被认为是CML发病的重要原因和基本特征,该融合基因表达可生成具备组成性酪氨酸激酶活性的BCR-ABL嵌合蛋白。在CML的临床治疗中,特异性BCR-ABL抑制剂,如酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）可将患者生存率显着提高,已被临床广泛应用。伊马替尼是（IM）一种通过阻断BCR-ABL蛋白的非活性构象的TKI,首次应用于CML的治疗,疗效显着,毒性较低。但仍有大量CML患者对伊马替尼不敏感或通过多种细胞机制产生耐药性。因此,在CML进展过程中筛选出有效的治疗靶点是非常迫切的,这将有助于提高CML在TKI药物治疗中的效果。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,Skp2）是由人Skp2基因编码的E3泛素连接酶。Skp2是一种C-Myc直接靶基因,在细胞周期进程的调控中起重要作用,多种恶性肿瘤中常发现有其表达上调。在血清缺乏的细胞中,Skp2过表达从而诱导细胞周期素A积累和p27磷酸化依赖性的降解从而促进细胞进入S期。Skp2还参与其他细胞周期调节蛋白的泛素化,包括细胞周期蛋白E和转录因子E2F1。目前国内外多项研究证实Skp2与许多实体肿瘤的化疗耐药性有关。如Skp2通过p27-CDKs-E2F1途径正向调节有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitotic arrest deficient 2,MAD2）的表达,通过抑制Skp2可以增强肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。但Skp2在CML中的发生和抗肿瘤耐药中的作用尚待明确。研究目的:比较CML患者与正常对照组外周血白细胞中Skp2的蛋白水平与m RNA水平。探究Skp2的异常表达在K562细胞中的作用机制:在K562细胞中稳定敲减和过表达Skp2基因,检测细胞数量变化和细胞的增殖能力变化。在K562细胞中分别敲减和过表达c AMP应答元件结合蛋白（CREB）基因,检测Skp2的m RNA水平。检测抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴后K562细胞对伊马替尼的敏感性变化。研究方法:1.收集24例新诊断的CML患者（研究组）和7例健康体检者（对照组）外周血,对外周血样本进行白细胞分离。分别通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）分析两组样本中Skp2的m RNA水平和蛋白水平。2.人CML细胞系K562在37℃,5%的CO2条件下用的RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）培养。构建基于PLK0.1的sh RNA-Skp2质粒,在K562细胞中稳定敲减Skp2,用Western Blot法检测稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞中Skp2蛋白水平,验证敲减Skp2基因的效果。通过细胞计数分析,比较K562细胞在Skp2稳定敲减和未敲减情况下的细胞增殖率,对稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞用Ed U染色及Hoechst 33342染色法观察细胞核,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞的比值。在K562细胞中转染Flag-Skp2质粒,对过表达Skp2的K562细胞行Western Blot分析,采用细胞计数分析法测定过表达Skp2的K562细胞的细胞数变化,并用Ed U染色及Hoechst33342染色观察细胞形态,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞之比。3.利用Jas PAR软件对编码Skp2基因的上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在保守的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析证实CREB基因和Skp2启动子中CREB结合区（BR）的基因片段之间存在特异性结合。构建一系列含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒。将K562细胞与含有野生型或突变型Skp2启动子区的PGL3荧光素酶报告质粒以及Flag或Flag-CREB质粒共转染K562细胞,转染后取细胞溶解物,使用荧光素酶测定其转录活性,用Western Blot法验证CREB的过表达效果,同时通过q RT-PCR测定Skp2的m RNA水平。K562细胞与含有sh RNA-CREB基因或sh RNA-ctrl基因共转染,转染后行Western Blot法证实基因敲减效果,荧光素酶分析转录活性。用q RT-PCR测定CREB基因敲减前后K562细胞中Skp2 m RNA水平变化。4.用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与sh RNA-ctrl组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用二甲基亚砜或磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂Ly294002（10μmol/L）预处理K562细胞4 h,伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与对照组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,Western Blot分析caspase-3/7活性和PARP的裂解。K562细胞分别加用和不加Ly294002预处理再加用伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,试剂盒检测caspase-3/7活性并用Western Blot分析PARP的裂解。研究结果:1.和健康对照组相比,Skp2在CML患者中异常表达。收集24例CML患者和7例健康体检者外周血白细胞,CML样本显示Skp2的m RNA水平及蛋白水平均较健康对照组显着上调。数据表明CML患者Skp2表达上调,Skp2蛋白水平与m RNA水平呈一致性改变。2.Skp2是K562细胞增殖的关键。在K562细胞中稳定敲减Skp2基因,与对照组细胞相比,敲减了Skp2的K562细胞的细胞数量显着减少。Ed U分析显示敲减Skp2的K562细胞增殖能力显着低于对照组细胞。3.Skp2过表达影响K562细胞的增殖。与敲减基因结果相反,通过过表达Skp2基因,K562细胞数量增加。与此相关,Skp2过表达导致K562细胞中Ed U阳性细胞百分比显着增加。4.Skp2通过CREB转录调控。利用Jas PAR软件对Skp2编码基因上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析显示,CREB能和Skp2基因中CREB结合区（BR）的基因片段特异性。构建一系列包含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒,将含有WT或MUT的Skp2启动子区以及Flag或Flag-CREB的质粒共转染K562细胞,野生型CREB-BR（WT）转录活性在过表达CREB后明显升高,但突变型质粒（MUT）和p GL3空载体转录活性未见明显升高。相反,野生型CREB-BR（WT）转录活性在稳定敲减CREB基因的K562细胞中降低,同样突变型构建体（MUT）和PGL3空载体均未显示转录活性的改变。5.CREB的稳定敲减导致K562细胞中Skp2 m RNA水平显着降低。鉴于CREB的转录活性是由其第133位丝氨酸磷酸化后被活化的,我们试图评估野生型的Flag-CREB和第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对Skp2表达的影响。野生型的Flag-CREB能够上调Skp2的m RNA水平,但第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对于Skp2的m RNA水平无明显的调控作用。以上结果提示,在K562细胞中Skp2的表达在转录水平受到CREB的调控。6.抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴增加K562细胞对伊马替尼的敏感性。用伊马替尼处理（1μmol/L）CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞并观察其存活率,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后表现出细胞活力的急剧下降。7.CREB或Skp2的敲减导致伊马替尼处理的K562细胞中caspase-3/7活性的显着增加。caspase-3/7的活化是对伊马替尼治疗敏感性的响应,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后与对照组细胞药物处理后相比,caspase-3/7的活化及PARP的裂解更明显。8.PI3K/Akt信号通路在关联CREB的激活及Skp2的表达中起到特定的作用。在K562细胞中稳定敲减Akt或使用LY294002来抑制PI3K/Akt通路,结果导致伊马替尼处理的K562细胞活力显着下降,Skp2蛋白水平降低,caspase-3/7活化及PARP裂解明显增强,说明K562细胞对伊马替尼更加敏感。结论:与健康对照者相比,初治CML患者外周血白细胞中Skp2高表达,并且Skp2高表达对CML细胞增殖至关重要。从机制上讲,在K562细胞中Skp2受PI3K/Akt-CREB信号通路的转录调控。此外,稳定敲减Skp2的表达或阻断PI3K/Akt-CREB通路可显着提高K562细胞对伊马替尼的敏感性。
