一、睡眠剥夺及恢复睡眠1小时后大鼠脑干中c-Fos蛋白的表达（论文文献综述）
魏梦霞[1]（2021）在《运用光遗传和神经环路示踪技术研究前庭神经核的功能》文中指出谷氨酸能和GABA（中文为γ-氨基丁酸）能神经元是小鼠的内侧前庭神经核的主要神经元类型。在本课题的研究中,通过光遗传学的技术手段,我们分别特异性地激活了小鼠的单侧前庭神经核内的谷氨酸能神经元（VGlu T2+）和GABA能神经元（GAD2+）,评估了小鼠的前庭神经核所发出的谷氨酸能和GABA能的神经通路的功能。在光遗传学刺激的实验过程中,我们发现光遗传学激活前庭神经核-VGlu T2+神经元时,小鼠的姿势运动失衡评估分数会有着显着的增加,而在光刺激结束后,小鼠的姿势运动失衡评估分数又会迅速地恢复到基线水平。另一方面,在光遗传学激活前庭神经核GAD2+神经元的实验中,小鼠的姿势运动失衡评估分数并没有显着的变化。我们进一步计算分析了实验过程中小鼠的支撑表面积的变化趋势,其特征也与姿势运动失衡评估分数的变化趋势一致,即在光刺激激活时有着显着的增加,而在光刺激结束后迅速恢复至基线水平。前庭神经核VGlu T2+小鼠在光刺激时的症状与之前许多研究中运用手术损伤单侧前庭神经核所构造的小鼠模型的行为症状相当,具备急性前庭失衡症患者类似的行为表型。我们的研究结果证明在小鼠的前庭神经核中的谷氨酸能神经元亚群,而不是GABA能神经元亚群的活动会造成即时的并且非常强烈的姿势运动缺陷。最后,我们还通过整理分析光遗传学刺激后的小鼠姿势和行为参数如运动性和速度等,发现前庭神经核VGLu T2+神经元的激活的影响可能不止停留在姿势运动方面,也会造成运动功能的障碍,并且这影响会在光遗传学刺激一个小时后随减弱但仍然存在。总体而言,这些结果表明,前庭神经核VGlu T2+神经元在小鼠的平衡和姿势运动的功能中起着重要作用,但前庭神经核GAD2+神经元则在小鼠的平衡和姿势运动中作用不显着。光遗传学方法将有助于表征参与前庭生理和病理生理的不同前庭神经核神经元群体的作用。另外,根据已有的研究,总结得到前庭神经核除了扮演保持平衡的关键核团这一角色外,它的功能异常还常常与晕动病、前庭偏头痛、帕金森氏病等多种疾病状态密切关联,而且以上所提及的疾病的症状也会伴随着压力应激而加重。并且在压力应激的情况下,患病的生物体脑内的蓝斑-去甲肾上腺素能系统的会被激活。所以在这一部分的研究中,我们将转基因小鼠技术与病毒示踪技术结合,实验的结果展示出,小鼠脑内的蓝斑到前庭神经核存在着明显的神经投射。并且免疫组化的结果显示的免疫荧光染色确定蓝斑-前庭神经核的投射为去甲肾上腺素能。同时我们对小鼠进行睡眠剥夺,发现小鼠在压力刺激下蓝斑去甲肾上腺素能神经元被强烈激活,而前庭神经核内的神经元未被明显激活,提示睡眠剥夺可能通过蓝斑-前庭神经核的去甲肾上腺素能神经调制起作用。本研究的结果一定程度上揭示了蓝斑与前庭神经核之间的联系,并且为继续研究蓝斑-前庭神经核神经环路在压力应激下前庭神经核功能异常的机制提供解剖结构学基础。
庞钰洁[2]（2021）在《下丘脑orexin神经元-蓝斑底核神经通路的活动特征及功能研究》文中提出睡眠和觉醒是维持人体生存所必须且反复交替的两种生理状态,涉及了复杂的神经机制。Kleitman团队在1953年第一次通过脑肌电以及眼肌电记录发现了REM睡眠,即出现与觉醒类似的活跃脑电并同时伴随着骨骼肌的强烈抑制。其与慢波睡眠的生理表现及神经机制截然不同,因此被确立为睡眠过程中一个具有典型特征的独立时相。值得注意的是下丘脑作为脑内重要且复杂的稳态中枢,富含着不同种类的神经元群整合体内外信号进而共同协调调控人体生理活动。其中的orexin神经元局限分布在外侧下丘脑区及穹窿周区,接收众多脑区的输入并向全脑发送广泛投射,与不同核团形成不同的神经环路发挥着其多样性的调节作用。在哺乳动物、两栖动物以及模式生物的下丘脑中都发现了具有类似分布的orexin神经元群,也说明了该神经元在动物的发育中具有高度保守性,扮演着至关重要的角色。鉴于orexin神经元发送大量投射至觉醒相关的单胺能核团,并且orexin能神经系统发生缺陷时主要导致嗜睡症状,因此以往的研究更多关注其作为觉醒肽在睡眠/觉醒周期中的调控作用。但在随后的研究中也发现orexin神经元能够直接投射到REM睡眠产生和维持的主要结构即脑桥被盖处的SLD核团,提示存在这样一条特定的下丘脑orexin神经元到脑干SLD核团的神经通路参与REM睡眠的复杂调控。值得注意的是,本课题组前期研究表明,调控REM睡眠的关键脑区SLD不仅有orexin能纤维的分布还存在orexin受体的表达,进一步采用光遗传学及化学遗传学技术均证明了下丘脑orexin能神经系统可以通过直接支配SLD进而参与调节REM睡眠脑肌电的稳定。不同于以往发现的orexin神经元在睡眠/觉醒调控中产生的促觉醒作用,本研究更进一步地关注这群特异性投射至SLD的orexin神经元在睡眠/觉醒周期中具有什么样的活动特征,从而参与了睡眠/觉醒的调控。这群特异性投射的orexin神经元是否形成了一个独特的亚群,而该神经元亚群具有什么样的功能意义,产生这样功能意义的具体神经环路机制又是什么,这些问题都有待详尽研究。综上所述,本文将从投射至SLD的orexin神经元群的活动特征和功能及神经环路机制等方面进行探索。利用CTB逆行示踪技术、神经元激活标记c-Fos免疫组化技术和光纤钙成像技术观察该神经元亚群在睡眠/觉醒期间的主要活动特征。然后采用一系列行为学手段来探索该特定通路的功能意义,进一步明确相关orexin能神经系统整体协调和调控睡眠/觉醒周期的联系。最后结合新型逆行/顺行病毒追踪技术,对与这些神经元存在直接神经联系的上下游脑区进行系统标定,初步研究该神经元亚群的神经环路机制。现将相关结果阐述如下:1.蓝斑底核投射的orexin神经元活动特征的研究（1）LH存在一群特异性支配SLD的orexin神经元本文首先研究了投射至SLD脑区的orexin神经元的数量及分布模式等是否具有其独特性。利用CTB逆行示踪剂追踪到有7.1±0.8%的orexin神经元投射到促REM睡眠核团SLD,并且有15.2±2.1%的orexin神经元投射到促觉醒核团LC。此外,通过统计分析发现分别投射到SLD和LC的orexin神经元仅有1.9±0.3%的重叠（n=6 rats,n=3902 orexin neurons）。上述结果表明确实存在一部分orexin神经元能够特异性投射至SLD,尽管SLD与LC相邻,但根据其下游投射靶点乃至功能的不同能够在下丘脑区域区分出不同的orexin神经元亚群。接下来为了进一步探究分别投射到SLD和LC的orexin神经元分布模式是否具有解剖位置上的特异性,根据大鼠立体定位脑图谱按照由尾端至头端的纵轴方向（AP:-2.30～-3.80 mm）,在每隔200μm的6张冠状脑片上统计orexin神经元的分布数量及位置。结果发现投射到SLD的orexin神经元和投射到LC的orexin神经元与整体orexin神经元分布模式均一致,混杂分布于下丘脑中,且分布数量均是从尾端至头端由少逐渐增多再减少。上述结果提示在SLD区域以及LC区域逆行追踪所标记的orexin神经元在下丘脑中为散在分布,而非特异性分布于特定区域位置。（2）特异性支配SLD的orexin神经元亚群显示REM睡眠相关激活为了进一步明确特异性投射至SLD的orexin神经元亚群是否在睡眠/觉醒周期中具有某种活动特征进而为其下游投射靶点提供驱动力,我们对SLD区域注射CTB逆行示踪剂的大鼠进行72 h的REM睡眠剥夺。第一次REM睡眠出现的2.5 h后,立即对大鼠进行灌注,进行c-Fos免疫荧光染色。发现整体orexin神经元在睡眠剥夺组与对照组中的c-Fos表达量并无显着差异（control:7.1±1.3%,n=4 rats;RSD:6.0±0.6%,n=7 rats;P=0.435）,而特异性投射至SLD的orexin神经元群在睡眠剥夺后的恢复期中c-Fos表达量显着增加(control:6.8±2.8%,n=4 rats;RSD:28.2±2.9%,n=7 rats;P=9.221×10-4)。这部分结果表明不同于整体orexin神经元的活动特点,特异性投射至SLD的orexin神经元群能够在丰富的REM睡眠中表现出更强的活性。（3）特异性支配SLD的orexin神经元亚群在REM睡眠期间钙信号增强为了更加精确地探索特异性投射至SLD的orexin神经元在自然生理状态下的睡眠/觉醒周期中的活动特点,在orexin-Cre转基因小鼠的SLD脑区定位注射逆行转染的病毒AAV-retro-Enf1α-DIO-GCa MP6s-WPRE-p A,使得特异性投射至SLD的orexin神经元标记上绿色荧光。采用光纤钙成像技术记录自由活动小鼠脑内这部分orexin神经元的钙信号强度变化,结果显示特异性投射至SLD的orexin神经元在REM睡眠期间具有明显的荧光变化（ΔF/F:0.46±0.05%）,且显着高于NREM睡眠期间（ΔF/F:0.07±0.02%）,而在觉醒期前荧光变化（ΔF/F:1.27±0.17%）呈现出增高的趋势(n=4 mice,one-way ANOVA;F（2,9）=36.146;P=0.5×10-4;post hoc LSD comparison test;P REM vs NREM=0.0236;P REM vs wakefulness=3.27×10-4;P NREM vs wakefulness=0.16×10-4)。上述结果再次明确,不同于以往所研究的仅在觉醒期间发生激活的orexin神经元,我们所关注的这群特异性投射至SLD的orexin神经元能够在整个REM睡眠过程中处于活跃状态。2.蓝斑底核投射的orexin神经元功能及环路特征的初步研究（1）特异性支配SLD的orexin神经元亚群调控REM睡眠稳定值得注意的是具有如此独特性的这部分orexin神经元在整体睡眠/觉醒调控中到底发挥了什么样的功能呢。我们接下来利用了光遗传学技术在单次REM睡眠中光抑制投射至SLD的orexin能纤维末梢,发现小鼠REM睡眠期间theta能量减少约7.4%（n=9mice,P=0.0325）,并且平均REM睡眠片段时程显着缩短18.2%（n=9 mice,P=0.0363）,而其肌电并未发生明显变化（n=9 mice,P=0.32）。进一步采用ta Casp3病毒特异性长时程损毁投射至SLD的orexin神经元亚群。结果发现,与对照组小鼠相比,ta Casp3组小鼠在REM睡眠期间肌电显着升高(ncontrol=11 mice,nta Casp3=8 mice,control:0.93±0.01,ta Casp3:1.04±0.01;two-sided unpaired t-test;P=0.09×10-4)。进一步小鼠采取24 h REM睡眠剥夺,与对照组小鼠相比,ta Casp3组小鼠在rebound期间出现间断的REM睡眠,主要表现在持续维持一段REM睡眠的能力明显减弱(ncontrol=10 mice,nta Casp3=10mice,wildtype:1.77±0.14;ta Casp3:1.34±0.11;two-sided unpaired t-test;P=0.028),并且出现REM睡眠片段数量增多的现象（wildtype:0.99±0.07;ta Casp3:1.38±0.17;two-sided unpaired t-test;P=0.047）。故长时间缺失此通路对REM睡眠稳态具有显着影响,会使得REM睡眠恢复能力有所减弱。综上所述,这部分实验结果表明SLD中的orexin能信号或特异性投射至SLD的orexin神经元的缺失均对REM睡眠的稳态调控具有明显影响,进一步明确了该条特异性通路能够稳定REM睡眠。（2）特异性支配SLD的orexin神经元亚群的下游投射靶点为进一步明确这群投射至SLD的orexin神经元亚群在睡眠/觉醒调控中是通过驱动哪些下游投射靶点进而发挥稳定REM睡眠的作用。故采用orexin-Cre转基因小鼠,在其SLD区域进行立体定位注射,将特异性投射至SLD的orexin神经元表达上红色荧光蛋白,通过荧光蛋白的免疫荧光染色和显微镜下的纤维成像,可系统分析其直接投射的下游靶点。结果发现该orexin神经元亚群仅仅只投射至SLD和与其相邻的LC,在其它REM睡眠相关脑区PNO、LDT以及觉醒相关脑区PVT均不发送纤维投射（n=2 mice）。该实验结果也与第一部分实验结果相呼应,更加明确了投射至SLD的orexin神经元亚群的独特性。（3）特异性支配SLD的orexin神经元亚群的上游全脑输入上述实验结果已表明特异性支配SLD的orexin神经元几乎是单位点投射的且在REM睡眠期具有特定的活动特征,为进一步研究具有如此独特性的orexin神经元亚群的神经环路基础。同样采用orexin-Cre转基因小鼠,首先在其SLD区域进行立体定位注射,标记出投射至SLD的orexin神经元亚群。再采用逆行病毒追踪技术追踪该神经元亚群的上游全脑输入,通过初步研究发现与整体orexin神经元的全脑输入分布相比,这群特异性投射至SLD的orexin神经元可能更多地接受了ZI和DMH脑区的输入（n=2mice）。综上所述,本研究发现下丘脑中有一部分orexin神经元是能够特异性投射至REM睡眠关键脑区SLD,可能接受来自其他脑区不同数量的输入,在REM睡眠期间激活下游投射靶区进而在睡眠/觉醒周期中发挥调控功能。此外,特异性抑制或损毁该orexin神经元亚群将会导致REM睡眠不稳定从而影响整体睡眠/觉醒稳态。故本研究揭示了下丘脑orexin神经元-脑干SLD通路调控REM睡眠的相关活动特点、功能意义及环路机制,为进一步明确相关orexin能神经系统整体协调和调控睡眠/觉醒整体稳态提供新的研究方向。