吴祁生[2]（2018）在《基于重组MS2病毒样颗粒的急性早幼粒白血病PML-RARα融合基因检测质控品及其应用研究》文中认为PML-RARβ融合基因检测在急性早幼粒细胞白血病的临床管理中发挥重要作用。使用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）的PML-RARα融合基因分子检测可以证实基于形态学、免疫表型和/或凝血障碍筛查对APL的假定诊断。同时,使用RT-qPCR连续检测PML-RARα融合基因转录水平可以监测最小残留病（MRD）,用于记录白血病负担并最终确认分子缓解。基于PML-RARβ融合基因转录物的RT-qPCR检测已广泛开展于临床常规实验室,尤其是血液病分子实验室。依据PML-RAR融合基因检测目的,临床真实骨髓标本有核白细胞提取的总RNA可分为3个部分,即PML-RARα融合基因mRNA,内参基因mRNA和其他无关RNA,其中无关RNA占总RNA 比例最大。我们选择生物安全性高、稳定性好、对RNA保护作用强的噬菌体MS2病毒样颗粒（Bacteriophage MS2 virus-like particles,MS2VLPs）来制作PML-RARα融合基因、内参基因和无关RNA的盔甲RNA。其中PML-RAR融合基因包括L、S和V三种亚型,选择外源性23s rRNA作为无关RNA。混合PML-RARα融合基因不同亚型,内参基因和23s rRNA的盔甲RNA,就可模拟有核白细胞总RNA组成特征和RNA产量,进而制备不同PML-RRα转录水平的模拟白细胞样本。针对不同亚型的PML-RARα融合基因,我们设计不同的APL临床模拟病例,同时提供从入院诊断到随访的各个MRD监测点的临床检测信息。依据APL病程不同MRD监测点临床信息制备不同的模拟白细胞样本,作为PML-RARα融合基因检测EQA样本。根据PML-RARα临床检测流程,采用严格的EQA评价标准,突出PML-RARα融合基因入院诊断筛查和定性检测在临床治疗决策中的重要作用。参考多种国内外基因诊断报告标准,建立PML-RARα融合基因临床检验报告单评分标准,考查参评实验室临床检验报告的规范完整性。各实验室需根据APL模拟病例和质控样本临床检查信息,给出相应的临床治疗方案和治疗调整,以考查实验室与临床科室的沟通意愿和能力。我们要求参评实验室对EQA样本进行融合基因检测流程,包括RNA提取、白血病相关融合基因诊断筛查、定性和定量RT-qPCR检测,最终提交实验数据回报表和临床检验报告。我们制备的模拟白细胞样本对各种RNA提取方法有很好的适应性,各实验室RNA产量与真实BM样本基本一致（2.27～35.70μg）,内参基因的拷贝数>104,可以满足后续的PCR实验检测。针对PML-RARα融合基因临床检测流程,在50家参评实验室中,30.0%（15/50）的整体表现被认为是“优秀”,8.0%（4/50）参评者被归类为“尚可”,62.0%（31/50）实验室被纳入“有待提高”。白血病相关融合基因诊断筛查和定量检测的整体表现明显优于定性检测和临床检验报告表现。（1）参评实验室的诊断筛查表现好,只有1家实验室出现PML-RARα亚型鉴定错误结果。（2）RT-qPCR定性检测表现不能令人满意,51.0%（25/49）实验室在治疗决策重要性的MRD监测点出现了至少1个假阳性或假阴性结果,共报告28个假阳性结果和15个假阴性结果;RT-qPCR定量检测稳定性差,表现为参评实验室不同样本之间检测能力不一致,不同实验室之间检测结果不一致;对PML-RAα融合基因低频亚型V,RT-qPCR定性和定量检测能力明显差于亚型L/S。（3）临床检验报告规范完整性表现差,只有检测结果却很少有基于给定APL模拟病例的临床解释和进一步检测建议;多数临床实验室有与临床科室沟通意愿,但深度有待加强。综上所述,模拟白细胞样本可以胜任PML-RAR融合基因临床检测流程质量评价,在RNA提取、内参基因和融合基因检测方面成功模拟了临床标本特征。针对不同的室间评价结果,临床实验室需要严格执行PCR分区操作防止样本污染,常规进行室内质量控制,定期进行仪器设备的维护和校准,以避免假阳性和假阴性结果;同时要主动优化和验证RT-qPCR检测程序,完善实验室程序性文件,以保证实验室定量检测结果的稳定性和准确性。临床实验室需关注检测样本的临床信息,合理分析检测结果,得出有专业临床解释的临床检验报告。临床实验室需加强与临床医师之间的沟通交流,继续参加室间质量评价和教育活动,以改进PML-RARα融合基因临床检测流程。本研究的创新性主要有:（1）使用MS2VLPs制备APL模拟白细胞样本,包括PML-RAR融合基因低频亚型V;（2）设计APL常规顺利型和极端复发型病例,在不同MRD监测点制备相应PML-RAR融合基因转录水平的模拟白细胞EQA样本,组成PML-RAR融合基因不同亚型的室间质评样本盘;（3）模拟APL临床检测流程,考查质控样本的RNA提取、入院诊断筛查、定性和定量检测,临床报告与临床治疗;（4）建立了适合急性早幼粒白血病PML-RARα FG检测流程的严格的EQA评分标准,评价实验室筛杏、定性和定量检测能力:（5）建立临床检验报告单评分标准,考查PML-RAR融合基因临床检验报告的规范完整性;（6）设计APL模拟病例和各EQA样本临床检查信息,以临床治疗响应和调整的有无为指标考查实验室与临床科室的沟通意愿和能力。
李光耀[3]（2016）在《核糖体蛋白RPS15A促进白血病U937细胞恶性增殖的分子机制研究》文中进行了进一步梳理白血病是一类临床常见的血液系统恶性肿瘤,近年来白血病的发病率和致死率呈上升趋势,其预后差,致死率高。据统计,在欧美国家白血病的发病率最高,约为3.2～7.4/10万。在中国,随着环境污染日益严重,白血病的发病率也呈逐年上升的趋势。虽然已有大量研究数据表明多数白血病的发病原因与基因突变有关。目前深入研究白血病发病机制,不断寻找白血病新的作用靶点,开发治疗白血病的特异性药物,已成为临床学者和科学工作者需要面临的重大挑战和任务。近几年,针对白血病的主要的治疗方法是以化疗、放疗及骨髓造血干细胞移植治疗为主,但因化疗的副反应大,而造血干细胞移植费用高昂,患者一般都难以承受。随着分子生物学的不断进步,探索肿瘤的发病机制正逐渐开始成为人们研究的热点。大量的研究表明,多种分子共同参与了白血病的发生发展,这些分子大多在细胞增殖,分化及凋亡中起关键作用。目前,有研究表明发生在核糖体生物合成和蛋白质翻译阶段的异常会影响细胞生长及周期进程,进而会导致肿瘤的发生。许多的研究报道都发现,核糖体蛋白在生物体内表达异常、突变或失调都能为肿瘤的发生发展奠定了一定的基础。核糖体蛋白质（Ribosomal Protein）,也简称为核糖体蛋白（RP）,它是参与构成核糖体的所有蛋白质的统称,RP是构成核糖体的主要成份,在核糖体的翻译过程中发挥重要作用。目前研究发现很多核糖体蛋白在其合成过程中受到转录后水平的调控。而细胞中的磷酸化、泛素化等蛋白酶体降解途径也参与了核糖体蛋白转录后的调控,它可介导蛋白质的生物合成,具有参与DNA修复、细胞发育、细胞增殖、细胞分化及细胞凋亡等,在细胞内蛋白质生物合成中发挥重要作用。最近研究证实核糖体蛋白参与调控生物细胞的癌变过程。核糖体蛋白通常在恶性肿瘤细胞特异性高表达,从而增强肿瘤细胞增殖,侵袭和迁移的能力。核糖体蛋白作为多数肿瘤的致瘤基因,参与了多种癌症的发生和发展,包括食管癌,胃癌,肺癌等多种恶性肿瘤,是当前靶向癌症治疗研究的热点。RPS15A基因是核糖体蛋白基因家族中的一员。RPS15A基因位于染色体16p13上,具有包含5个外显子的393bp的编码区。RPS15A基因的表达受多个基因调控,在结构上RPS15A基因与原核生物RPS8基因高度同源。最新的一项荟萃分析表明RPS15A在星形细胞瘤、结直肠癌以及前列腺癌中均表达升高。另外,越来越多的研究也证实RPS15A基因参与体内一些如肝癌、骨肉瘤、肺癌等肿瘤的生长过程。但是该基因在白血病中的相关作用尚未有报道。小干扰RNA （siRNA）使目的mRNA发生特异性降解,从而导致目的基因沉默的现象被称为RNA干扰（RNA interference, RNAi）。此现象广泛的存在于自然界中,RNAi主要是在转录后水平上调控靶基因的表达,在生物体的进化过程中,当出现病毒感染、重复序列或突变引发的基因组不稳定性时触发的一种保护机制。通过RNA干扰机制可以使正在进化的生物体形成一种能抵御外部侵害的保护机制,这种保护机制在稳定基因组免受外来侵害的过程中也起重要作用。RNA干扰能够在目的细胞中敲除靶基因的表达,因其特异性高、基因敲除彻底等优点而被广泛用于探索基因在人类疾病中的功能,特别是在肿瘤治疗领域。因此本课题运用RNA干扰技术特异性的敲除RPS15A基因的表达,研究其在白血病细胞中的功能表型变化,并进一步探索RPS15A引发白血病可能的分子机制。首先,构建RPS15A基因的敲减及过表达慢病毒载体,包装病毒颗粒并感染人白血病细胞系U937细胞,采用实时定量聚合酶链式反应（eal time PCR）和Western印迹法（Western blot）分别验证RPS15A基因在mRNA水平和蛋白水平的表达变化,确定其干扰效率。其次,采用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖能力；流式细胞仪检测RPS15ARNAi慢病毒感染白血病细胞后细胞周期分布情况及凋亡变化,观察并分析RPS15A基因对白血病细胞增殖、细胞周期分布及凋亡的影响。结果表明,沉默RPS15A基因能有效抑制白血病细胞中RPS15A基因在mRNA和蛋白水平的表达；感染干扰慢病毒后,白血病细胞的增殖能力明显受到抑制,说明RPS15A在白血病的发生发展过程中发挥重要作用。流式细胞术的分析表明敲除白血病细胞的RPS15A基因后,细胞周期阻滞于G0/G1期,同时凋亡细胞也显着增加。综上所述,RPS15A基因在体外主要影响白血病细胞的增殖,同时,RPS15A基因可作为新的潜在靶基因,为未来白血病的治疗研究提供新的治疗方法。
黄之虎,韦思羽,农朝赞,韦仕喻,农少云,郭凌霄,李育敏,何金花,杨林杰[4]（2014）在《三氧化二砷联合miR-203对人白血病K562细胞的抑制作用及其机制》文中进行了进一步梳理目的:研究三氧化二砷（As2O3）联合过表达的微小RNA-203（microRNA-203,miR-203）对白血病K562细胞的抑制作用及其可能的分子机制。方法:将miR-203的真核表达载体pmiR-203转染K562细胞,Real-time PCR检测细胞内miR-203的表达。将K562细胞分为空白对照组、As2O3组、pmiR-203组、空质粒对照组、As2O3联合空质粒对照组和As2O3联合pmiR-203组,MTT法检测各组细胞增殖抑制率,流式细胞术仪检测细胞凋亡率,Western Blotting检测细胞内Bcr/abl蛋白的表达水平。构建Bcr/abl 3’UTR和Bcr/abl mut-3’UTR的双荧光素酶报告基因载体,将其与pmiR-203共转染K562细胞,通过荧光素酶活性分析判断miR-203是否与Bcr/abl基因的3’UTR结合。结果:miR-203的真核表达载体pmiR-203转染K562细胞后,细胞内miR-203的表达水平明显增高（P<0.05）。高表达miR-203联合As2O3使K562细胞对As2O3的敏感性提高到单用As2O3的4.86倍,IC50从3.4μmol/L降低至0.7μmol/L,两者联用表现为协同作用。As2O3联合pmiR-203组的细胞凋亡率显着高于As2O3联合空质粒对照组[（29.97±3.19）%vs（10.77±1.71）%,P<0.05]。过表达miR-203显着下调K562细胞内Bcr/abl蛋白的表达水平。Bcr/abl 3’UTR中带有明确的miR-203结合位点。结论:miR-203可提高白血病K562细胞对As2O3的敏感性,miR-203和As2O3联用对K562细胞具有协同抑制作用,其作用机制可能与miR-203直接下调Bcr/abl融合基因的表达有关。