郭佳[3]（2021）在《中脑腹侧被盖区多巴胺转运蛋白在丙泊酚全麻大鼠苏醒中的作用》文中指出目的:探究中脑腹侧被盖区（VTA）多巴胺转运蛋白（DAT）在丙泊酚全身麻醉大鼠苏醒中的作用。方法:雄性SD大鼠,体质量250-300g。为观察VTA在丙泊酚麻醉中的作用,将20只大鼠随机分为2组:对照组（Negative control,NC）、6-OHDA毁损组（6-OHDA）,每组10只。为观察丙泊酚麻醉对VTA内DAT的影响,将20只大鼠随机分为2组:生理盐水组（Saline,S）、丙泊酚麻醉组（Propofol,P）,每组10只。其余实验部分将90只大鼠随机分为3组:对照组（Negative control,NC）、AAV空载组（AAV-NC）、AAV2-DAT-RNAi组（DAT-RNAi）,每组30只。为观察丙泊酚对前额叶皮层（PFC）c-fos蛋白表达的影响,免疫荧光及Western blot实验部分另添加生理盐水注射组（Saline,S）和丙泊酚麻醉组（Propofol,P）两个亚分组,每组10只。其中,NC组为正常大鼠;AAV-NC组和DAT-RNAi组经脑立体定位仪分别在双侧VTA注射基因敲低DAT的腺相关病毒（GV480）和阴性对照病毒（CON304）,总量为3ul,注射10min。P组经尾静脉以70mg/kg的剂量缓慢推注丙泊酚至大鼠翻正反射消失（Loss of the righting reflex,LORR）后继续维持30min,停药10min后灌注取脑;S组经尾静脉以相同速度输注等剂量生理盐水,并在停止输注10min后灌注取脑。行为学实验通过LORR时间和翻正反射恢复（Recovery of righting reflex,RORR）时间对比大鼠丙泊酚麻醉的诱导和苏醒时间;通过麻醉深度评分表比较大鼠在丙泊酚麻醉及苏醒期间的麻醉深度评分;在体脑电记录观察大鼠在丙泊酚麻醉期和苏醒期间的脑电变化;免疫荧光染色观察VTA内DAT蛋白、前额叶皮层（PFC）c-fos蛋白表达情况;Western blot法检测PFC内c-fos的蛋白含量。结果:与NC组比较,6-OHDA组LORR时间缩短,RORR时间延长（P<0.05）;与S组比较,P组VTA内DAT表达降低（P<0.05）;与NC组比较,DAT-RNAi组LORR时间无明显改变（P>0.05）,RORR时间缩短（P<0.05）;与NC组比较,DAT-RNAi组大鼠在丙泊酚麻醉期间麻醉深度无统计学差异（P>0.05）,在丙泊酚麻醉苏醒期间,DAT-RNAi组大鼠麻醉深度评分更低（P<0.05）;脑电图在丙泊酚麻醉期间α波、β波频率增多（P<0.05）,在丙泊酚苏醒期间β波频率增多,θ波频率减少,丙泊酚麻醉苏醒期间PFC中c-fos蛋白表达增多（P<0.05）;与NC组比较,AAV-NC组LORR时间和RORR时间、丙泊酚麻醉及苏醒期间麻醉深度评分、丙泊酚麻醉及苏醒期间的脑电图、丙泊酚麻醉苏醒期PFC中c-fos蛋白表达均无统计学差异（P>0.05）。结论:敲低VTA内DAT,可促进大鼠从丙泊酚麻醉中苏醒。
邢其郡[4]（2021）在《天麻中的有效成分靶向MT1发挥镇静安神作用的研究》文中进行了进一步梳理睡眠已经是整个现代人类日常生活过程中必不可少的阶段,我们的一生中身体大约有三分之一的时间是处于睡眠的状态中,睡眠阶段具有恢复体力、消除一天的疲劳、促进身体发育和生长、增进学习记忆的作用,因此睡眠对于我们而言具有重要意义。而随着科学技术的快速发展,受到自身内源性的压力和外源性的环境因素影响,表现为难以入睡、睡眠质量下降以及睡眠过程中易惊醒的失眠病症已经在社会中越来越普遍的出现。短期的失眠会导致疲惫、发力、注意力不集中等状态,而长期的失眠会导致抑郁、免疫力下降和代谢类疾病。因此失眠的问题不容忽视,目前已经得到越来越多的关注。对于失眠治疗的常见的有苯二氮卓类药物,但其副作用多且危害大。而中国自古以来就有使用中药治疗疾病的传统,天麻更是自古以来就被证实具有镇静安神、息风止痉,治疗头晕、癫痫、失眠等疾病,而天麻中的化合物复杂多样且生理学效应众多,阻碍了新药的研发。因此,本文的研究方向选择天麻中的活性成分包括天麻素、巴利森苷A和巴利森苷B以及本实验室已经构建好的睡眠系统相关受体如多巴胺受体D2、D3,食欲素受体OX2、褪黑素受体MT1、MT2高表达细胞株为平台筛选可能发挥镇静安神作用机制的潜在靶点。根据本研究实验研究结果表明天麻素和巴利森苷A能够通过MT1受体而上调p-ERK水平,并且提高程度呈现浓度依赖性。接着通过热稳定性、蛋白酶切实验以及受体探针FRET基线实验进一步验证了巴利森苷A与MT1受体的结合能力,并对MT1受体结合口袋的关键氨基酸位点突变后巴利森苷A无法通过其激活ERK1/2,表明巴利森苷A与MT1受体特异性结合激活下游的信号通路。通过鼻腔注射的方式将天麻素、巴利森苷A和巴利森苷B给药小鼠诱导小鼠的睡眠实验发现天麻素、巴利森苷A能够有效延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间,缩短小鼠入睡潜伏期,降低小鼠的自发活动能力,同时用ELISA法检测DA和5-HT表明天麻素、巴利森苷A可以明显增加小鼠大脑DA和5-HT的含量,通过q-PCR实验发现天麻素、巴利森苷A能降低肝脏和肾脏中的炎症因子的表达,但可以上调fos基因的表达,提示这两种化合物可以活化小鼠中的神经元而降低炎症因子间接促进睡眠而同时起到神经保护的作用。而对血常规生化检测发现三种化合物均对小鼠血液生化指标无影响。
任小娟[5]（2020）在《肾不藏志不寐的理论及实验研究》文中研究指明目的:（1）探讨肾不藏志不寐论治的理论依据、因机证治和常用安肾志方药。（2）采用D-半乳糖联合对氯苯丙氨酸（PCPA）建立肾不藏志不寐大鼠模型,观察肾不藏志不寐模型大鼠衰老方面、睡眠方面和海马转录组变化,衰老方面包括记忆能力、氧化应激、凋亡基因,睡眠方面包括睡眠时间、脑电图、炎症因子和神经递质。（3）观察远志对肾不藏志不寐大鼠睡眠、神经递质和炎性因子的影响,以及远志对肾不藏志不寐大鼠海马转录组的影响。方方法:（1）收集、归纳和探讨肾不藏志不寐的理论依据和论治方药。（2）将实验动物随机分为空白对照组、D-半乳糖组、对氯苯丙氨酸组、肾不藏志不寐组,采用D-半乳糖120mg/kg/d皮下注射42d联合PCPA 300mg/kg/d腹腔注射3d建立肾不藏志不寐大鼠模型。（3）通过Morris水迷宫（MWM）观察肾不藏志不寐大鼠学习记忆能力,检测肾不藏志不寐大鼠脑氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）的含量,海马超氧化物歧化酶1（SOD1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、CAT、B淋巴细胞瘤相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）m RNA的表达,观察肾不藏志不寐大鼠衰老方面的变化。（4）采用戊巴比妥实验观察肾不藏志不寐大鼠睡眠情况,通过脑电图观察大鼠觉醒（Wake）、慢波睡眠I期（SWS1）、慢波睡眠II期（SWS2）、快速动眼睡眠（REMS）和睡眠总时间（TST）,检测肾不藏志不寐大鼠血浆白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量,脑5-羟色胺（5-HT）、谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）含量,海马白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、核转录因子-κB（NF-κB）、5羟色胺1A受体(5-HT1AR)、γ-氨基丁酸A受体α1亚型(GABAARα1)、代谢型谷氨酸受体2（m Glu R2）m RNA的表达,观察肾不藏志不寐大鼠进行睡眠方面的变化。（5）对空白对照组和肾不藏志不寐组大鼠海马提取总RNA进行转录组测序和分析。（6）观察远志对肾不藏志不寐大鼠的影响:将实验动物随机分为空白对照组、肾不藏志不寐组、远志低剂量组（0.0875g/kg）、远志中剂量组（0.175g/kg）、远志高剂量组（0.35g/kg）、地西泮组（0.92mg/kg）,通过MWM观察远志对肾不藏志不寐大鼠学习记忆能力的影响,检测各组大鼠海马5-HT、Glu、GABA的含量,血浆IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。（7）对空白对照组、肾不藏志不寐组、远志中剂量组、地西泮组大鼠海马提取总RNA进行转录组测序和分析。结结果:（1）肾志对寐寤具有调节作用,肾不藏志不寐的主症为夜寐早寤,病位在肾,病因是肾脏虚损,肾志不入于舍是肾不藏志不寐的核心病机。肾不藏志不寐常见临床证型包括肾气不固型、肾精不足型、肾阳虚型、肾阴虚型、肾虚水泛型和肾不纳气型六种证型。远志、刺五加、人参、茯神、五味子、交泰丸、黄连阿胶汤、六味地黄丸、磁朱丸和孔圣枕中丹是治疗肾不藏志不寐常用方药。（2）D-半乳糖120mg/kg/d皮下注射42d联合PCPA 300mg/kg/d腹腔注射3d可以建立肾不藏志不寐大鼠模型。（3）肾不藏志不寐大鼠模型衰老方面的变化:与空白对照组比较,模型大鼠体重减轻,MWM中逃避潜伏期延长、穿台次数减少,脑SOD、CAT、GSH-px含量减少、MDA含量增加,海马SOD1、SOD2、CAT m RNA表达上调,海马Bax、Caspase-3 m RNA的表达上调、Bcl-2 m RNA表达下调。（4）肾不藏志不寐大鼠模型睡眠方面的变化:戊巴比妥实验发现肾不藏志不寐大鼠睡眠潜伏期延长、睡眠时间缩短,肾不藏志不寐大鼠脑电图WAKE增加、SWS1、SWS2、REMS和TST减少,血浆IL-1β、IL-6、TNF-α含量增加,脑5-HT、GABA含量减少、Glu含量增加,海马IL-6、TNF-αm RNA表达上调,海马5-HT1AR、GABAARα1m RNA表达下调、m Glu R2 m RNA表达上调。（5）肾不藏志不寐大鼠海马转录组分析结果:与空白对照组相比,肾不藏志不寐组的差异基因共有1628个,其中上调基因上调887个,下调741个;差异基因的功能涉及神经发育、细胞发育、甘油三酯代谢、核糖体、氧化应激、炎性因子;并与帕金森病、阿尔茨海默病、逆行神经的信号通路、慢性进行性舞蹈病有密切联系。