王建[5]（2014）在《CIAPIN1在肿瘤中的生物学功能研究》文中研究说明背景：造血是一个精细的调控过程,能使骨髓中不成熟的祖细胞最终分化成熟进入外周血。外周血中成熟的血细胞如中性粒细胞的生存期较短,以严格地调控其在外周血的正常数量。这就需要造血祖细胞适度的增殖、分化成熟或发生凋亡造血祖细胞中造血基因精细的协调以及相互作用构成了这一复杂的造血过程。慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）是一类由基因突变导致的造血系统恶性肿瘤,可使增殖失调、分化受阻,以及造血祖细胞生存延长。K562细胞作为一株分化程度差、恶性程度高的细胞系,在合适的诱导条件下可以向红系、粒系和巨核系多个方向分化。CIAPIN1（cytokine-induced apoptosis inhibitor1）是一个新近被证实和凋亡相关的因子,是独立于凋亡调节分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的RAS信号转导通路中的一个新调节分子。研究表明CIAPIN1基因的表达与肿瘤的发生发展有密切关系,目前CIAPIN1基因在慢性粒细胞白血病中的作用尚未见报道。目的：探讨靶向干扰CIAPIN1基因对K562细胞粒系分化的影响,并研究其相关机制,为慢性粒细胞白血病的治疗提供新的靶点。方法：采用RNA干扰技术沉默K562细胞内的CIAPIN1基因,瑞氏染色和电镜观测细胞形态和超微结构的变化,实时定量PCR和流式细胞术检测粒系分化标志基因的变化；采用western blotting技术检测沉默CIAPIN1基因后NHE1表达的变化,进一步改变NHE1表达或活性,研究NHE1在K562细胞粒系分化中的作用及CIAPIN1与NHE1之间的调控关系；采用western blotting技术检测NHE1表达改变对ERK1/2磷酸化的影响,进一步改变ERK1/2活性,研究ERK1/2信号通路在K562细胞粒系分化中的作用及NHE1与ERK1/2之间的调控关系。结果：沉默CIAPIN1基因能促进K562细胞向成熟的粒细胞阶段分化；CIAPIN1基因表达下调引起NHE1表达降低和磷酸化ERK1/2表达升高；沉默CIAPIN1基因后,干扰NHE1表达或降低其活性进一步促进CIAPIN1下调引起的K562细胞分化,过表达NHE1则逆转该分化过程；沉默CIAPIN1基因后,干扰或过表达NHE1分别引起磷酸化ERK1/2升高和降低,进一步抑制ERK1/2活性则逆转NHE1下调或活性降低引起的K562细胞分化。结论：沉默CIAPIN1基因能促进K562细胞的粒系分化,CIAPIN1可直接靶向NHE1,通过下调NHE1引起K562细胞粒系分化,ERK1/2信号通路参与了该分化过程。CIAPIN1和NHE1可能成为慢性粒细胞白血病的潜在治疗靶点。背景：慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,费城染色体（P11）和bcr-abl融合基因的形成在其发病中发挥了关键作用。伊马替尼为bcr-abl信号传递系统抑制剂,是慢性粒细胞白血病特异性的分子靶向药物。虽然伊马替尼对慢性粒细胞白血病患者尤其是慢性期患者具有很好的疗效,但伴随应用的积累和疾病的进展,仍然不可避免会出现伊马替尼耐药现象。为此,寻找不依赖bcr-abl激酶的新的有效治疗靶点有望解决这一耐药问题。CIAPIN1（cytokine induced apoptosis inhibitor1）是一个新近被证实和凋亡相关的因子,是独立于凋亡调节分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的RAS信号转导通路中的一个新的调节分子。研究表明CIAPIN1基因的表达与肿瘤的发生发展有密切关系,但目前CIAPIN1基因在慢性粒细胞白血病中的作用尚未见报道。伊马替尼通过抑制bcr-abl阳性细胞增殖,促进细胞凋亡来发挥作用,CIAPIN1作为一凋亡相关因子,是否在慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼敏感性中发挥了作用,需要进一步研究探索。目的：以慢性粒细胞白血病细胞系K562为研究对象,探究CIAPIN1基因在K562细胞对伊马替尼敏感性中的作用及相关机制。方法：1、对2011年8月～2012年8月本院收治的14例成人急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）患者,20例急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）患者,37例慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）患者及16例慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL）患者骨髓标本进行研究,并收集8例正常供者骨髓标本为对照。分离单个核细胞,应用实时定量PCR方法检测骨髓单个核细胞中CIAPIN1基因的表达水平。2、利用RNA干扰技术,构建靶向CIAPIN1基因的特异性干扰载体,稳定转染K562细胞。利用MTT实验检测K562细胞体外增殖活性,细胞集落形成实验检测细胞体外克隆形成能力,流式细胞技术检测细胞周期,Hoechst33258染色及Annexin V-APC/PI双染检测细胞凋亡,BALB/C裸鼠体内成瘤实验检测细胞裸鼠体内成瘤性。3、伊马替尼同时处理转染了空载体和CIAPIN1干扰载体的K562细胞。利用MTT实验检测K562细胞体外增殖活性,细胞集落形成实验检测细胞体外克隆形成能力,流式细胞技术检测细胞周期,Hoechst33258染色及AnnexinV-APC/PI双染检测细胞凋亡。4、应用western blotting技术检测Bcl-2和caspase家族凋亡相关蛋白的表达,检测耐药相关蛋白Pgp的表达,检测NF-κB信号通路相关蛋白IKKα、IKKβ、IκBα的表达及磷酸化IKKα/β、磷酸化IκBα的表达;免疫荧光技术观察K562细胞内NF-κB p65的核定位。结果：1、CIAPIN1基因在CML患者骨髓单个核细胞及CML细胞系K562中的表达明显高于正常对照组（P<0.05）。2、成功构建了CIAPIN1稳定干扰的K562细胞系。体外实验表明：沉默CIAPIN1基因降低了K562细胞的增殖活性,抑制了细胞的克隆形成能力,将细胞周期阻滞在G1/S期,对细胞凋亡未见影响。体内实验表明：沉默CIAPIN1基因抑制了K562细胞在BALB/C裸鼠体内的成瘤性。3、伊马替尼处理后,沉默CIAPIN1基因降低了K562细胞的增殖活性,抑制了细胞的克隆形成能力,将细胞周期阻滞在Gl/S期,促进了细胞凋亡。4、伊马替尼处理后,沉默CIAPIN1基因上调了Bid、Bim及cleaved PARP的表达,激活了caspase,下调了Bcl-xl、Bcl-2及Mcl-1的表达；沉默CIAPIN1基因下调了PgP的表达,CIAPIN1与PgP的表达存在正相关性；沉默CIAPIN1后,K562细胞中IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化水平降低,NF-κB的核内定位明显减少,当CIAPIN1沉默的K562细胞经NF-κB特异性抑制剂Bay11-7082（IκB磷酸化抑制剂）处理后,IKKα/β和IκBα的磷酸化水平进一步降低,NF-κB在细胞核内的定位进一步减少,表明NF-κB信号通路活性进一步降低。结论：CIAPIN1表达下调提高了K562细胞对伊马替尼的敏感性,且至少是通过对Bcl-2、caspase家族及Pgp的调节来实现的；NF-κB信号通路在CIAPIN1介导的K562细胞对伊马替尼敏感性中发挥了重要作用。背景：乳腺癌是女性恶性肿瘤中最常见的一种,肿瘤细胞的转移是乳腺癌患者治疗失败和死亡的主要原因,因此深入研究乳腺癌转移的机制无疑是需要迫切解决的一大难题。CIAPIN1是近年来通过克隆表达方法鉴定的一个新的凋亡抑制分子,被证实与多种恶性肿瘤密切相关,而在乳腺癌转移中的作用尚未见报道。钠氢交换蛋白1（Na+/H+exchanger1, NHE1）是在哺乳动物中广泛表达的一种整合膜蛋白,可以促进细胞内的H+和细胞外的Na+交换,从而维持细胞内碱化和细胞外环境酸化的稳态,而这种细胞内外酸碱稳态对于肿瘤的发生、发展至关重要。大量研究已经证实NHE1参与了许多实体瘤的转移,其中包括乳腺癌,但是其详细作用机制尚不清楚。目的：以乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象,探讨CIAPIN1在其转移中的生物学作用及相关机制,并在此基础上初步阐明CIAPIN1和NHE1之间的调控机制,为寻找乳腺癌新的治疗策略提供理论依据。方法：1、采用实时定量PCR和western blotting技术检测CIAPIN1在侵袭能力不同的乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中的表达差异；2、构建CIAPIN1的慢病毒表达载体感染MDA-MB-231细胞,采用划痕实验和transwell实验研究CIAPIN1在MDA-MB-231细胞体外转移中的作用；3、采用实时定量PCR和western blotting技术检测过表达CIAPIN1后NHE1表达的变化,改变NHE1活性,研究NHE1在MDA-MB-231细胞体外转移中的作用及CIAPIN1与NHE1之间的调控关系；4、采用western blotting技术检测过表达CIAPIN1后改变NHE1活性对磷酸化ERK1/2表达的影响,采用ERK1/2信号通路抑制剂PD98059研究其在MDA-MB-231细胞体外转移中的作用及NHE1与ERK1/2之间的调控关系；5、采用western blotting技术检测过表达CIAPIN1后、抑制NHE1活性或/和磷酸化ERK1/2后基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达变化。结果：1、CIAPIN1在MDA-MB-231细胞中的表达低于其在MCF-中的表达；2、过表达CIAPIN1能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭,下调MMP2和MMP9的表达；3、过表达CIAPIN1引起NHE1和磷酸化ERK1/2表达降低；4、过表达CIAPIN1后,抑制NHE1活性进一步抑制MDA-MB-231细胞的体外转移,进一步下调MMP2和MMP9的表达；5、过表达CIAPIN1后,抑制NHE1活性能显着降低ERK1/2的磷酸化水平,同时抑制NHE1活性和ERK1/2磷酸化进一步抑制MDA-MB-231细胞的体外转移,进一步下调了MMP2和MMP9的表达。结论：过表达CIAPIN1能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭。CIAPIN1可直接靶向NHE1,通过下调NHE1抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭,ERK1/2信号通路参与了该过程。CIAPIN1和NHE1是乳腺癌潜在的治疗靶点。