通过组间差异基因GO分析、KEGG Pathway分析、蛋白互作分析以及肾不藏志不寐内涵,筛选肾不藏志不寐组的关键差异基因并进行验证,发现肾不藏志不寐大鼠海马显着差异基因为Gnb3、Faah、Mmp9、Twist1。（6）远志可以提高肾不藏志不寐大鼠学习记忆能力,增加模型大鼠海马5-HT、GABA的含量、降低Glu的含量,降低血浆IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。（7）药物干预肾不藏志不寐大鼠的海马转录组分析结果:（1）与肾不藏志不寐组相比,远志组的差异基因共有663个,其中上调240个,下调423个;差异基因主要涉及神经发育、昼夜节律调控、细胞凋亡与增殖、氧化磷酸化、能量代谢、免疫调节;并与帕金森病、阿尔茨海默病、慢性进行性舞蹈病、非酒精性脂肪肝、I型糖尿病、哮喘的发生有密切联系。（2）与肾不藏志不寐组相比,地西泮组的差异基因共有1660个,其中上调基因732个,下调基因928个;差异基因主要涉及神经系统发育的调控、氧化磷酸化、神经元凋亡、氧化应激、能量代谢;并与帕金森病、慢性进行性舞蹈病、阿尔茨海默病、非酒精性脂肪肝有密切联系。（3）远志对肾不藏志不寐干预作用的差异基因235个,其中显着治疗作用的基因37个;差异基因的功能涉及神经元发育、γ-氨基丁酸信号通路、细胞生长调控、参与免疫球蛋白介导的免疫应答、能量代谢;并与慢性进行性舞蹈病、帕金森病、阿尔茨海默病、I型糖尿病、非酒精性脂肪肝等有关。（4）地西泮对肾不藏志不寐干预作用的差异基因753个,其中显着治疗作用的基因49个;差异基因涉及中枢神经系统发育、老化、突触的调节、凋亡的调控、多巴胺、糖原、脂肪酸、嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸代谢。并与慢性进行性舞蹈病、帕金森病、阿尔茨海默病、非酒精性脂肪肝、心肌收缩、单纯疱疹病毒感染等有关。（5）肾不藏志不寐与远志、地西泮关联的靶标基因及分子通路分析:通过组间差异基因GO分析、KEGG Pathway分析以及肾不藏志不寐内涵,筛选肾不藏志不寐组、远志组和地西泮组的关键差异基因并进行验证,发现远志有效靶基因为Faim、Pcp2、Elovl6;地西泮有效靶基因为Npr3、Trh;两药共同作用的靶点为BDNF、Gabra6。结结论:（1）肾志与不寐有着密切联系,肾不藏志是肾不藏志不寐的核心病机,补益肾脏、安神定志为肾不藏志不寐的治疗原则,远志是归经入肾的的安肾志药物,具有安神、强志、益肾的功效,是治疗志异常的首选药物。（2）D-半乳糖联合PCPA可以建立肾不藏志不寐大鼠模型。（3）肾不藏志不寐大鼠模型与衰老相关的学习记忆能力、氧化应激、凋亡记忆基因的表达发生了改变,与睡眠相关的睡眠时间、脑电图、神经递质和炎性因子的表达发生了改变。（4）肾不藏志不寐大鼠模型海马存在基因转录水平上的变化,显着差异基因功能涉及神经系统、代谢和炎症等。（5）远志可以改善肾不藏志不寐大鼠的睡眠、调节神经递质、降低炎性因子的表达。（6）远志和地西泮对肾不藏志不寐大鼠海马的神经系统和炎症相关基因具有一定的干预效应,远志更侧重对神经功能相关靶基因的调节。
景佳妮[6]（2020）在《持续光暴露增强中枢交感输出对正常和心衰大鼠心功能的作用研究》文中研究说明研究背景与目的人体器官组织的时间生理（temporal organization of physiology）对维持健康是非常重要的,大自然的昼夜交替使人类能够维持自身组织器官的昼夜节律与自然环境的光暗周期相适应。然而随着电子照明设备的广泛使用,夜间光暴露（exposure to nighttime lighting）这一现象变得极为普遍,比如,夜班和轮班工作制的出现,光污染（light pollution）,甚至在极地（南北极）环境的极昼现象等。这些光暴露环境扰乱了昼夜边界,无法与正常生理过程的昼夜节律同步,影响人类健康,引发多种疾病。而人体绝大多数系统都被昼夜节律所调控,包括睡眠觉醒,激素分泌,细胞功能和基因表达等。夜间暴露于人工光照环境紊乱节律对人类健康的影响越来越受到研究者们的关注,其与代谢和情绪紊乱,心血管事件（心肌梗死、脑中风、突发心脏骤停）,内分泌功能紊乱,甚至癌症等疾病的发生率增加密切相关。研究报道,光暴露导致昼夜节律紊乱可能与外周系统节律的异常调节有关,光暴露抑制了褪黑素的分泌,导致中枢和外周生物钟基因紊乱。光暴露对糖皮质激素分泌影响的研究显示,光暴露可能与下丘脑-垂体-肾上腺轴功能上调和应激反应增加密切相关。大量动物实验研究显示,光暴露刺激视锥和视感神经节细胞在大脑形成神经环路,通过视交叉上核（Suprachiasmatic nucleus,SCN）直接或间接投射到其他参与情绪调控的脑区,影响神经元的可塑性（neuroplasticity）和递质传递（neurotransmission）。也有研究报道,光暴露（light exposure）能够引起大鼠产生复杂的心血管效应,导致组织器官功能紊乱。近年来已有众多研究者发现持续光照对心血管功能具有多重效应,并且说法不一。自主神经在调控心血管活动和功能中具有重要的作用,研究表明下丘脑和延髓多个脑区参与自主神经调控,其中交感神经活动受到中枢头端延髓腹外侧区（rostral ventrolateral medulla,RVLM）的调控,RVLM中C1神经元可接受室旁核（paraventricular hypothalamic nucleus,PVN）和尾端延髓腹外侧区（caudal ventrolateral medulla,CVLM）等其他心血管中枢的纤维传入,并发出纤维与交感节前神经元发生单突触联系调控外周交感活动和心血管功能。研究表明,光暴露可兴奋PVN,且昼夜节律调控中枢SCN参与光诱导产生的交感神经兴奋,但光暴露对交感中枢RVLM的作用并不明确。因此,本研究将最大化模拟日常光暴露环境,采用LED（250-300 lux）灯光持续照射,探究光暴露对正常和心衰大鼠中枢RVLM交感输出和心血管功能的影响及机制。本研究对于探索关于昼夜节律系统对心血管系统在中枢的神经环路研究具有重要作用和深远意义。心力衰竭（Heart Failure,HF）是由多因素引起的心血管综合征,而心肌缺血甚至心肌梗死是心血管疾病快速发展为心衰的重要因素,已成为心血管疾病患者突发性死亡的主要原因。研究报道,持续光暴露导致的昼夜节律紊乱增加了心血管疾病（心梗,心脏骤停）的发生风险,并且昼夜节律系统对维持正常的心血管功能和心血管疾病的预防非常重要。因此,本研究将探究持续光暴露对正常和心衰大鼠的心功能的作用,为心血管疾病预防提供重要依据。众所周知,心肌缺血能快速激活交感神经,引起儿茶酚胺类物质释放增加。在急性期,儿茶酚胺类物质激活β肾上腺素受体（βadrenergic receptors,β-AR）,通过代偿机制来维持心输出量和全身血压,而交感神经的持续兴奋将加速疾病的发展。研究者们认为,心衰患者交感神经兴奋激活β1-AR,导致心脏纤维重塑和心肌细胞死亡,对心脏有损害作用。因此,探究交感神经活动在光暴露对心血管功能影响中发挥的作用成为本研究的重点。对于心衰而言,头端延髓腹外侧区RVLM是中枢交感输出的关键区域,而交感神经活动增强是患者出现并发症和突发性死亡的主要原因。因此,明确RVLM对交感的调控作用对于探索光暴露对心血管功能的作用至关重要。研究报道,光暴露可引起组织器官氧化应激水平增强。然而,持续光暴露对中枢RVLM氧化应激的影响目前并不清楚。而RVLM中活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）增加导致的氧化应激增强是交感亢进的重要机制。中枢给予ROS的消除过氧化物歧化酶的模拟剂Tempol能降低交感神经活动亢进从而改善心血管功能。那么,光暴露是否通过增强中枢RVLM氧化应激水平而导致交感输出增强呢?研究表明,ROS的产生受到核转录因子Nrf2的调控,Nrf2在体内的抗氧化防御中具有重要作用,其磷酸化可促进抗氧化蛋白的转录,抑制氧化应激水平。灌流血管紧张素II（Angiotensin II,Ang II）的Nrf2基因敲除小鼠,心脏氧化应激损伤和心肌肥厚程度加重。过表达Nrf2可抑制活性氧的产生而减速慢性阻塞性肺疾病的恶化。但目前持续光暴露对正常和心衰大鼠中枢RVLM氧化应激的作用及具体机制并不清楚。研究显示,中枢RVLM内血管紧张素转换酶2（ACE2）可催化Ang II生成Ang1-7,增强ACE2/Ang1-7/Mas R受体轴功能具有降低心衰和高血压等病理状态下的交感神经兴奋,产生心血管保护效应。RVLM中过表达ACE2通过降低兴奋性突触传递从而降低高血压大鼠的血压,同时,ACE2/Ang1-7/Mas R受体轴功能增强能够抑制氧化应激水平,保护细胞损伤和神经元功能。然而,上调ACE2/Ang1-7/Mas R受体轴的功能能否改善光暴露导致的氧化应激目前也不明确。光暴露导致机体昼夜节律紊乱的众多研究提示,持续光暴露对中枢RVLM交感输出的作用可能也与RVLM节律紊乱有关。研究报道,光暴露影响正常的生物节律,增加睡眠障碍,导致行为活动改变。而昼夜节律的平衡在维持生物节律稳定中发挥重要作用,其中节律的调控中枢视交叉上核SCN主要受光照因素影响,在分子水平被钟基因调控,同时RVLM中也存在多种钟基因的表达。昼夜节律紊乱与心血管疾病的发生密切相关,如高血压、心肌梗死、心力衰竭和心律失常等。有趣的是,研究报道,SCN通过视网膜接收光线信号,在全脑可直接或间接与多个脑区产生纤维投射联系,比如,下丘脑室旁核PVN,内侧视前区（medial preoptic area,MPOA）,丘脑室旁核（paraventricular nucleus of the thalamus,PVT）,外侧僵核（lateral habenula,LHb）,中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area,VTA）,中缝背核（dorsal raphe,DR）等,从而产生复杂的神经网络调控。那么,RVLM是否接受中枢SCN的直接或间接的神经纤维投射呢?基于此,本研究进一步通过中枢核团的纤维投射联系来探究光暴露对交感神经活动的影响,为阐明节律系统与心血管系统之间的功能学联系提供新的视角。因此,本研究的主要目标是明确持续光暴露对正常和心衰大鼠中枢RVLM交感输出和心功能的影响;探究持续光暴露对中枢RVLM氧化应激的影响是否与Nrf2通路以及ACE2/Ang1-7/Mas R受体轴功能下调有关;并明确持续光暴露对RVLM昼夜节律的影响,探究持续光暴露对交感神经活动的作用是否和中枢SCN与RVLM之间存在直接或间接的纤维投射联系有关。基于上述背景,本研究主要为了明确:1)持续光暴露对正常和心衰大鼠的心功能的作用,且交感神经活动是否参与持续光暴露对心功能的作用;2)持续光暴露是否引起大鼠中枢RVLM氧化应激增强从而影响心功能;3)Nrf2通路是否参与中枢RVLM过表达ACE2改善持续光暴露引起的心功能下降;4)持续光暴露是否影响了中枢RVLM正常的昼夜节律,且RVLM与SCN之间是否有直接或间接神经纤维联系。研究方法1.所有SD大鼠均置于时控光照箱（Circadian Time（CT）07:00 Light on,ZT0;Circadian Time（CT）19:00 Light off,ZT12）12h Light/12h Dark（LD）光暗交替环境下集中饲养,至少适应两周后进行实验。然后将部分动物置于24小时持续光照（Constant Light,CL）环境下饲养,观察比较动物在两种环境中的心功能差异。2.通过尾动脉测压系统连续一周监测大鼠ZT12时在LD环境和CL环境下的血压和心率变化,观察两种环境对动物清醒状态下血压（收缩压SBP和舒张压DBP）和心率（HR）的影响。然后采用眶静脉采血,连续5周监测大鼠在LD和CL环境中ZT12时血浆去甲肾上腺素（NE）,肾上腺素（E）,Ang II,糖皮质激素（GC）,心房钠尿肽（ANP）和脑钠肽（BNP）的浓度变化。通过心脏超声,Millar心导管术以及心脏Masson染色,检测持续光暴露四周、八周后大鼠的心功能变化和心脏纤维化程度。分离大鼠肾交感神经,检测持续光暴露四周、八周后大鼠的基础肾交感神经活动（renal sympathetic nerve activity,RSNA）以确定引起心功能改变的最短光暴露时间。3.心衰模型的建立:通过结扎心脏冠脉建心衰（HF）模型,假手术（Sham）动物心脏只穿线不结扎,两组动物均置于LD环境下饲养。术后四周通过心脏超声和心导管术监测两组动物心功能变化,并通过心脏H&E染色验证心衰模型。然后将正常大鼠和心衰大鼠分组:LD组,CL组,HF-LD组和HF-CL组,开始实验。4.光暴露结束后,通过心脏超声和心导管术检测LD组,CL组,HF-LD组和HF-CL组的心功能变化。连续两周记录HF-LD组和HF-CL组的心脏射血分数。然后灌注取材心脏,通过Masson染色,观察并统计四组动物的心脏纤维化面积（%）。5.分离动物肾交感神经,通过记录RSNA比较LD组,CL组,HF-LD组和HF-CL组动物的交感神经活动情况。通过ELISA检测四组大鼠血浆NE的浓度,最后通过免疫组化DAB染色RVLM脑片,观察并统计四组大鼠RVLM中c-fos阳性神经元百分比,通过Western Blot检测四组动物RVLM中c-fos蛋白表达。6.通过Western Blot和DHE染色分别检测LD组,CL组,HF-LD组和HF-CL组动物中枢RVLM中ACE2,Mas和Nrf2通路蛋白的表达以及氧化应激水平,并检测LD组和CL组RVLM中Nrf2磷酸化水平。然后中枢RVLM微量注射慢病毒过表达ACE2,通过DHE染色RVLM脑片检测过表达ACE2后LD+Lenti-GFP组,LD+Lenti-ACE2组,CL+Lenti-GFP组和CL+Lenti-ACE2组RVLM中ROS水平,然后通过心脏超声和心导管术检测四组大鼠的心功能,最后通过Western Blot检测四组动物Nrf2/HO-1/NQO-1通路蛋白表达情况。7.通过无线遥感连续监测LD组和CL组ZT 0-12和ZT 12-24的活动量,记录并比较两组动物24小时ZT 0-12和ZT 12-24的平均活动量。通过ELISA检测LD组和CL组褪黑素和皮质酮的昼夜分泌,比较LD组和CL组中两种节律激素ZT 0-12和ZT 12-24的分泌差异。通过RT-PCR检测LD组和CL组RVLM中24小时核心钟基因Bmal1和Clock的振荡表达。最后,将ROSA26-EGFP小鼠中枢RVLM微量注射逆行标记病毒AAVretro-cre-h Syn-EGFP,通过大脑连续切片观察GFP在全脑神经元胞体的表达,明确RVLM与SCN之间是否存在一级神经纤维投射,观察RVLM与SCN之间的神经纤维联系。结果1.持续光暴露导致正常大鼠血压升高和交感神经活动增强持续光暴露导致大鼠清醒状态下血压（SBP,DBP）持续升高（P<0.05 vs.LD）,并且光暴露四周引起血浆NE、Ang II、GC、BNP和ANP浓度显着增加。持续光暴露四周（CL 4W）导致大鼠左心室收缩末压力LVESP和左心室舒张末压力LVEDP升高,心脏纤维化面积（%）增加,±d P/d T显着下降（P<0.05 vs.LD）。而持续光暴露八周（CL 8W）大鼠LVESP降低,心脏纤维化面积（%）增加,心脏±d P/d T下降（P<0.01vs.LD）。与CL 4W组相比,CL 8W大鼠心脏±d P/d T进一步下降,心脏纤维化面积（%）进一步增加（P<0.05 vs.CL 4W）。同时CL 4W组的RSNA显着增强（8.64±0.48vs.20.02±1.24%Max,P<0.001 vs.LD）;而CL 4W的RSNA与LD组相比无显着性差异（8.64±0.48 vs.10.16±0.38%Max,P>0.05 vs.LD）。2.持续光暴露导致正常和心衰大鼠的心功能下降光暴露导致正常大鼠左室收缩末期内径LVIDs增加,左室射血分数LVEF和左室短轴缩短率LVFS下降（79.42±2.91%vs.93.64±2.02%;43.14±3.03%vs.63.24±3.91%,P<0.001 vs.LD）,心脏+d P/d T降低（5751.89±69.01 vs.7477.08±604.2mm Hg/s,P<0.01 vs.LD）。而光暴露导致心衰大鼠心脏+d P/d T进一步降低（2414.57±138.5 vs.3211.90±202 mm Hg/s,P<0.05 vs.HF-LD）,心脏纤维化面积（%）进一步加重（P<0.0001 vs.HF-LD）。心脏超声动态监测HF-LD组和HF-CL组的LVEF,发现持续光暴露导致心衰大鼠LVEF下降加快（P<0.001 vs.HF-LD）。3.持续光暴露增强正常和心衰大鼠中枢RVLM交感输出和RVLM神经元c-fos表达持续光暴露导致正常大鼠的RSNA显着增加（8.64±0.48 vs.20.02±1.24%Max,P<0.001 vs.LD）,心衰大鼠的RSNA进一步增强（20.10±1.16 vs.26.82±1.69%Max,P<0.05 vs.HF-LD）。而LD组与CL组麻醉状态下平均动脉压（MAP）无显着差异,HF-LD组MAP显着下降（P<0.05 vs.LD）。光暴露引起正常和心衰大鼠NE显着增加（P<0.0001 vs.LD;P<0.0001 vs.HF-LD）。同时,光暴露引起正常和心衰大鼠RVLM中c-fos阳性神经元增加（20.01±0.01%vs.13.02±0.10%,44.66±0.01%vs.13.02±0.10%,P<0.01 vs.LD;81.53±0.01%vs.44.66±0.01%,P<0.0001 vs.HF-LD）,c-fos蛋白表达增加（P<0.01vs.LD）,而HF-LD组与HF-CL组之间并无差异。4.持续光暴露导致正常和心衰大鼠中枢RVLM氧化应激水平增强,ACE2/Ang1-7/Mas R轴功能下调DHE染色结果显示,光暴露导致正常和心衰大鼠RVLM中ROS水平增加。Western Bolt结果发现,Nrf2磷酸化水平下降,下游HO-1和NQO-1蛋白表达也下降（P<0.05 vs.LD）。同时,光暴露引起正常和心衰大鼠ACE2和Mas R表达下降（P<0.001 vs.LD）,而心衰大鼠ACE2表达进一步下降（P<0.0001 vs.HF-LD）。HF-LD组与HF-CL组RVLM中ROS水平,Nrf2磷酸化和Mas R表达并无差异。5.中枢RVLM过表达ACE2降低持续光暴露导致的氧化应激,增强RVLM中Nrf2磷酸化从而改善心功能损伤中枢RVLM过表达ACE2后,与CL+Lenti-GFP组相比,CL+Lenti-ACE2组LVEF和LVFS（89.10±0.79%vs.74.92±0.73%,P<0.001;53.91±1.18%vs.38.42±0.63%,P<0.05）增加,心脏±d P/d T增加（5368.00±35.55 vs.4043.24±7.83 mm Hg/s;-4648.88±168 vs.-3376.37±144.2 mm Hg/s,P<0.05）。RVLM中ROS表达显着降低（P<0.05vs.CL+Lenti-GFP）,CL+Lenti-ACE2组RVLM中Nrf2磷酸化水平显着增加（P<0.0001vs.CL+Lenti-GFP）。LD+Lenti-ACE2组与LD+Lenti-GFP组RVLM中ROS表达无显着性差异。LD+Lenti-ACE2组RVLM中Nrf2通路下游HO-1和NQO-1蛋白表达增加（P<0.01vs.LD+Lenti-GFP）。CL+Lenti-ACE2组RVLM中HO-1和NQO-1蛋白表达显着增加（P<0.05vs.CL+Lenti-GFP）。6.持续光暴露导致正常大鼠昼夜节律异常持续光暴露导致正常大鼠昼夜活动量增加,但ZT0-12与ZT12-24期间的活动差异消失（P>0.05）,而LD组自发活动表现为ZT12-24（夜间）活动量多,ZT0-12（日间）活动量少,ZT12-24与ZT0-12期间的活动具有显着性差异（P<0.05）。LD组中褪黑素和皮质酮昼夜分泌具有显着差异（P<0.0001,P<0.05）,而CL组褪黑素和皮质醇分泌在ZT12-24与ZT0-12期间无显着性差异,失去昼夜节律性。而且,与LD组ZT12-24相比,CL组的褪黑素分泌在ZT12-24期间减少（P<0.01）。此外,与LD组ZT12-24相比,Cl组皮质酮分泌在ZT12-24期间增加（P<0.0001）,而与LD组ZT0-12相比,CL组皮质酮在ZT0-12期间也增加（P<0.0001）。同时,光暴露导致大鼠中枢RVLM钟基因Bmal1和Clock的振荡表达异常（P<0.01）。7.交感中枢RVLM接收节律中枢SCN的间接纤维投射将ROSA26小鼠中枢RVLM单侧注射逆行病毒AAVretro-cre-h Syn-EGFP,通过逆行示踪四周后进行全脑切片扫描,结果发现SCN神经元无GFP表达,而下丘脑室旁核PVN、背内侧部DM、外侧部LH、蓝斑核LC和中缝背核DR中神经元均有GFP表达。因此,交感中枢RVLM可能通过PVN、DM、LH、DR和LC与SCN产生间接神经网络联系。结论持续光暴露增强正常和心衰大鼠中枢RVLM交感输出,降低正常和心衰大鼠的心功能。中枢RVLM过表达ACE2通过增强Nrf2磷酸化的抗氧化效应降低持续光暴露引起的RVLM氧化应激和心功能损伤。光暴露导致中枢RVLM昼夜节律异常,交感中枢RVLM可能通过PVN、DM、LH、DR和LC接收SCN的间接神经纤维投射。
程子倩[7]（2020）在《KLF4对戊巴比妥诱导的睡眠的调控作用及其机制研究》文中研究表明目的:KLF4是Krüppel样因子家族17位成员之一,也是KLFs家族中最受关注的转录因子之一。KLF4在细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡等生理过程中起到调控作用,同时研究发现其在癫痫、阿尔兹海默症和创伤性脑损伤等中枢神经系统疾病中均发挥重要的作用。然而,其对睡眠的调控作用尚未见报道。睡眠是维持人体生命的不可或缺的一项生理活动。睡眠障碍除了受生理和环境的影响外还受遗传等因素的影响。有研究表明,KLF4在下丘脑中具有调控摄食的作用,考虑到下丘脑同时也是调控睡眠的关键脑部位,本实验采用不同镇静催眠药物诱导小鼠入睡,观察小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间的变化,同时对下丘脑中KLF4的表达水平进行分析;在进一步的研究中观察KLF4过表达对戊巴比妥诱导的小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响,并考察其对下丘脑中KLF4以及下游蛋白p53和与KLF4相互作用的蛋白STAT3表达变化的影响;最后通过免疫组织化学实验考察KLF4过表达对脑内促觉醒核团及促睡眠核团的影响,以探索KLF4调控睡眠的作用机制。方法:通过行为药理学实验考察不同镇静催眠药物对小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响,并通过免疫印迹实验检测下丘脑中KLF4的表达情况,考察KLF4是否在镇静催眠药物诱导的睡眠中发挥作用;采用脑立体定位术靶向注射介导KLF4表达的慢病毒于下丘脑外侧区,构建KLF4高表达的小鼠,待病毒表达三周后,通过行为药理学实验考察KLF4对戊巴比妥给药小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响;通过免疫印迹实验研究KLF4增强戊巴比妥的催眠作用的相关分子机制,主要考察下丘脑中KLF4、p53和STAT3的表达水平;采用免疫组织化学染色的方法,考察下丘脑外侧区KLF4的过表达对下丘脑外侧区、下丘脑腹外侧视前区和结节乳头体核中c-Fos表达的影响,为探讨KLF4的促进睡眠作用及其相关作用机制提供理论依据。结果:除氯胺酮组睡眠持续时间与盐水组相比未见显着性差异外,其他三个镇静催眠药物（戊巴比妥、水合氯醛和咪达唑仑）组小鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间都有显着性变化,且在免疫印迹实验中发现只有戊巴比妥显着增加了小鼠下丘脑中KLF4的表达;行为药理学实验结果发现,下丘脑外侧区过表达KLF4延长了戊巴比妥诱导的小鼠睡眠持续时间;在免疫印迹实验中,KLF4的过表达降低了下丘脑中p53的表达,并增加了下丘脑中STAT3的表达;免疫组织化学实验结果发现,下丘脑外侧区过表达KLF4增加了下丘脑外侧区和下丘脑腹外侧视前区中c-Fos的表达,降低了结节乳头体核中c-Fos的表达。结论:KLF4可增强戊巴比妥对小鼠的催眠作用,这与下丘脑外侧区和腹外侧视前区c-Fos表达增加与结节乳头体核c-Fos表达减少有关,这种促眠作用至少部分是通过抑制下丘脑p53和激活STAT3介导的。