万新星[6]（2014）在《类泛素蛋白质ISG15对慢性粒细胞性白血病细胞及肝癌细胞的作用机制研究》文中研究指明背景与目的：干扰素-αα是细胞分泌的可溶性细胞因子,具有抗病毒、调节免疫功能、抑制细胞生长的作用。干扰素-α具有广谱抗病毒功能,能通过抑制病毒吸附、抑制病毒RNA及DNA合成、增加机体免疫功能等多种机制抑制病毒的增殖；干扰素-α能刺激淋巴细胞形成与分化,促进T细胞生长,激活肿瘤细胞表面抗原,抑制肿瘤细胞免疫逃逸,增强机体对肿瘤细胞的自身清除能力。临床应用干扰素-α能够抑制恶性肿瘤细胞的增殖与转移,并能通过促进免疫反应增加肿瘤细胞的凋亡。慢性粒细胞性白血病严重威胁人们的生存与健康,其发生源自位于9号染色体的abl基因与位于22号染色体的bcr基因异位并融合形成bcr-abl嵌合基因,bcr-abl嵌合基因可编码具有强酪氨酸激酶活性的p210BCR-ABL融合蛋白质,P210BCR-ABL可持续激活细胞分裂,抑制细胞凋亡,最终导致细胞恶性增殖并形成肿瘤。干扰素-αα是治疗慢性粒细胞性白血病的里程碑药物,干扰素-αα能通过刺激Janus激酶-信号转导子与转录激活子等途径有效缓解慢性粒细胞性白血病病程,减少慢性粒细胞性白血病细胞中P210BCR-ABL融合蛋白质的表达从而改善患者的症状,并能显着提高患者的生活质量,是目前治疗慢性粒细胞性白血病的常用药物。肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,干扰素-α能有效抑制肝癌的生长,具有较好疗效。ISG15是干扰素刺激基因15的表达产物,经干扰素诱导而高水平表达,因其结构与泛素类似,故又称泛素交叉反应蛋白质。ISG15在其级联酶系的参与下能将自身羧基端LRLRGG残基与目标蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基共价结合。ISG15能够修饰RNA转录、剪接、翻译过程中的多种蛋白质,因此具有多种生物学功能。目前已经证明ISG15在抗病毒、抗肿瘤方面具有重要作用。ISG15能阻断多种DNA及RNA病毒的复制与释放,具有广谱抗病毒功能,是介导干扰素-αα抗病毒效应的关键功能蛋白质；ISG15及其级联酶系通过修饰多条信号通路的相关蛋白质,在许多肿瘤细胞中发现ISG15及其级联酶系表达异常。ISG15抗肿瘤的机制十分复杂,至今仍未完全阐明,研究ISG15在肿瘤细胞中的功能及其作用机制能为肿瘤治疗提供新的思路和靶向治疗位点。方法：构建穿梭载体PCDNA3.1（+）-ISG15,并转染入慢性粒细胞性白血病KT1细胞（含对干扰素-αα敏感的KT1/A3细胞及对干扰素-αα耐受的KT1/A3R细胞）和肝癌HepG2细胞。在慢性粒细胞性白血病KT1细胞中,通过细胞计数、流式细胞术等手段研究加入干扰素-α、转染PCDNA3.1（+）对照、转染PCDNA3.1（+）-ISG15、沉默ISG15及其激活酶UBE1L/解聚酶USP18的KT1细胞与对照KT1细胞在细胞增殖、凋亡等方面的变化,分析ISG15在慢性粒细胞性白血病KT1细胞中的功能；并通过检测不同处理条件下各组细胞P53、P21及Caspase3酶活性与ISG15的关系来研究ISG15行使该功能的分子机制。在肝癌HepG2细胞中,通过流式细胞术分析HepG2细胞在加入干扰素-αα、转染PCDNA3.1（+）对照及转染PCDNA3.1（+）-ISG15后HepG2细胞的凋亡率及周期变化来研究ISG15对HepG2细胞的作用；利用激光共聚焦显微镜对ISG15在各处理组HepG2细胞中进行亚细胞定位；检测不同条件下肝癌HepG2细胞中P53.P21、UBE1LUSP18、蛋白质ISG15修饰及蛋白质泛素化修饰水平来研究ISG15的具体分子机制。结果：（1）干扰素-α处理KT1/A3细胞后能抑制KT1/A3细胞增殖,促进KT1/A3细胞凋亡,但对KT1/A3R细胞增殖的抑制作用不明显；（2）过表达ISG15能够促进KT1/A3细胞及KT1/A3R细胞的凋亡；（3）干扰素-αα处理及过表达ISG15能增加KT1/A3细胞中P53、P21及ISG15的表达,但干扰素-αα处理不能提高KT1/A3R细胞中P53的表达,过表达ISG15后KT1/A3R细胞中P53和P21表达水平明显增加；（4）沉默ISG15或其激活酶UBE1L后干扰素-α抑制KT1/A3细胞增殖的能力被逆转；（5）在ISG15表达的情况下,沉默ISG15解聚酶USP18能够抑制KT1细胞增殖；（6）沉默ISG15或UBE1L后,KT1细胞中P53及P21的表达受抑制,在ISG15表达时沉默USP18后,KT1细胞中P53与P21的表达增加；（7）干扰素-α处理不能抑制HepG2细胞增殖,过表达ISG15能够抑制HepG2细胞增殖；（8）ISG15分布在HepG2细胞的细胞核和细胞浆中；（9）干扰素-α处理HepG2细胞后UBE1L与USP18表达增加,但并未见P53、P21表达水平提高,蛋白质泛素化修饰水平也未增加；（10）过表达ISG15后HepG2细胞内P53、P21表达上调,蛋白质泛素化修饰水平及蛋白质的ISG15修饰水平提高,但UBE1L与USP18表达变化不明显。结论：（1）慢性粒细胞性白血病KT1/A3细胞对干扰素α敏感、KT1/A3R细胞对干扰素α不敏感；（2）ISG15通过上调P53及P21的表达抑制慢性粒细胞性白血病细胞增殖,且ISG15促慢性粒细胞性白血病凋亡的能力依赖于P53表达；（3）干扰素α不能诱导肝癌HepG2细胞中P53与P21的表达,也不能抑制HepG2细胞增殖；（4）过表达ISG15能够增加HepG2细胞中P53与P21的含量,并能抑制HepG2细胞增殖。
何金花,黎毓光,谢杏仪,陈顺仪,王莉,邹茂贤,黄国贤[7]（2012）在《hsa-miR-203真核表达载体的构建及对K562细胞增殖与凋亡的影响》文中认为目的构建hsa-miR-203（人微小非编码RNA-203）的真核表达载体,观察其对人慢性粒细胞白血病细胞株（K562）增殖和凋亡的作用。方法构建hsa-miR-203靶向基因的真核表达载体PmiR-203,用脂质体转染法将PmiR-203转染K562细胞;可溶性噻唑盐-8（WST-8）法检测转染后的K562细胞增殖的情况,流式细胞术检测转染后K562细胞的早期凋亡率,实时荧光定量RT-PCR检测bcr/abl mRNA的表达水平,比色法测定caspase-3、caspase-9的活性。结果本法成功构建了重组真核表达载体PmiR-203,流式细胞术结果表明,K562细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达率52.6%。PmiR-203转染K562细胞48 h后,能明显抑制K562细胞的增殖,并促进细胞的早期凋亡。实时荧光定量RT-PCR结果表明,不同浓度的PmiR-203能显着下调bcr/ablmRNA的表达水平,转染后K562细胞的caspase-3、caspase-9的活性明显增强。结论成功构建了hsa-miR-203的真核表达载体PmiR-203,后者主要通过下调bcr/abl融合基因的表达抑制K562细胞的增殖,并通过活化caspase-3、caspase-9促进K562细胞的早期凋亡。
刘玥[8]（2012）在《miR-196b和miR-30a在慢粒发病机制中的功能与表达调控研究》文中研究表明慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia, CML）,简称慢粒,是一种发生在造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病,是我国慢性白血病中最常见的一种类型。95%的慢粒具有Ph染色体,即特异性的t（9；22）（q34；q11）核型,并存在BCR-ABL1融合基因的表达。Ph染色体是9号和22号染色体长臂易位的结果,易位使9号染色体长臂（9q34）上的原癌基因ABL和22号染色体（22q11）上的BCR基因重新组合成BCR-ABL1融合基因。不同的BCR-ABL1融合基因类型与疾病表型相关。BCR-ABL1融合基因中,主要由ABL段携带细胞恶变的主要信息,ABL1属Abelson（白血病病毒）家族的非受体酪氨酸激酶,目前主要用于在恶性肿瘤中的研究,而BCR段的断裂位点主要影响疾病表型。在慢粒中,BCR-ABL1融合基因转录为8.5kb的mRNA,并进一步翻译产生分子质量为210KD的BCR-ABL1融合蛋白P210BCR/ABL,该蛋白具有异常酪氨酸激酶活性,其中ABL的SHl结构域TK活性异常,导致与ATP结合,使与ABL结合的信号转导蛋白发生磷酸化而激活,并作用于一系列下游的信号传导通路,包括RAS-MAPK通路、JAK-STAT通路、PI-3K激酶通路、MYC通路等,不但干扰调节细胞因子的增殖和抑制凋亡,而且引起造血干细胞调节生长和分化的必须黏附程序的缺失,最终导致骨髓祖细胞大量增生、凋亡减少与骨髓基质细胞粘附性下降,使大量不成熟的髓细胞释放到外周血,导致慢粒的发生。因此,BCR-ABL1融合基因被认为是慢粒发病的分子病理基础,也是慢粒诊断、疗效观察、预后等监测的有效指标。近年来以BCR-ABL1为靶点的研究主要集中在酪氨酸激酶抑制剂和相关信号转导通路上,和miRNA相关的研究很少。miRNA是一类长21-25nt的小分子非编码单链RNA的总称,由大约70nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来,能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶mRNA降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。miRNA在表达上具有组织和时间的特异性,是调节其他功能基因表达的重要调控分子,参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。miRNA表达与多种肿瘤相关,大约50%得到注解的niRNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragilesite）,这说明miRNA在肿瘤发生过程中起至关重要的作用。研究表明,microRNAs与肿瘤形成相关,既能发挥肿瘤抑制基因的作用,也能起到癌基因的作用。一个起肿瘤抑制基因作用的（?）niRNA表达下降或者缺失可能是由于miRNA生物合成的任何步骤发生缺陷造成的,而这最终将导致不适当的miRNA靶基因表达,最后可能导致细胞过度增殖、侵入、凋亡减少、不能正常分化或者去分化,引起肿瘤的形成。具有癌基因功能的（?）niRNA过表达也将导致肿瘤发生,在这种情形下,由于miRNA基因的扩增,持续性的启动子活性,miRNA加工的效率增高,或是miRNA的稳定性提高等,导致在异常组织或是不适当发育阶段这些miRNA的表达增加,导致其靶基因（抑癌基因）表达下降,引起肿瘤发生。