李文康[8]（2020）在《针刺对PCPA失眠大鼠海马5-HT递质、5-HT1AR(5-HT2AR)/AC信号通路与二者关联性影响研究》文中研究说明目的:探讨针刺改善PCPA失眠在中枢5-HT睡眠递质及5-HT亚型受体后信号通路的作用机制。方法:选取70只健康SPF级SD雄性大鼠,随机抽选16只为正常组,剩余54只进行造模并筛选,随机分为3组:模型组、针刺（针刺脐内环合失眠穴方）组、非穴组,各16只。针刺组采用针刺脐内环合失眠穴方干预治疗,非穴组予针刺双侧肋下各2个固定点治疗,正常组、模型组则不采用任何针刺,仅予相同时间和强度的抓摸刺激。干预6天后,取大鼠海马组织,样本编号并相应保存待检;免疫组化法检测5-HT1A、5-HT2A受体形态学的变化;酶联免疫法检测各组海马5-HT的含量,放射免疫分析法测定AC活性,运用统计方法分析二者的关联性。结果:1.免疫形态学观察:相对于正常组,模型组大鼠海马5-HT1AR阳性表达数减少,呈散在、疏松排列;5-HT2AR阳性颗粒数目明显增加,阳性表达区域趋于集中;通过针刺后,针刺组大鼠海马5-HT1AR阳性表达颗粒分布集中且较规则,颜色加深;而5-HT2AR棕色表达数则明显减少,阳性区域颜色较浅。2.实验指标显示:A、相对于正常组,模型组海马区5-HT1AR表达下降而5-HT2AR表达上升（均P<0.01）;海马内5-HT含量显着下降（P<0.01）,AC活性降低（P<0.01）,模型组海马5-HT含量损害与AC活性损伤呈正相关性,r=0.648,P<0.01;B、非穴组各组数据与模型组均无显着性差异（均P>0.05）;且非穴组5-HT含量与AC活性相关性不强;C、与模型组比较,针刺组海马内5-HT1AR表达上升而5-HT2AR表达下降（P<0.01、P<0.01）;5-HT含量显着升高（P<0.01）,AC活性明显提高（P<0.01）,针刺对5-HT含量提高与AC活性上调也呈正相关性,r=0.644,P<0.01;D、与非穴组比较,针刺组海马内5-HT1AR表达上升,而5-HT2AR表达下降（P<0.01、P<0.01）;5-HT含量显着提高（P<0.01）,AC活性明显上调（P<0.01）。结论:1.PCPA模型大鼠海马呈现5-HT1A、5-HT2A受体形态异常;针刺有改善PCPA失眠模型大鼠海马5-HT1A、5-HT2A受体形态作用。2.PCPA模型大鼠海马呈现5-HT含量、AC活性均受损降低及二者的受损呈一定正相关性;而针刺脐内环穴合失眠方有显着升高其5-HT含量、上调其AC活性的作用,对二者的改善也呈一定相关性。3.实验支持该针法通过改善5-HT睡眠递质、5-HT亚型受体后信号通路机制及其交互机制综合起到治疗PCPA失眠的作用机制。
刘代强[9]（2020）在《单色蓝光对小鼠七氟烷全身麻醉的影响及机制研究》文中研究说明研究背景全身麻醉可被定义为一种遗忘、镇静、制动、镇痛以及意识消失等可逆性的药理学状态。世界卫生组织（WHO）的调查结果显示2007年全球手术量高达2.34亿例,其中大多数手术需要在全麻下进行,目前我国每年麻醉例数已达6000万居世界首位。尽管越来越多的患者因为外科手术或有创诊疗需要接受全身麻醉,然而全麻药物是如何导致意识消失以及又是如何从全麻中恢复意识的具体机制至今仍是自然科学未解之谜。麻醉诱导和苏醒与自然睡眠和觉醒在某种程度上有相似之处。目前,不少研究通过干预睡眠或觉醒相关的某个特定的功能核团或某种特定类型神经元来研究全身麻醉的机制,例如,异氟烷全身麻醉下,通过光遗传学手段特异性激活腹侧被盖区（ventral tegmental area,VTA）多巴胺能神经元可以使小鼠出现觉醒反应;靶向毁损大鼠基底前脑（basal forebrain,BF）胆碱能神经元可缩短全麻诱导时间,延迟全麻的苏醒等等,然而以自然睡眠觉醒调控的神经环路为切入点,观察调控自然睡眠觉醒的外界环境因素,是否影响全麻诱导、维持和苏醒的研究目前为数不多。单色蓝光（monochromatic blue light,MBL）的波长在400 nm490 nm之间,对生物机体既有利也有害。其中415455 nm之间的蓝光波长短、能量高,可直接穿透晶状体到达眼底的视网膜,从而导致视网膜细胞发生衰亡,此波段的蓝光是有害蓝光;波段在455 nm490 nm的蓝光,有调整生物节律的作用,睡眠-觉醒、认知、情绪、记忆力等都与其密切相关,此波段的蓝光是有益蓝光。固有的自主感光性视网膜神经节细胞（intrinsically photosensitive retinal ganglion cells,ip RGCs）对波长在460480 nm之间的蓝光特别敏感,在蓝光参与调节睡眠-觉醒中发挥了重要作用。动物研究表明,470 nm的蓝光通过ip RGCs表达的M1型黑视蛋白增加觉醒时间。临床研究表明,晚上暴露于460 nm的单色蓝光2小时,在第一个睡眠周期可有效降低慢波活动（slow wave activity,SWA:0.75–4.5 Hz）,而在第三个睡眠周期时可以增加前额的SWA,并在第一个和第三个睡眠周期均可缩短快速眼动睡眠（rapid eye movement sleep,REMS）时间。越来越多的研究表明全身麻醉与睡眠-觉醒有部分共同的神经环路机制,调控调节睡眠-觉醒的某些特定核团或者神经递质,可影响全麻的全身作用。麻醉药物也可以作用于睡眠中枢,如丙泊酚麻醉接近自然睡眠的状态,可产生类似于非快速眼动睡眠（non-rapid eye movement sleep,NREMS）的脑电图（electroencephalogram,EEG）,但单色蓝光是否影响全身麻醉尚不清楚。哺乳动物下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN）是机体主要的中枢神经系统昼夜节律起搏点,调控着包括睡眠-觉醒在内的24小时生物节律。光作为最有效的环境刺激之一,在哺乳动物中具有视觉图像形成和非视觉图像形成（non-imageforming,NIF）功能。光通过表达在ip RGCs上的黑视蛋白直接或者间接影响NIF功能。其中ip RGCs投射到SCN发挥包括同步昼夜节律生物钟,抑制松果体褪黑素分泌,调节瞳孔对光反射,改变睡眠和觉醒,影响情绪和认知等不同作用。最新的研究表明,蓝光使得小鼠SCN的Fos m RNA的表达增加,导致肾上腺自主神经支配的皮质酮升高,从而增加小鼠的觉醒行为。此外,SCN作为光调节睡眠-觉醒的信息整合中枢,将单突触和多突触连接投射到与睡眠-觉醒相关的下丘脑内,从而影响睡眠和觉醒。研究表明SCN向下丘脑背内侧核（dorsomedial hypothalamus,DMH）有密集的投射,DMH将抑制性的γ-氨基丁酸能神经纤维投射至腹外侧视前核（ventrolateral preoptic nucleus,VLPO）,将兴奋性的谷氨酸能神经纤维投射至外侧下丘（lateral hypothalamus,LH）。此外,SCN也可通过DMH投射到蓝斑（locus coeruleus,LC）,从而兴奋睡眠-觉醒网络中的促觉醒神经元以及大脑皮层发挥促觉醒作用。Pilorz等人的研究表明环境蓝光通过激活SCN对C57BL/6小鼠发挥促觉醒作用,而环境绿光通过兴奋VLPO则表现出相反的效应,即促睡眠作用。因此单色蓝光是否通过SCN以及SCN下游核团影响七氟烷麻醉诱导、维持和苏醒目前尚不明确。为探讨单色环境蓝光对七氟烷麻醉的影响及其机制,我们测量了翻正反射消失（loss of righting reflex,LORR）时间与翻正反射恢复（recovery of righting reflex,RORR）时间,以观察单色蓝光对七氟烷麻醉诱导和苏醒的影响。然后,通过记录皮层脑电图（electroencephalogram,EEG）和肌电图（electromyogram,EMG）监测七氟烷麻醉下的爆发抑制,计算EEG爆发抑制率（burst-suppression ratio,BSR）和EEG频谱能量,以评估七氟烷麻醉下单色蓝光对爆发抑制的影响。采用免疫荧光染色和局部场电位（local field potential,LFP）记录来观察七氟烷麻醉下单色蓝光对SCN神经元活性的影响。通过对小鼠双侧SCN核团的局部电毁损建立SCN毁损模型,采用行为学、EEG–EMG监测进一步证实SCN参与了单色蓝光对七氟烷麻醉的促觉醒作用。最后,我们采用免疫荧光染色观察在七氟烷麻醉下SCN典型投射区c-Fos的表达,探讨其下游的可能机制。研究方法与结果第一部分单色蓝光对七氟烷麻醉诱导和苏醒的影响方法:采用雄性C57BL/6J（C57）小鼠（10-12周龄,体重22-26 g）作为研究对象,所有实验都是在白天（8:00 am-5:00 pm）进行。1.观察单色蓝光对七氟烷麻醉诱导的影响:在七氟烷麻醉开始前,将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内适应30 min并暴露在室内环境光下,当开始1 MAC七氟烷麻醉的同时,在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800 lux的多色白光（polychromatic white light,PWL）或者单色蓝光（monochromatic blue light,MBL）（460nm）,待小鼠翻正反射消失时,观察记录PWL或者MBL对小鼠LORR时间的影响。2.观察单色蓝光对七氟烷麻醉苏醒的影响:将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内维持1 MAC七氟烷麻醉30 min并暴露在室内环境光下,当停止七氟烷麻醉的同时,在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800 lux的PWL或者MBL（460 nm）,待小鼠翻正反射恢复时,观察记录PWL或者MBL对小鼠RORR时间的影响。3.观察单色蓝光在七氟烷麻醉苏醒时对EEG的影响:将置了EEG-EMG电极的C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内维持1 MAC七氟烷麻醉30 min并暴露在室内环境光下,当停止七氟烷麻醉的同时,在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800 lux的PWL或者MBL（460 nm）。从开始麻醉,全程记录小鼠的脑电和肌电,直至小鼠意识完全恢复,出现体动后停止记录。结果:1.在七氟烷麻醉诱导过程中,与PWL组（181.1 s±10.60）相比,MBL组（176.0 s±7.976）小鼠七氟烷麻醉诱导翻正反射消失的时间没有显着差异。2.在七氟烷麻醉苏醒过程中,与PWL组（133.1 s±13.53）相比,MBL组（38.75 s±5.291）小鼠七氟烷麻醉苏醒翻正反射恢复的时间显着缩短（p<0.001）。3.脑电分析结果表明,在七氟烷麻醉苏醒期间,与PWL组相比,MBL使麻醉-脑电图状态迅速过渡到清醒-脑电图状态。停止七氟烷吸入后100 s的EEG能量分析结果显示,与PWL组相比,MBL组小鼠delta波相对能量下降（p<0.01）,spindle,beta,low gamma和high gamma波相对能量增加（p<0.05）,而theta和alpha波相对能量保持不变。第二部分单色蓝光对七氟烷麻醉所致脑电爆发抑制的影响方法:采用雄性C57BL/6J（C57）小鼠（10-12周龄,体重22-26 g）作为研究对象,所有实验都是在白天（8:00 am-5:00 pm）进行。将置了EEG-EMG电极的C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下,2.5%七氟烷连续麻醉30 min后,在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800 lux的PWL或者MBL（460 nm）,继续2.5%七氟烷麻醉30 min。从开始麻醉,全程记录小鼠的脑电和肌电,直至PWL或者MBL 30 min结束才停止记录。结果:1.在2.5%七氟烷连续麻醉时,与MBL暴露前10 min相比,MBL暴露后第一个10min的BSR下降了31%（p<0.05）,MBL暴露后第二个10 min的BSR下降了42%（p<0.01）,MBL暴露后第三个10 min的BSR下降了55%（p<0.01）。然而,PWL暴露后第一个10 min、第二个10 min、第三个10 min的BSR均与PWL暴露前10min的BSR无显着差异。2.脑电分析结果显示,在2.5%七氟烷连续麻醉下,MBL改变了爆发抑制的脑电波模式,导致更多的爆发产生,并且同一小鼠的脑电能量频谱显示,MBL暴露后的EEG能量明显高于MBL暴露前。而PWL暴露前后的EEG振幅、频率和能量均没有变化。MBL暴露前后120 s的绝对能量频谱密度比较结果显示,与MBL暴露前相比,除了spindle波,其他所有频段的能量均显着增加（p<0.05）。而PWL暴露前后120 s的绝对能量频谱密度比较结果显示,PWL暴露后的EEG能量在所有频段与PWL暴露前无统计学差异。第三部分单色蓝光通过激活SCN对七氟烷麻醉发挥促觉醒作用方法:采用雄性C57BL/6J（C57）小鼠（10-12周龄,体重22-26 g）作为研究对象,所有实验都是在白天（8:00 am-5:00 pm）进行。1.观察七氟烷麻醉下单色蓝光对SCN神经元c-Fos表达的影响:将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下,2.5%七氟烷连续麻醉30 min后,在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800 lux的PWL或者MBL（460 nm）,继续2.5%七氟烷麻醉30 min。七氟烷麻醉后,立即用1%戊巴比妥钠（100mg/kg,i.p）对小鼠进行深度麻醉,然后心脏多聚甲醛灌注取材,采用免疫荧光法检测SCN神经元活化情况。2.观察七氟烷麻醉下单色蓝光对SCN局部场电位（LFP）的影响:将置了EEG-EMG和LFP电极的C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下,2.5%七氟烷连续麻醉30 min后,在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800 lux的PWL或者MBL（460 nm）,继续2.5%七氟烷麻醉30 min。从开始麻醉,全程记录小鼠的脑电、肌电和场电位,直至PWL或者MBL 30 min结束才停止记录。3.SCN双侧电毁损:将40只雄性C57小鼠随机分成Sham组和SCN-lesioned（SCNx）组,每组20只。Sham组:将毁损电极置入小鼠双侧SCN,不通电流,停留20 s后取出电极。SCNx组:将毁损电极置入小鼠双侧SCN,通入2.5 m A的电流,持续20 s后取出电极。4.观察SCN毁损后单色蓝光对七氟烷麻醉诱导的影响:将14只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组,每组7只。将14只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组,每组7只。检测每组小鼠LORR时间的方法同第一部分。5.观察SCN毁损后单色蓝光对七氟烷麻醉苏醒的影响:将16只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组,每组8只。将16只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组,每组8只。检测每组小鼠RORR时间的方法同第一部分。6.观察SCN毁损后单色蓝光在七氟烷麻醉苏醒时对EEG的影响:将12只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组,每组6只。将12只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组,每组6只。每组脑电监测的方法同第一部分。7.观察SCN毁损后单色蓝光对七氟烷麻醉所致脑电爆发抑制的影响:将16只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组,每组8只。将16只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组,每组8只。每组脑电监测的方法同第二部分。结果:1.免疫荧光结果显示,与PWL组相比,MBL组小鼠SCN c-Fos表达水平显着升高（p<0.0001）。2.局部场电位结果显示,与MBL暴露前相比,MBL暴露后小鼠SCN局部场电位总能量显着增加（p<0.05）。而PWL暴露前后小鼠SCN局部场电位差异无统计学意义。3.采用尼氏染色观察所有SCN毁损组（SCNx）和假毁损组（Sham）小鼠的SCN连续切片。结果显示Sham组小鼠SCN完整,均匀对称分布在第三脑室两侧。而SCNx组小鼠SCN被直流电流毁损后,原SCN位置处呈空泡状,说明SCN毁损完全。4.行为学结果显示,在七氟烷麻醉诱导过程中,Sham+MBL组（171.3 s±11.72）与Sham+PWL组（186.1 s±11.59）小鼠翻正反射消失的时间没有显着差异。SCNx+MBL组（154.6 s±8.78）与SCNx+PWL组（158.4 s±9.604）小鼠翻正反射消失的时间也没有显着差异。5.行为学结果显示,在七氟烷麻醉苏醒过程中,MBL促进了Sham组小鼠七氟烷麻醉苏醒,Sham+MBL组（60.13 s±13.38）与Sham+PWL组（147.9 s±16.27）小鼠翻正反射恢复的时间有显着差异（p<0.001）。而MBL对SCNx组小鼠七氟烷麻醉苏醒无影响,SCNx+MBL组（147.6 s±12.71）与SCNx+PWL组（156.8 s±12.32）小鼠翻正反射恢复的时间无显着差异。6.脑电分析结果表明,在七氟烷麻醉苏醒期间,与Sham+PWL组相比,Sham+MBL组使麻醉-脑电图状态迅速过渡到清醒-脑电图状态。而在SCNx组小鼠,MBL未发生此种变化,并和PWL暴露后对皮层脑电的影响一致。停止七氟烷吸入后100s的EEG能量分析结果显示,与Sham+PWL组相比,Sham+MBL组小鼠delta波相对能量显着下降（p<0.0001）,theta、beta、low gamma和high gamma波相对能量显着增加（p<0.05）,而alpha和spindle波相对能量保持不变。而在SCNx组小鼠,经MBL暴露的EEG能量与经PWL暴露的EEG能量在各频段均无明显差异。7.爆发抑制的结果显示,在2.5%七氟烷连续麻醉时,与Sham+MBL暴露前10 min相比,Sham+MBL暴露后第一个10 min的BSR下降了21%（p<0.01）,Sham+MBL暴露后第二个10 min的BSR下降了39%（p<0.01）,Sham+MBL暴露后第三个10min的BSR下降了56%（p<0.001）。然而,Sham+PWL暴露后第一个10 min、第二个10 min、第三个10 min的BSR均与Sham+PWL暴露前10 min的BSR无显着差异。而在SCNx组小鼠,MBL暴露后第一个10 min、第二个10 min、第三个10 min的BSR均与MBL暴露前10 min的BSR无显着差异。PWL暴露后第一个10 min、第二个10 min、第三个10 min的BSR均与PWL暴露前10 min的BSR无显着差异。8.爆发抑制期间脑电分析结果显示,假毁损组（Sham）小鼠在2.5%七氟烷连续麻醉下,MBL改变了爆发抑制的脑电波模式,导致更多的爆发产生,并且同一小鼠的脑电能量频谱自身对照显示,MBL暴露后的EEG能量明显高于MBL暴露前。而PWL暴露前后的EEG振幅、频率和能量均没有变化。MBL暴露前后120 s的绝对能量频谱密度比较结果显示,与MBL暴露前相比,MBL暴露后所有频段的能量均显着增加（p<0.05）。而PWL暴露前后120 s的绝对能量频谱密度比较结果显示,PWL暴露后的EEG能量在所有频段与PWL暴露前无统计学差异。SCN毁损组（SCNx）小鼠在2.5%七氟烷连续麻醉下,MBL不改变爆发抑制的脑电波模式,并且同一小鼠的脑电能量频谱自身前后对照显示,MBL暴露后的EEG能量与MBL暴露前无明显变化。此外,PWL暴露前后的EEG振幅、频率和能量均没有变化。MBL暴露前后120 s的绝对能量频谱密度比较结果显示,MBL暴露后的EEG能量在所有频段与MBL暴露前无统计学差异。而PWL暴露前后120 s的绝对能量频谱密度比较结果显示,PWL暴露后的EEG能量在所有频段与PWL暴露前无统计学差异。第四部分SCN下游促觉醒核团激活参与单色蓝光对七氟烷麻醉发挥促觉醒作用方法:采用雄性C57BL/6J（C57）小鼠（10-12周龄,体重22-26 g）作为研究对象,所有实验都是在白天（8:00 am-5:00 pm）进行。将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下,2.5%七氟烷连续麻醉30 min后,在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800 lux的PWL或者MBL（460 nm）,继续2.5%七氟烷麻醉30 min。七氟烷麻醉后,立即用1%戊巴比妥钠（100mg/kg,i.p）对小鼠进行深度麻醉,然后心脏多聚甲醛灌注取材,采用免疫荧光法检测SCN下游相关脑区的神经元活化情况。结果:免疫荧光结果显示,与PWL组相比,MBL组小鼠VLPO c-Fos表达水平无明显差异,LC TH和c-Fos均阳性的表达水平无明显差异,但LH c-Fos的表达水平显着增加（p<0.0001）,PFC c-Fos的表达水平显着增加（p<0.0001）。统计学分析所有数据采用均数±标准误表示,并用Graph Pad Prism 6进行统计学分析。SCN毁损前的行为学结果（Time to induction和Time to emergence）和EEG各频段相对能量频谱密度以及免疫荧光结果采用独立样本非配对t检验以及韦尔奇校正（Welch’s correction）。重复测量设计（BSR）中的组间比较采用重复测量单因素方差分析（repeated measures（RM）one-way ANOVA）进行检验,多假设检验采用Tukey’s多重比较检验。SCN毁损后的行为学结果和EEG各频段相对能量频谱密度采用普通的单因素方差分析（ordinary one-way ANOVA）进行检验,多假设检验采用Tukey’s多重比较检验。采用配对t检验分析光源处理前后的EEG各频段绝对能量频谱密度和LFP整个频段的绝对能量频谱密度。p<0.05认为差异具有统计学意义。研究总结1.主要研究结果1.1在1 MAC七氟烷麻醉诱导过程中,单色蓝光不改变小鼠翻正反射消失的时间。而在1 MAC七氟烷麻醉苏醒过程中,单色蓝光缩短了小鼠翻正反射恢复的时间,并且单色蓝光显着降低了皮层脑电的delta波相对能量,增加spindle、beta、low gamma和high gamma波相对能量。