本研究首先采用多个生物信息学预测软件预测靶基因可能是BCR-ABL1的miRNA,相关预测软件包括TargetScan、PicTa、miRBase、miRanda、Mirnaviewer、 DIANA TarBase,预测结果表明靶基因可能是BCR-ABL1的miRNA包括miR-196b和miR-30a;其次对miR-196b和miR-30a用生物信息学软件预测和慢粒关系密切的靶基因,综合各个软件的预测结果,表明miR-196b可能的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9, miR-30a可能的靶基因包括BCR-ABL1,因此本课题拟以miR-196b和miR-30a为研究对象,研究其在慢粒中的功能和表达调控。首先,以K562细胞总RNA为模板,扩增BCR-ABL1mRNA3’UTR序列和HOXA9mRNA3’UTR序列,与psiCHECKTM-2vector连接,构建重组质粒psiCHECKTM-2-BCR-ABL1-3’UTR、psiCHECKTM-2-HOXA9-3’UTR。其次,以重组质粒psiCHECKTM-2-BCR-ABLl-3’UTR、psiCHECKTM-2-HOXA9-3’UTR为模板,进行亚克隆。采用SOE的方法,扩增BCR-ABL1-3’UTR中niR-196b、 miR-30a结合位点种子序列分别突变的序列,扩增HOXA9-3’UTR中miR-196b结合位点的2个种子序列突变的序列,构建重组质粒psiCHECKTM-2-BCR-ABL1-3’UTR-Mutant-196b、psiCHECKTM-2-BCR-ABL1-3’UTR-Mutant-30a、psiCHECKTM-2-HOXA9-3’UTR-Mutant。其次,采用双荧光素酶报告基因检测系统进行靶基因的确认。设立mimics组、NC组、mutant组和mock组进行实验,在293T细胞中进行转染,48h后检测各组荧光值,结果用SPSS13.0的One Way ANOVA进行分析。统计分析结果表明196b mimics+ABL1和四个对照组间均存在显着性差异（P<0.05）,即196bnimics降低了荧光值,而四个对照组间无显着性差异（P>0.05）,表明miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1;196b mimics+HOXA9和四个对照组间均存在显着性差异（P<0.05）,即196bmimics降低了荧光值,而四个对照组间无显着性差异（P>0.05）,表明miR-196b的靶基因包括HOXA9;30a mimics+ABL1和四个对照组间均存在显着性差异（P<0.05）,即30amimics降低了荧光值,而四个对照组间无显着性差异（P>0.05）,表明miR-30a的靶基因包括BCR-ABL1。为了进一步验证miRNA和靶基因的对应关系,我们对niR-196b和1niR-30a进行功能学研究。首先,以人基因组DNA为模板,扩增miR-196b前体pre-miR-196b和miR-30a前体pre-miR-30a,与载体plVTHM连接,构建慢病毒表达载体plVTHM-miR-196b和plVTHM-miR-30a。慢病毒表达载体分别和质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞,包病毒,用病毒液感染K562细胞,构建过表达lniR-196b细胞和过表达miR-30a细胞,并研究miRNA过表达细胞的增殖、周期、miRNA的表达,以及BCR-ABL1和HOXA9的表达。其次,对miRNA过表达细胞转染miRNA inhibitor,降低细胞中miRNA的表达,检测细胞的增殖、周期和BCR-ABL1和HOXA9的表达,判断回复情况。最后,对靶基因BCR-ABL1和HOXA9转染相应的siRNA,检测细胞的增殖、周期和BCR-ABL1和HOXA9的表达,判断细胞功能是否和过表达miRNA细胞功能一致。结果表明在K562细胞中过表达miR-196b后,细胞增殖明显抑制,G2期阻滞,：niR-196b表达升高,BCR-ABL1蛋白和HOXA9蛋白表达下降。在过表达miR-196b细胞中抑制miR-196b的表达后,细胞增殖增强（P<0.05）,周期恢复,BCR-ABL1蛋白和HOXA9蛋白水平均升高。在K562细胞中过表达miR-30a后,细胞增殖明显抑制,G1期阻滞,miR-30a表达升高,BCR-ABL1蛋白表达下降。在过表达niR-30a细胞中抑制miR-30a的表达后,细胞增殖增强（P<0.05）,周期恢复,BCR-ABL1蛋白水平明显升高。在K562细胞中转染ABL1siRNA后,BCR-ABL1mRNA水平下降,BCR-ABL1蛋白水平下降,细胞增殖抑制（P<0.05）,G1期阻滞,和：miR-30a过表达细胞增殖情况基本一致。在K562细胞中转染HOXA9siRNA后,HOXA9mRNA水平下降,HOXA9蛋白表达水平下降,细胞增殖抑制（P<0.05）,G1期阻滞,增殖比过表达miR-196b细胞快一些。细胞过表达研究和抑制表达研究的结果进一步证明：miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9, miR-30a的靶基因包括HOXA9,且在慢粒中miR-196b和miR-30a都起到肿瘤抑制作用。miRNA的表达常常和表观遗传有关,表观遗传指DNA序列并不发生变化而基因表达却发生了可遗传的改变,其主要机制是由细胞内除遗传信息以外的其他可遗传物质所诱发且在细胞发育和增殖过程中能够稳定传递。表观遗传现象种类很多,但DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传现象最常见,且与恶性肿瘤发生发展密切相关,特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活和N端结构域转录后修饰,使DNA甲基化和组蛋白修饰成为目前表观遗传学和表观基因组学在肿瘤研究领域内重要分支。DNA甲基化主要包括整个基因组去甲基化和部分区域高度甲基化,其中DNA去甲基化在肿瘤发生发展中的作用尤为明显,另外组蛋白修饰也是基因表达调控以及诱发肿瘤形成的重要表观遗传机制之一。许多研究揭示,miRNA受甲基化和组蛋白修饰等表观遗传机制调控,表观遗传对miRNA分子产生重要的调控且直接参与肿瘤发生发展等过程。因此本课题下一步将研究miR-196b和]miR-30a在慢粒中的表达是否和表观遗传调控有关。首先,采用去甲基化药物5-Aza-2’-dc处理K562细胞,检测K562处理前后细胞的周期、凋亡、miR-196b和miR-30a的表达、BCR-ABL1和HOXA9的表达变化。其次,对miR-196b和miR-30a启动子CpG岛进行预测,并采用BSP法检测K562细胞在5-Aza-2’-dc处理前后miR-196b启动子CpG岛甲基化水平,根据BSP结果选出一段甲基化程度比较高、处理前后变化比较大的序列在临床样本中进行检测。最后,提取16例慢粒患者和10例正常人总RNA,检测miR-196b和miR-30a的表达水平,提取45例白血病患者和10例正常人基因组,采用MSP法检测miR-196b启动子CpG岛甲基化水平,采用SPSS13.0的多样本率比较χ2检验对MSP的结果进行统计学分析。K562细胞中的研究结果表明,K562用5-Aza-2’-dc处理后,G2期发生阻滞,增殖抑制,出现凋亡。K562细胞中miR-196b启动子CpG岛高甲基化,用甲基化转移酶抑制剂处理后,甲基化水平下降,BCR-ABLl蛋白和HOXA9蛋白水平均下降,但miR-196b的表达并未恢复,提示降低miR-196b启动子CpG岛甲基化水平,可使miR-196b的靶基因BCR-ABL1和HOXA9表达下降,但该作用是否通过改变miR-196b的表达来实现,需进一步研究。临床样本研究表明,慢粒患者中miR-196b的表达低于正常人,统计各类型白血病和正常人中甲基化阳性和甲基化阴性的比例,结果采用多样本率比较χ2检验进行分析,结果表明各类型样本间差异有显着性意义（P<0.05）,其中CML中miR-196b启动子CpG岛甲基化和正常人相比有显着性差异（P<0.05）,且CML中miR-196b启动子CpG岛甲基化阳性率高于正常人。结合细胞和临床样本研究结果,我们得到结论：慢粒中miR-196b低表达,降低miR-196b启动子CpG岛甲基化水平,可导致其靶基因BCR-ABL1和HOXA9表达下降,提示miR-196b启动子CpG岛高甲基化可能和慢粒发病有关。关于miR-30a （?）临床样本的研究表明,慢粒患者中miR-30a的表达低于正常人,细胞功能学研究表明miR-30a在慢粒中是抑癌基因,因此推测miR-30a的低表达和慢粒的发生机制有关,但是miR-30a启动子没有预测到有CpG岛,因此推测niR-30a的表达降低和miR-30a启动子CpG岛甲基化水平无关,另有其它机制,如niR-30a启动子发生突变,miR-30a存在杂合性缺失等,具体机制有待进一步研究。综上所述,本课题在生物信息学预测的基础上,采用双荧光素酶报告基因检测系统初步确认了miR-196b和miR-30a的靶基因,接着在K562细胞中进行了过表达和抑制表达研究,阐明了慢粒中miR-196b和：miR-30a的功能,证明了miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9, miR-30a的靶基因包括BCR-ABL1,且在慢粒中miR-196b和niR-30a都起到肿瘤抑制作用。最后采用BSP法检测了K562细胞在用去甲基化药物处理前后miR-196b启动子CpG岛甲基化水平,并采用MSP法检测了45例白血病患者和10例正常人中miR-196b启动子CpG岛甲基化情况,并检测了miR-196b和1niR-30a在慢粒和正常人中的表达,结果提示慢粒中miR-196b启动子CpG岛的高甲基化可能和miR-196b的低表达有关,miR-196b的低表达是引起慢粒发病的机制之一,也为慢粒的治疗提供了一个潜在靶点。结果也表明miR-30a在慢粒中低表达且起到肿瘤抑制作用,推测1niR-30a的低表达和慢粒的发生机制有关,具体机制尚需进一步研究。
王艳芳,苏丽萍,周永安[9]（2010）在《bcr-abl基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达》文中进行了进一步梳理目的构建慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的真核表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7中高效表达。方法提取慢性粒细胞白血病K562细胞的RNA,经RT-PCR技术扩增得到bcr-abl基因后,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,并进行PCR和酶切鉴定。鉴定为阳性的克隆,再进一步进行测序分析。将构建成功的真核表达载体转入COS-7细胞中进行瞬时表达。结果反转录PCR扩增后的产物,经琼脂糖凝胶电泳可以在约874 bp处看见一特异性的条带,序列分析证明扩增产物与GeneBank中的bcr-abl基因序列相同。将pEGFP-bcr-abl真核表达载体转入COS-7细胞后,经RT-PCR、Western blotting检测证明表达产物正确。结论成功构建了含有bcr-abl融合基因的真核表达质粒,从而为进一步研究其结构和功能,寻找CML诊疗的新方法奠定了基础。
林蔡弟[10]（2010）在《bcr/abl融合基因特异性多重siRNAs真核表达载体的构建》文中研究指明研究背景:慢性髓细胞性白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病,其发病机制为染色体易位t（9;22）（q34;q11）,由于bcr基因断裂点的不同,产生不同的bcr/abl融合基因,CML最主要的是b3a2这一型融合（95%以上）,其表达的P210BCR/ABL融合蛋白具有异常增强的酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosinekinase,PTK）活性,通过改变造血细胞内一系列信号传导途径,调控细胞的粘附、增殖和凋亡,导致细胞恶性扩增而致病。因此探索有效抑制bcr/abl融合基因,下调P210BCR/ABL的形成,或拮抗P210BCR/ABL的PTK活性以及阻断P210BCR/ABL介导的传导通路等已成为治疗的新策略。人工合成的P210BCR/ABLPTK抑制剂（TKI）甲磺酸伊马替尼（ST1571,商品名格列卫）,可特异性阻断P210BCR/ABL的酪氨酸激酶活性,在CML临床应用中已取得良好疗效,使CML的治疗进入一个新的时代。然而,有部分病人出现不能耐受的毒副作用,还有部分病人逐渐出现耐药,耐药的主要原因为bcr/abl基因上的点突变、bcr/abl基因过度扩增和表达,虽然目前第二代的酪氨酸激酶抑制剂尼洛替尼、达沙替尼能解决大部分耐药问题,但难免也会逐渐出现耐药,而且这种TKI的作用靶点是bcr/abl融合基因下游的融合蛋白,并不能真正解决bcr/abl融合基因之病根,理论上说不能治愈CML,因此针对bcr/abl融合基因作为理想分子靶点的基因治疗也是研究的热点之一。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是最近十几年发展起来的一项新兴的在转录后水平的基因阻断技术,与以往的基因阻断技术比较,如基因敲除、反义寡核苷酸技术等,RNAi更具有快速、有效和序列特异性强等优点。已有研究证明,针对bcr/abl mRNA融合位点设计的siRNA能够显着下调K562细胞中bcr/abl基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。但是这种体外化学合成的siRNA很容易降解,不稳定,产生的RNAi效应短暂。筛选高效siRNA和使之持久稳定的表达,利用真核表达载体在哺乳动物细胞内合成表达有发卡结构的siRNA,是体外合成siRNA有效的替代方案,这种方案更接近生物体产生RNAi现象的自然机制并有可能用于基因治疗。本实验利用本课题组先前构建好的一系列可包含1～6个siRNA表达单位的表达型载体,首先设计构建针对bcr/abl融合基因的单一siRNA真核细胞表达载体,转染K562细胞株,检测细胞株bcr/abl mRNA及BCR/ABL融合蛋白的表达水平,证实该表达载体能在细胞内发生作用,并对bcr/abl基因有干扰效应;然后在此研究基础上,我们设计构建针对bcr/abl融合基因的多重siRNAs表达型载体,来放大和强化这种siRNA的RNAi效应,为进一步探索CML的基因治疗提供一种新的手段。目的:构建针对bcr/abl融合基因的多重siRNAs真核表达载体,为进一步探索siRNA的体内研究及CML基因治疗的新策略,提供一种技术手段。方法:第一部分bcr/abl融合基因单个siRNA真核表达载体的构建与鉴定1. K562白血病细胞株在加有10%胎牛血清的RPMI1640培养基,5%CO2条件下37℃培养。2.根据文献已证实有效的、针对bcr/abl基因特异性siRNA序列,将模板序列克隆至p1-siRNA质粒中,并酶切、测序鉴定。3.用脂质体LipofectamineTM LTX将测序正确的重组子转染至K562细胞株中,利用RT-PCR、Western Blot方法检测转染后细胞株中bcr/abl mRNA和BCR/ABL融合蛋白的表达水平,以及通过MTT法检测转染后细胞增殖情况和使用Annexin V联合PI法流式细胞仪检测细胞凋亡情况,这样不仅再次验证所选siRNA序列的有效性,同时也证明我们所选用的这一siRNA真核表达载体系统的有效性。第二部分bcr/abl融合基因的多重siRNAs真核表达载体的构建在上述证实siRNA序列和siRNA表达载体系统有效的基础上,重复性将相同的和不同的siRNA接入含多个siRNA表达单位的载体p6-siRNA中,构建针对bcr/abl基因的多重siRNAs真核表达型载体。结果:1.经酶切、测序验证,bcr/abl融合基因的siRNA真核表达载体的模板序列与设计序列完全正确,成功构建p1-siRNA1、p1-siRNA2和p1-siRNAn质粒。2.通过阳离子脂质体LipofectamineTM LTX将p1-siRNA1和p1-siRNA2、p1-siRNAn质粒以及GFP阳性对照质粒瞬时转染到K562细胞株中,经荧光显微镜观察绿色荧光,估计转染效率:约30%。3.转染特异性质粒p1-siRNA1和非特异性质粒p1-siRNAn的K562细胞株比较:bcr/abl mRNA水平降低了27.6%,BCR/ABL蛋白表达水平下降了30.6%;再比较相应的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率,分别为40.1% vs 16.5%和9.65% vs 1.79%。同样,简单地比较了转染特异性质粒p1-siRNA2和非特异性质粒p1-siRNAn的K562细胞株的bcr/abl mRNA水平降低了28.7%。由以上结果证明所选择的两个siRNA序列和siRNA真核表达载体系统确实有效,因此可以继续构建bcr/abl融合基因的多重siRNA真核表达载体。4.经酶切、测序验证,bcr/abl融合基因的多重siRNA真核表达载体的模板序列与设计序列完全正确,成功构建针对bcr/abl融合基因的多重siRNAs真核表达载体。结论:1.我们所构建的针对bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体p1-siRNA1质粒通过阳离子脂质体LipofectamineTM LTX转染到K562细胞株中,经RT-PCR和Western Blot、MTT试验以及流式细胞仪等方法分析,结果表明针对bcr/abl基因的siRNA真核表达载体p1-siRNA1和p1-siRNA2对K562细胞株具有一定的干扰效果。说明这一种表达型载体能在细胞内产生RNA干扰效应。2.我们在上述研究的基础上,设计构建多重的siRNAs真核表达载体,经测序验证,针对bcr/abl融合基因多重siRNAs真核表达载体构建成功,可用于后续的实验,为进一步研究探索CML基因治疗提供工具。
二、抗慢性粒细胞性白血病bcr/abl mRNA真核表达载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗慢性粒细胞性白血病bcr/abl mRNA真核表达载体的构建（论文提纲范文）
（1）Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 Skp-2 在恶性肿瘤发生机制中的作用 |
| 参考文献 |
（2）基于重组MS2病毒样颗粒的急性早幼粒白血病PML-RARα融合基因检测质控品及其应用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 实验材料和试剂配制 |
| 1.1.1. 仪器 |
| 1.1.2. 菌株和质粒 |
| 1.1.2.1. 宿主细菌 |
| 1.1.2.2. 表达质粒 |
| 1.1.2.3. 克隆质粒 |
| 1.1.3. 主要实验耗材 |
| 1.1.4. 主要实验试剂 |
| 1.1.5. 培养基和溶液的配制 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. 内含PML-RARα融合基因L/S/V、内参基因和23s rRNA序列的重组病毒样颗粒原核表达载体的构建 |
| 1.2.1.1 提取pACYC-MS2质粒 |
| 1.2.1.2 PML-RARα融合基因亚型L/S/V、内参基因和23s rRNA目的序列的选择 |
| 1.2.1.3. 获取PML-RARα融合基因亚型L/S/V、内参基因和23s rRNA目的序列 |
| 1.2.1.3.1 外周血总RNA提取 |
| 1.2.1.3.2 大肠杆菌基因组DNA提取 |
| 1.2.1.3.3 总RNA逆转录 |
| 1.2.1.3.4 目的基因的PCR扩增 |
| 1.2.1.3.5 目的基因片段鉴定及纯化回收 |
| 1.2.1.3.6 目的基因片段与pMD18-T载体的连接 |
| 1.2.1.3.7 连接产物向凡E.Coli Top10的转化 |
| 1.2.1.3.8 阳性克隆菌落的鉴定 |
| 1.2.1.3.9 质粒的提取 |
| 1.2.1.4. 使用加入酶切位点的引物PCR目的序列并纯化PCR产物 |
| 1.2.1.5. 插入片段与目的载体pACYC-Duet1的双酶切 |
| 1.2.1.6. 目的片段与载体连接 |
| 1.2.1.7. 连接产物转化Top 10 E.Coli感受态细胞 |
| 1.2.1.8. 质粒小量提取 |
| 1.2.1.9. 鉴定重组质粒 |
| 1.2.1.10. 测序鉴定 |
| 1.2.2. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 1.2.2.1. 提取pACYC-MS2-PML-RARα L/V/S,pACYC-MS2-CGs和pACYC-MS2-23s rRNA重组质粒 |
| 1.2.2.2. 重组质粒DNA的浓度定量和纯度鉴定 |
| 1.2.2.3. pACYC-MS2-PML-RARα L/V/S,pACYC-MS2-CGs和pACYC-MS2-23srRNA重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌 |
| 1.2.2.4. 重组病毒样颗粒在BL21(DE3)大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.2.5. 超声破碎 |
| 1.2.2.6. PEG 6000富集重组病毒样颗粒 |
| 1.2.2.7. 丙烯葡聚糖凝胶层析纯化重组病毒样颗粒 |
| 1.2.3. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 1.2.3.1. 琼脂糖凝胶电泳鉴定重组病毒样颗粒 |