1.2在2.5%七氟烷麻醉维持过程中,单色蓝光可以显着降低2.5%七氟烷连续麻醉时的爆发抑制率（BSR）,且随暴露时间的延长,对BSR的影响越明显。此外,脑电频谱分析结果表明,2.5%七氟烷持续麻醉时,单色蓝光可以显着增加除spindle波外EEG各频段的绝对能量。1.3单色蓝光可以显着上调七氟烷麻醉下SCN神经元c-Fos的表达水平,并可显着增强七氟烷麻醉下SCN LFP活动。SCN电毁损后,单色蓝光对七氟烷麻醉的诱导时间和觉醒时间均不产生影响,并且也不影响2.5%七氟烷连续麻醉时的BSR。此外,脑电分析结果表明,SCN电毁损后,单色蓝光对七氟烷麻醉苏醒时各频段的EEG能量均无影响,也不影响2.5%七氟烷连续麻醉时各频段的EEG能量。1.4单色蓝光可以显着上调七氟烷麻醉下LH和PFC的c-Fos表达水平,而对促觉醒核团LC和促睡眠核团VLPO c-Fos表达水平无影响。2.研究结论2.1单色蓝光可以显着加快七氟烷麻醉苏醒而不影响麻醉诱导。2.2单色蓝光可以减少2.5%七氟烷连续麻醉时爆发抑制的产生。2.3单色蓝光通过激活SCN在七氟烷麻醉中发挥减浅麻醉和促觉醒作用。2.4 SCN下游促觉醒核团激活与单色蓝光在七氟烷麻醉中的促觉醒作用有关。3.创新之处3.1发现单色蓝光可以促进七氟烷麻醉苏醒。3.2发现单色蓝光可以减少七氟烷麻醉爆发抑制的产生。3.3揭示了SCN激活参与单色蓝光减浅七氟烷麻醉深度和促进觉醒的机制。3.4本研究为利用自然的环境因素促进全身麻醉苏醒和处理全身麻醉苏醒延迟提供了新的思路。4.展望4.1目前还没有临床批准上市的药物,能安全有效地常规用于临床促进全麻苏醒。在本研究中,作为一种简单易行的非药物干预手段,利用自然的单色蓝光环境可以在停止七氟烷吸入后促进大脑皮层觉醒,缩短苏醒时间。此外,在连续七氟烷深麻醉下,单色蓝光增加了大脑皮层兴奋性并降低了爆发抑制率,有减浅麻醉的效果。苏醒期给与单色蓝光可能作为一种简单有效的非药物自然促觉醒方法应用于临床,特别是全麻后苏醒延迟者。4.2蓝光已被证实可以影响免疫,提高细菌清除率,减轻炎症反应,降低氧化应激。Zhou等人发现药物遗传学激活小鼠LH促食欲素能神经元促进异氟烷麻醉苏醒。在本研究中,我们发现七氟烷麻醉下单色蓝光可激活LH神经元,而LH中主要是促食欲素能神经元,可能是蓝光促进觉醒的机制。文献报道激活促食欲素能神经元能发挥镇痛作用。Ibrahim等人的一项研究也报道了蓝光可以提高正常大鼠的热痛阈。因此临床上在苏醒期给予蓝光环境可能不仅有助于加快麻醉苏醒,而且还可能发挥减轻疼痛和炎症的作用,这一假设仍需进一步的临床研究来证实。
陈子文[10]（2020）在《基于模式生物平台研究酸枣仁汤对斑马鱼睡眠行为的影响》文中研究表明目的:失眠是一种常见的睡眠障碍性疾病,其发病率大概为10%-20%,其中,约有一半具有慢性病程。长期的失眠严重破坏人们的身心健康,给社会和家庭带来沉重的经济负担。现有的用于治疗失眠的药物受限于不可避免的不良副反应。因此,有必要寻找更为安全有效的治疗方法。中医药是一种极具潜力的补充替代治疗方法。酸枣仁汤是传统中医用于失眠治疗的经典方药,全方由酸枣仁、川芎、知母、茯苓、甘草五味药物配伍而成,具有养血安神之功效。目前,其镇静催眠效应已在临床药理研究和斑马鱼外的一些动物模型中被证实,但是仍面临着药效物质基础以及作用机制阐释滞后的问题。斑马鱼模式生物行为学平台的建立为鉴别酸枣仁汤的安眠活性成分以及探究其相关的作用通路提供了新思路和新手段。本研究旨在通过斑马鱼行为学药物筛选平台,评估酸枣仁汤、酸枣仁及其化学成分酸枣仁皂苷A对斑马鱼幼鱼睡眠/觉醒行为的影响,鉴别酸枣仁皂苷A是否为酸枣仁汤的活性成分。通过比较分析酸枣仁皂苷A诱导的行为表型与已表征化合物诱导的行为表型,鉴别酸枣仁皂苷A可能作用的神经信号通路。进一步通过通路依赖性行为学实验和分子生物学实验验证潜在的作用通路。为明晰酸枣仁汤安眠作用的药效物质基础及其潜在的作用机制提供一定数据。方法:采用全自动视频追踪系统对药物处理后的斑马鱼幼鱼进行连续24小时的行为学监测,分析与睡眠/觉醒相关的6个行为学参数（睡眠总时间、睡眠回合的次数、睡眠回合的长度、睡眠潜伏期、总的活动量、觉醒的活动量）,并构建行为学指纹图谱进行可视化。分别对睡眠和觉醒行为的代表性参数睡眠总时间和觉醒的活动量以10分钟为间隔进行时间序列分析以及进行定量分析。对酸枣仁皂苷A诱导的行为学指纹图谱与已表征的化合物诱导的行为学指纹图谱进行相关性分析,计算皮尔森相关系数,并用热图可视化结果,同时对酸枣仁皂苷A和已表征的化合物的行为表型进行层次聚类分析,根据相关程度鉴别出候选神经信号通路。此外,利用表型缺陷的秀丽线虫突变体进行通路依赖性行为学实验,验证酸枣仁皂苷A对候选神经通路的影响作用。最后,采用实时荧光定量PCR法检测酸枣仁皂苷A对斑马鱼中的神经通路相关基因的mRNA表达水平的影响,从分子水平验证酸枣仁皂苷A的作用与候选神经通路的相关性。成果:1.与空白对照比较,低、中、高浓度的酸枣仁汤均可增加斑马鱼幼鱼的睡眠总时间、睡眠回合的长度、觉醒时的活动量以及白天的睡眠回合次数,并减少夜间的睡眠回合次数和白天的活动总量,缩短夜间的睡眠潜伏期。此外,低、中浓度酸枣仁汤可引起斑马鱼幼鱼白天的睡眠潜伏期延长,与之相反,高浓度酸枣仁汤可缩短白天的睡眠潜伏期。至于夜间的活动总量,在中、高浓度中表现为增加,在低浓度中则为减少。与空白对照比较,低、中、高浓度的酸枣仁均可增加斑马鱼幼鱼的睡眠总时间、睡眠回合的长度、白天的睡眠回合次数以及夜间的觉醒活动量,并减少睡眠潜伏期、白天的总的活动量以及白天的觉醒活动量。此外,夜间的睡眠回合次数在低浓度时表现为轻微增加,在中、高浓度时表现为减少。而夜间的总的活动量在低浓度时轻微减少,在中、高浓度时则相反。与空白对照相比,低、中、高浓度的酸枣仁皂苷A普遍增加斑马鱼幼鱼的睡眠总时间、睡眠回合的长度以及白天睡眠回合的次数,并减少夜间睡眠回合的次数、总的活动量以及白天的觉醒活动量。此外,在测试的3个酸枣仁皂苷A浓度下,斑马鱼幼鱼的睡眠潜伏期和夜间的觉醒活动量分别表现为较低幅度的减少和较低幅度的增加。2.时间序列分析结果显示,正常斑马鱼幼鱼的睡眠行为大多发生在一天之中的夜间,而觉醒活动大多发生在一天之中的白天,呈现出明显的昼夜节律。与正常对照比较,经不同浓度酸枣仁汤给药处理的幼鱼表现出明显的睡眠总时间延长和不同程度的觉醒活动量增加。经酸枣仁给药处理的幼鱼表现出不同程度的睡眠总时间增加,觉醒的活动量减少。与酸枣仁相似,经酸枣仁皂苷A给药处理的斑马鱼幼鱼睡眠总时间延长,觉醒的活动量减少。此外,经酸枣仁汤、酸枣仁和酸枣仁皂苷A处理的幼鱼同时保留有睡眠/觉醒行为的昼夜节律,表现为在夜间有较长的睡眠时间,在白天有较多的觉醒活动。相反,褪黑素处理的幼鱼其睡眠/觉醒昼夜节律趋于扁平化。3.定量分析显示,与空白对照比较,低浓度和中浓度酸枣仁汤处理后的斑马鱼幼鱼夜间以及白天的睡眠总时间明显增加（P＜0.05）,而高浓度酸枣仁汤处理后的幼鱼仅明显增加了白天的睡眠总时间（P<0.05）,其夜间的睡眠总时间无显着变化（P>0.05）。此外,中浓度的酸枣仁汤可明显增加斑马鱼幼鱼夜间及白天的觉醒活动量（P<0.05）,高浓度的酸枣仁汤明显增加幼鱼夜间的觉醒活动量（P<0.05）,而低浓度的酸枣仁汤对幼鱼的觉醒活动量无明显影响（P＞0.05）。与空白对照比较,中浓度和高浓度的酸枣仁分别明显增加了斑马鱼幼鱼夜间和白天的睡眠总时间（P<0.05）,低浓度的酸枣仁对幼鱼的睡眠总时间无明显影响（P＞0.05）。此外,高浓度的酸枣仁明显降低了幼鱼白天的觉醒活动量（P<0.05）,其余浓度对幼鱼的觉醒活动量均无明显影响（P＞0.05）。与空白对照比较,在中浓度的酸枣仁皂苷A作用下,斑马鱼幼鱼的睡眠总时间显着增加（P<0.05）,而在低浓度和高浓度的酸枣仁皂苷A作用下,斑马鱼幼鱼的睡眠总时间分别仅在夜间和白天显着增加（P<0.05）。此外,中浓度的酸枣仁皂苷A显着降低斑马鱼幼鱼白天的觉醒活动量（P<0.05）,所有测试浓度的酸枣仁皂苷A对夜间的觉醒活动量均无显着影响（P＞0.05）。4.浓度间行为表型稳定性分析结果显示,酸枣仁汤低、中、高3个不同浓度间存在较高程度的相关性（浓度间皮尔森相关系数均>0.7）。酸枣仁低、中、高3个不同浓度间存在较高程度的相关性（浓度间皮尔森相关系数均>0.65）。酸枣仁皂苷A低、中、高3个不同浓度间也存在较高程度的相关性（浓度间皮尔森相关系数均>0.8）。5.酸枣仁皂苷A与已表征化合物的行为表型相关性分析发现,酸枣仁皂苷A诱导的行为表型与靶向5-HT能和DA能递质系统的化合物具有较高的相关性。其中5-HT能化合物所占比例更大。层次聚类分析发现,所有药物/化合物分为4大类,其中,低、中、高浓度的酸枣仁皂苷A与调节5-HT能、DA能、GABA能、组胺能、肾上腺素能、腺苷能及褪黑素能的化合物归为一大类,而5-HT能和DA能活性化合物占据较大比例。再深入分类发现,低浓度酸枣仁皂苷A与D2多巴胺激动剂、5-HT再摄取抑制剂、D2/3多巴胺激动剂、5-HT再摄取抑制剂以及mGluR5谷氨酸拮抗剂聚为一类。中浓度和高浓度的酸枣仁皂苷A与D2/3多巴胺激动剂、A3腺苷拮抗剂、5-HT1A受体激动剂、α 1肾上腺素拮抗剂聚为一类。6.秀丽线虫5-HT依赖性咽部抽吸运动检测结果显示,在所测试浓度（30和100μM）下,酸枣仁皂苷A显着增加了野生型N2线虫的咽部抽吸频率（P<0.05）。然而,所有测试浓度的酸枣仁皂苷A均没有对tph-1突变线虫的咽部抽吸频率产生明显影响（P＞0.05）。7.实时荧光定量PCR结果显示,与正常对照相比,暴露于酸枣仁皂苷A的幼鱼中的sert mRNA表达水平显着下调（P<0.05）,而5-HT1A的mRNA表达水平无明显变化（P>0.05）。结论:1.酸枣仁汤、酸枣仁及酸枣仁皂苷A在斑马鱼幼鱼中均有促进睡眠的作用,酸枣仁皂苷A是酸枣仁汤安眠效应的活性成分之一。2.酸枣仁汤对斑马鱼幼鱼的睡眠/觉醒行为的影响表现为抑制和兴奋的双向调节作用,而酸枣仁、酸枣仁皂苷A仅表现为抑制的单相效应。3.酸枣仁皂苷A可能通过介导5-HT信号通路发挥安眠作用。
二、睡眠剥夺及恢复睡眠1小时后大鼠脑干中c-Fos蛋白的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、睡眠剥夺及恢复睡眠1小时后大鼠脑干中c-Fos蛋白的表达（论文提纲范文）
（1）运用光遗传和神经环路示踪技术研究前庭神经核的功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 神经科学研究技术简介 |
| 1.2 前庭系统与前庭神经核 |
| 1.3 前庭研究概述 |
| 1.4 前庭疾病相关的动物模型 |
| 1.5 急性前庭失衡症 |
| 1.6 光遗传学 |
| 1.7 转基因Cre小鼠 |
| 1.8 嗜神经病毒的神经环路示踪技术 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 病毒注射 |
| 2.3 单侧前庭神经损坏 |
| 2.4 动物抚触与适应 |
| 2.5 行为学实验 |
| 2.5.1 旷场实验 |
| 2.5.2 THL(Tail-hanging landing)悬尾-落地姿势测试 |
| 2.5.3 小鼠睡眠剥夺范式 |
| 2.6 行为学评估 |
| 2.6.1 旷场实验 |
| 2.6.2 Tail-hanging landing(THL)悬尾-落地姿势测试 |
| 2.7 脑组织处理 |
| 2.7.1 预处理 |
| 2.7.2 免疫荧光染色及封片镜检 |
| 2.8 数据分析及处理 |
| 2.8.1 病毒表达分析 |
| 2.8.2 行为学数据分析 |
| 2.8.3 绘图及显着性分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 前庭神经核脑区光遗传学的可实现性 |
| 3.2 单侧前庭损坏手术小鼠模型的重构 |
| 3.2.1 旷场实验 |
| 3.2.2 支撑表面积 |
| 3.2.3 Tail-hanging landing(THL)悬尾-落地姿势测试 |
| 3.3 光遗传学刺激单侧前庭神经核的小鼠模型评估 |