| 1.2.3.2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析鉴定 |
| 1.2.3.3. RT-PCR鉴定重组病毒样颗粒内包装的目的RNA |
| 1.2.3.4. 透射电子显微镜鉴定重组病毒样颗粒 |
| 1.2.3.5. 重组病毒样颗粒的耐酶性实验 |
| 1.2.4. APL临床模拟病例的设计 |
| 1.2.5. 模拟白细胞样本的制备 |
| 1.2.5.1. E.Coli 23 rRNA MS2 VLPs添加量的确定 |
| 1.2.5.2. 阳性模拟白细胞样本AR-FG L/V/S和AR-CG s配比的棋盘格筛选 |
| 1.2.5.3. 模拟白细胞样本EQA样本盘的配制 |
| 1.2.5.4. 模拟白细胞样本EQA样本盘的验证 |
| 1.2.6. 报告单评分标准 |
| 1.2.7. 急性早幼粒白血病模拟白细胞样本作为质控样本开展全国PML-RARα融合基因临床检测流程室间质量评价 |
| 1.2.7.1. PML-RARα融合基因临床检测流程室间质量评价方案 |
| 1.2.7.2. 白细胞模拟样本EQA样本盘的建立 |
| 1.2.7.3. 白细胞模拟样本的稳定性评价 |
| 1.2.7.4. 白细胞模拟样本EQA样本盘的发放 |
| 1.2.8. 室间质评活动评分标准 |
| 1.2.9. 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1. 内含PML-RARα融合基因L/S/V、内参基因和23s rRNA序列的重组病毒样颗粒原核表达载体的构建 |
| 2.1.1. PCR扩增PML-RARα融合基因L/S/V、内参基因和23s rRNA序列目的片段 |
| 2.1.2. pACYC-MS2PML-RARα L/V/S,pACYC-MS2-CGs和pACYC-MS2-23srRNA重组载体的验证 |
| 2.2. PML-RARα FG L/V/S盔甲RNA (AR-FG L/V/S),chimeric CGs盔甲RNA(AR-CGs)和23s rRNA盔甲RNA (AR-23s)的表达和纯化 |
| 2.3. 重组MS2盔甲RNA的鉴定 |
| 2.3.1. 琼脂糖凝胶电泳鉴定重组MS2盔甲RNA |
| 2.3.2. SDS-PAGE鉴定重组MS2盔甲RNA |
| 2.3.3. RT-PCR鉴定重组MS2盔甲RNA内含目的RNA序列 |
| 2.3.4. 透射电子显微镜鉴定重组MS2盔甲RNA |
| 2.4. 模拟白细胞样本的配制及EQA样本盘制作 |
| 2.4.1. E.Coli 23 rRNA盔甲RNA添加量的确定 |
| 2.4.2. 阳性模拟白细胞样本AR-FG L/V/S和AR-CG s配比的棋盘格筛选 |
| 2.4.3. 模拟白细胞样本EQA样本盘的配制 |
| 2.4.4. 模拟白细胞样本EQA样本盘的验证 |
| 2.4.5. 样本盘的稳定性实验 |
| 2.5. 模拟白细胞样本的PML-RARα临床检测流程室间质量评价 |
| 2.5.1. 模拟白细胞样本EQA样本盘的实验室分布和响应 |
| 2.5.2. PML-RARα临床检测流程室间质量评价结果 |
| 2.5.3. 临床检验报告规范完整性 |
| 2.5.4. 临床治疗的响应与调整 |
| 3. 讨论 |
| 3.1. 模拟白细胞样本性能验证 |
| 3.2. 白血病相关融合基因入院诊断筛查检测 |
| 3.3. PML-RARα融合基因RT-qPCR定性检测 |
| 3.4. PML-RARα融合基因RT-qPCR定量检测 |
| 3.5. 临床检验报告评分 |
| 3.6. 临床治疗方案及调整 |
| 3.7. 模拟白细胞样本总RNA的提取 |
| 3.8. 研究结论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 急性早幼粒细胞白血病中RARA融合基因概述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1: pACYCDuet-1载体详细信息 |
| 附录2: pMD18-T载体信息 |
| 附录3: 早幼粒白血病基因(PML) mRNA基因序列 |
| 附录4: 视黄酸受体α基因(RARA) mRNA基因序列 |
| 附录5: PML-RARα L/V/S,嵌合内参基因,23srRNA目的区域DNA序列 |
| 附录6: 表达载体pACYC-MS2-PML-RARα L/V/S,pACYC-MS2-CGs和pACYC-MS2-23s rRNA目的序列测序比对结果 |
| 附录7: APL临床模拟病例 |
| 附录8: 临床基因检验诊断报告模板 |
| 附录9: 室间质量评价调查活动安排及注意事项(样本号:A1711-A1715;C1731-C1736) |
| 附录10: 室间质量评价调查活动安排及注意事项(样本号:B1721-B1725;C1731-C1736) |
| 附录11: 室间质量评价调查活动结果回报表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）核糖体蛋白RPS15A促进白血病U937细胞恶性增殖的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 基因RPS15A RNAi及其过表达慢病毒载体的构建与病毒包装 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要细胞株与载体 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建靶向人基因RPS15A的shRNA慢病毒干扰载体 |
| 2.2.2 构建过表达基因RPS15A的慢病毒表达载体 |
| 2.2.3 重组慢病毒Lenti-shRPS15A和Lenti-oeRPS15A的包装 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 pLenti-shRPS15A慢病毒载体质粒的构建和鉴定 |
| 3.1.1 pLenti-shRPS15A慢病毒载体酶切结果 |
| 3.1.2 阳性克隆PCR鉴定 |
| 3.1.3 阳性克隆pLenti-shRPS15A测序结果 |
| 3.2 pLenti-oeRPS15A慢病毒过表达载体质粒的构建和鉴定 |
| 3.2.1 目的基因RPS15A的扩增 |
| 3.2.2 阳性克隆PCR鉴定 |
| 3.2.3 阳性克隆pLenti-oeRPS15A测序结果 |
| 3.3.4 慢病毒滴度测定 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 敲减及过表达RPS15A基因后白血病细胞增殖和凋亡的改变 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要细胞株 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 慢病毒在目的细胞中的感染效率检测 |
| 2.2.3 qPCR检测检测目的基因mRNA表达 |
| 2.2.4 Western blot检测目的蛋白表达 |
| 2.2.5 MTT法检测细胞增殖 |
| 2.2.6 PI检测细胞周期 |
| 2.2.7 Annexin V-APC/7-AAD双染色检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 慢病毒Lenti-shRPS15A和Lenti-oeRPS15A感染U937细胞的情况 |
| 3.2 qPCR检测慢病毒感染U937细胞后RPS15A mRNA水平表达 |
| 3.3 Western blot检测慢病毒感染U937细胞后RPS15A蛋白水平表达 |
| 3.4 MTT法检测病毒感染U937细胞的增殖情况 |
| 3.5 流式分析法检测病毒感染U937细胞后的细胞周期的情况 |
| 3.6 流式细胞术检测RNAi慢病毒感染U937细胞后细胞凋亡的情况 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三部分 RPS15A对基因表达谱变化的研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 抽提总RNA |
| 2.2.3 RNA质量检测 |
| 2.2.4 RNA的纯化 |
| 2.2.5 总RNA的放大和标记 |
| 2.2.6 芯片杂交 |
| 2.2.7 芯片洗涤 |
| 2.2.8 芯片扫描 |
| 2.2.9 数据分析和统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 质检结果 |
| 3.2 数据分析 |
| 3.2.1 差异表达谱分析 |
| 3.2.2 差异基因验证 |
| 3.2.3 差异基因的基因本体论(Gene ontology,GO)富集分析 |
| 3.2.4 差异基因的通路(pathway)富集分析 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）三氧化二砷联合miR-203对人白血病K562细胞的抑制作用及其机制（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要材料及试剂 |
| 1.3 Real-time PCR检测转染pmiR-203对K562细胞内miR-203表达水平的影响 |
| 1.4 MTT法检测高表达miR-203联合As2O3对K562细胞的增殖抑制作用 |
| 1.5 流式细胞术检测高表达miR-203联合As2O3对K562细胞凋亡的影响 |
| 1.6 Western blotting检测高表达miR-203联合As2O3对K562细胞内Bcr/abl蛋白表达的影响 |
| 1.7 Bcr/abl 3'UTR和Bcr/abl mut-3'UTR双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.8 荧光素酶活性分析 |
| 1.9 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 K562细胞内miR-203的相对表达水平 |
| 2.2 过表达miR-203联合As2O3抑制K562细胞的增殖 |
| 2.3 过表达miR-203联合As2O3促进K562细胞凋亡 |
| 2.4 高表达miR-203联合As2O3抑制K562细胞内Bcr/abl蛋白表达 |
| 2.5 成功构建Bcr/abl 3'UTR和Bcr/abl mut-3'UTR双荧光素酶报告基因载体 |
| 2.6 荧光素酶活性分析 |
| 3 讨论 |
（5）CIAPIN1在肿瘤中的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 第一部分 CIAPIN1在慢性粒细胞白血病K562细胞粒系分化中的作 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 一、CIAPIN1干扰载体的构建及稳转细胞系的建立 |
| 二、CIAPINl基因干扰效率的鉴定 |
| 三、沉默CIAPINl基因对K562细胞粒系分化的影响 |
| 四、NHEl在K562细胞粒系分化中的作用 |
| 五、CIAPEVl对NHEl的表达调控作用 |
| 六、ERKl/2信号通路在K562细胞粒系分化中的作用 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CIAPIN1在慢性粒细胞白血病K562细胞对伊马替尼敏感 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 一、CIAPIN1病例统计分析 |
| 二、沉默CIAPINl基因对K:562细胞生长的影响 |
| 三、CIAPIN1基因在K562细胞对伊马替尼敏感性中的作用 |
| 四、相关机制的探讨 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CIAPIN1在乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭与迁移中的作 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 一、CIAPIN1在MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中的表达差异 |
| 二、CIAPIN1慢病毒表达载体的构建及鉴定 |
| 三、MDA-MB-231稳转细胞系的建立 |
| 四、CIAPIN1过表达效率的鉴定 |
| 五、CIAPIN1在MDA-MB-231细胞迁移与侵袭中的作用 |
| 六、NHE1在MDA-MB-231细胞迁移与侵袭中的作用 |
| 七、ERK1/2信号通路在MDA-MB-231细胞迁移与侵袭中的作用 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩写词 |
| 附录二 在学期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）类泛素蛋白质ISG15对慢性粒细胞性白血病细胞及肝癌细胞的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 类泛素蛋白质ISG15在干扰素治疗慢性粒细胞性白血病过程中的作用研究 |
| 1 绪论 |
| 1.1 ISG15及其级联酶系的结构特点 |
| 1.2 ISG15及其级联酶系的生物学功能 |
| 1.3 慢性粒细胞性白血病的特征及治疗 |
| 1.4 IFN-α-的功能及其作用机制 |
| 1.5 P53、P21及ISG15 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 KT1/A3细胞总RNA提取 |
| 3.2 RT-PCR扩增IFN-α诱导后KT1/A3细胞中isg15基因 |
| 3.3 穿梭载体PCDNA3.1(+)-ISG15双酶切验证 |
| 3.4 穿梭载体PCDNA3.1(+)-ISG15测序 |
| 3.5 IFN-α处理能抑制KT1/A3细胞生长 |
| 3.6 IFN-α处理后KT1/A3细胞中ISG15表达水平提高 |
| 3.7 IFN-α处理后KT1/A3细胞凋亡增加 |
| 3.8 KT1/A3细胞及KT1/A3R细胞稳定转染PCDNA3.1(+)-ISG15后ISG15蛋白质表达增加 |
| 3.9 过表达ISG15能抑制KT1/A3细胞及KT1/A3R细胞增殖 |
| 3.10 IFN-α处理后KT1/A3细胞中P53、P21的表达水平提高 |
| 3.11 过表达ISG15能提高KT1/A3细胞及KT1/A3R细胞中P53、P21和ISG15表达 |
| 3.12 沉默ISG15及其级联酶系后KT1/A3细胞与KT1/A3R细胞中P53及P21的表达 |
| 3.13 沉默ISG15及UBE1L能逆转IFN-α对KT1/A3细胞的凋亡作用,沉默USP18后能增加IFN-α对KT1/A3细胞及KT1/A3R细胞的凋亡作用 |
| 3.14 过表达ISG15后KT1/A3细胞及KT1/A3R细胞中Caspase3酶活性增加 |
| 3.15 KT1/A3细胞及KT1/A3R细胞中过表达ISG15或沉默USP18后细胞中P53及P21的表达 |
| 3.16 沉默P53后ISG15抑制KT1细胞增殖的功能消失 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 类泛素蛋白质ISG15诱导肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制 |
| 1 绪论 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 用不同浓度的IFN-α处理HepG2细胞后ISG15的表达增加 |
| 3.2 过表达ISG15能增加HepG2细胞中P53与P21表达,并能提高细胞中蛋白质泛素化及蛋白质ISG15修饰水平 |
| 3.3 ISG15及其修饰的蛋白质分布在HepG2细胞的细胞核与细胞质中 |
| 3.4 过表达ISG15能够抑制肝癌细胞HepG2的生长 |
| 3.5 过表达ISG15能提高HepG2细胞中Caspase3酶活性 |
| 3.6 过表达ISG15不能上调HepG2细胞中USP18及UBE1L的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术成绩 |
| 致谢 |
（7）hsa-miR-203真核表达载体的构建及对K562细胞增殖与凋亡的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 hsa-miR-203特异性引物设计 |
| 1.3 质粒制备和测序 |
| 1.4 细胞培养和转染 |
| 1.5 转染效率测定 |
| 1.6 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 |
| 1.7 annexin V-FITC/PI法测定细胞早期凋亡率 |
| 1.8 实时荧光定量RT-PCR检测bcr/abl |
| 1.9 比色法测定caspase-3、caspase-9的活性 |
| 1.10 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒的测序鉴定 |
| 2.2 PmiR-203转染效率测定 |
| 2.3 细胞增殖抑制率检测 |
| 2.4 annexin V-FITC法检测细胞早期凋亡率 |
| 2.5 实时荧光定量RT-PCR检测bcr/abl |
| 2.6 比色法测定caspase-3、caspase-9 P |
| 3 讨论 |
（8）miR-196b和miR-30a在慢粒发病机制中的功能与表达调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 慢粒中miR-196b和miR-30a的靶基因验证 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 慢粒中miR-196b和miR-30a的功能研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 慢粒中miR-196b和miR-30a启动子CpG岛甲基化水平分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 总结 |
| 研究不足 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语表 |
| 攻读博士期间成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（10）bcr/abl融合基因特异性多重siRNAs真核表达载体的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 bcr/abl 融合基因单个siRNA 真核表达载体的构建与鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 bcr/abl 融合基因的多重siRNAs真核表达载体的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 慢性髓性白血病的治疗进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间参与科研及发表论文 |
| 致谢 |
四、抗慢性粒细胞性白血病bcr/abl mRNA真核表达载体的构建（论文参考文献）
- [1]Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究[D]. 陈晓文. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]基于重组MS2病毒样颗粒的急性早幼粒白血病PML-RARα融合基因检测质控品及其应用研究[D]. 吴祁生. 北京协和医学院, 2018(02)
- [3]核糖体蛋白RPS15A促进白血病U937细胞恶性增殖的分子机制研究[D]. 李光耀. 山东大学, 2016(09)
- [4]三氧化二砷联合miR-203对人白血病K562细胞的抑制作用及其机制[J]. 黄之虎,韦思羽,农朝赞,韦仕喻,农少云,郭凌霄,李育敏,何金花,杨林杰. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2014(05)
- [5]CIAPIN1在肿瘤中的生物学功能研究[D]. 王建. 北京协和医学院, 2014(04)
- [6]类泛素蛋白质ISG15对慢性粒细胞性白血病细胞及肝癌细胞的作用机制研究[D]. 万新星. 中南大学, 2014(02)
- [7]hsa-miR-203真核表达载体的构建及对K562细胞增殖与凋亡的影响[J]. 何金花,黎毓光,谢杏仪,陈顺仪,王莉,邹茂贤,黄国贤. 临床检验杂志, 2012(08)
- [8]miR-196b和miR-30a在慢粒发病机制中的功能与表达调控研究[D]. 刘玥. 南方医科大学, 2012(04)
- [9]bcr-abl基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达[J]. 王艳芳,苏丽萍,周永安. 白血病·淋巴瘤, 2010(10)
- [10]bcr/abl融合基因特异性多重siRNAs真核表达载体的构建[D]. 林蔡弟. 广州医学院, 2010(02)
标签：白血病论文; 慢性粒细胞白血病论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 急性髓性白血病论文; 细胞增殖论文;