| 3.3.1 旷场实验 |
| 3.3.2 支撑表面积 |
| 3.3.3 Tail-hanging landing(THL)悬尾-落地姿势测试 |
| 3.4 光遗传学小鼠模型与单侧前庭损坏手术小鼠模型对比 |
| 3.4.1 旷场实验 |
| 3.4.2 支撑表面积 |
| 3.4.3 THL(Tail-hanging landing)悬尾-落地姿势测试 |
| 3.4.4 总结 |
| 3.5 单侧VN内 VGlut2+神经元类光激活引起小鼠运动功能的短期障碍 |
| 3.6 顺行腺相关病毒示踪显示前庭神经核内侧核存在由蓝斑投射过来的神经末梢 |
| 3.7 蓝斑-前庭神经核的投射为去甲肾上腺素能(TH~+) |
| 3.8 睡眠剥夺压力模型引起蓝斑去甲肾上腺素能神经元激活 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 技术参考讨论 |
| 4.2 实验结果讨论 |
| 4.2.1 小鼠相关行为表征的讨论 |
| 4.2.2 光刺激激活前庭神经核单侧GABA能神经元结果讨论 |
| 4.2.3 蓝斑研究结果的分析与讨论 |
| 4.2.4 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）下丘脑orexin神经元-蓝斑底核神经通路的活动特征及功能研究（论文提纲范文）
| 英文缩略一览表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 蓝斑底核投射的orexin神经元活动特征 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 蓝斑底核投射的orexin神经元功能及环路机制初步研究 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Orexin神经元群参与睡眠/觉醒调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 学习期间在投和已发表的论文 |
| 致谢 |
（3）中脑腹侧被盖区多巴胺转运蛋白在丙泊酚全麻大鼠苏醒中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要使用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 尾静脉置管 |
| 2.2 VTA毁损模型的建立 |
| 2.3 腺相关病毒构建 |
| 2.4 VTA区立体定位注射AAV2·DAT·RNAi及EEG电极植入 |
| 2.5 翻正反射消失及恢复测定 |
| 2.6 麻醉深度评分标准 |
| 2.7 在体脑电记录 |
| 2.8 免疫荧光实验 |
| 2.9 蛋白免疫印记法(Western blot)观察PFC区c-fos蛋白的表达变化 |
| 2.10 统计分析 |
| 实验结果 |
| 1 毁损VTA区后各组大鼠LORR、RORR比较 |
| 2 丙泊酚全身麻醉对VTA区 DAT表达影响 |
| 3 AAV靶向立体定位注射位置验证 |
| 4 各组大鼠行为学结果比较 |
| 5 各组大鼠皮层脑电分析 |
| 6 各组大鼠PFC区 c-fos蛋白表达 |
| 6.1 免疫荧光 |
| 6.2 Western blot |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 中脑腹侧被盖区多巴胺能神经通路作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（4）天麻中的有效成分靶向MT1发挥镇静安神作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 睡眠 |
| 1.1.1 睡眠的生理功能及其意义 |
| 1.1.2 睡眠的监测及其判断 |
| 1.1.3 睡眠时相的划分及其特点 |
| 1.1.4 睡眠障碍概述 |
| 1.1.5 睡眠剥夺与记忆 |
| 1.1.6 睡眠障碍的治疗 |
| 1.1.7 失眠动物模型的构建 |
| 1.2 G蛋白偶联受体 |
| 1.2.1 G蛋白偶联受体的结构及分类 |
| 1.2.2 与睡眠相关的G蛋白偶联受体 |
| 1.3 褪黑素受体在哺乳动物中参与的睡眠调节 |
| 1.3.1 褪黑素受体 |
| 1.3.2 褪黑素受体结构与分类 |
| 1.3.3 褪黑素受体参与睡眠相关的功能 |
| 1.4 天麻 |
| 1.4.1 植物学 |
| 1.4.2 天麻的成分 |
| 1.4.3 天麻中活性成分的药理作用 |
| 1.5 天然产物作用靶标的鉴定 |
| 1.5.1 小分子探针技术 |
| 1.5.2 细胞热转变分析技术(CETSA) |
| 1.5.3 药物亲和靶标稳定系技术(DARTS) |
| 1.5.4 荧光共振能量转移技术(FRET) |
| 1.6 鼻腔滴注的给药方式 |
| 1.7 本论文研究意义 |
| 第二章 以MT_1、MT_2、OX_1、D_2、D_3为靶点的药物筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种及质粒 |
| 2.1.2 实验用细胞 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.2.6 化合物对受体高表达细胞系刺激实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 以多巴胺受体D_2为靶点的药物筛选 |
| 2.3.2 以多巴胺受体D_3为靶点的药物筛选 |
| 2.3.3 以食欲素受体OX_2为靶点的药物筛选 |
| 2.3.4 以褪黑素受体MT_2为靶点的药物筛选 |
| 2.3.5 以褪黑素受体MT_1为靶点的药物筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 在MT_1受体水平上对天麻活性成分的验证和鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种及质粒 |
| 3.1.2 主要仪器及设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 酶切法验证天麻活性成分与褪黑素受体的结合 |
| 3.2.2 热稳定(CETSA)法验证天麻活性成分与褪黑素受体的结合 |
| 3.2.3 点突变方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 巴利森苷A浓度梯度处理MT_1受体细胞验证相互作用 |
| 3.3.2 热稳定法验证巴利森苷A与 MT_1受体细胞的相互作用 |
| 3.3.3 酶切法(DARTS)验证巴利森苷A与 MT_1受体细胞的相互作用 |
| 3.3.4 荧光共振能链转移技术(FRET)验证巴利森苷A与 MT_1受体的相互作用 |
| 3.3.5 点突变关键结合位点区域氨基酸的褪黑素受体MT_1受体与巴利森苷A的相互作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 天麻中的活性成分改善小鼠睡眠实验的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验分组 |
| 4.2.2 鼻腔给药 |
| 4.2.3 睡眠各指标指标判定 |
| 4.2.4 自发运动能力测试 |
| 4.2.5 q-PCR实验 |
| 4.2.6 多巴胺(DA)和五羟色胺(5-HT)检测 |
| 4.2.7 血常规检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 天麻的三种入血成分给药小鼠可以发挥安神作用 |
| 4.3.2 天麻的三种入血成分给药小鼠可以发挥镇静作用 |
| 4.3.3 天麻的三种入血成分可以不同程度增加小鼠脑内神经递质多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的含量 |
| 4.3.4 天麻对小鼠脑肝肾脾炎症因子表达的影响 |
| 4.3.5 天麻对小鼠血常规生化指标的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A(攻读学位期间发表论文目录) |
（5）肾不藏志不寐的理论及实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 肾不藏志不寐理论研究 |
| 1 肾、志的含义及两者之间的关系 |
| 2 肾藏志对寐寤的调节作用 |
| 3 肾不藏志不寐的因机证治 |
| 4 常用安肾志的方药 |
| 5 小结 |
| 第二部分 肾不藏志不寐大鼠模型研究 |
| 研究一 肾不藏志不寐大鼠氧化应激、凋亡基因、炎性因子和神经递质的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 研究二 肾不藏志不寐大鼠海马转录组学研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 安肾志药物远志对肾不藏志不寐大鼠镇静促眠作用的实验研究 |
| 研究一 远志对肾不藏志不寐大鼠神经递质和炎性因子的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 研究二 远志对肾不藏志不寐大鼠作用的海马转录组学研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 失眠大鼠模型的建立及中药治疗对氯苯丙氨酸致失眠模型大鼠的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）持续光暴露增强中枢交感输出对正常和心衰大鼠心功能的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验动物 |
| 二、主要仪器和试剂 |
| 三、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、持续光暴露导致正常大鼠血压升高和交感神经活动增强 |
| 二、持续光暴露导致正常和心衰大鼠的心功能下降 |
| 三、持续光暴露增强正常和心衰大鼠中枢RVLM交感输出和RVLM神经元c-fos表达 |
| 四、持续光暴露导致正常和心衰大鼠RVLM氧化应激水平增强,ACE2/Ang1-7/MasR轴功能下调 |
| 五、中枢RVLM过表达ACE2降低持续光暴露导致的氧化应激,增强RVLM中Nrf2磷酸化从而改善心功能损伤 |
| 六、持续光暴露导致正常大鼠昼夜节律异常 |
| 七、交感中枢RVLM接收节律中枢SCN的间接纤维投射 |
| 讨论 |
| 课题创新点和不足之处 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 昼夜节律系统在心血管疾病的研究现状 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（7）KLF4对戊巴比妥诱导的睡眠的调控作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 睡眠-觉醒系统及相关神经元 |
| 1.1.1 下丘脑外侧区 |
| 1.1.2 下丘脑视前区 |
| 1.1.3 结节乳头体核 |
| 1.1.4 基底前脑 |
| 1.1.5 腹侧被盖区 |
| 1.2 转录因子与睡眠 |
| 1.3 KLF_4 |
| 1.3.1 KLF_4 概述 |
| 1.3.2 KLF_4 在神经系统疾病中的作用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂及配制 |
| 2.3 实验仪器及设备 |
| 2.4 药物 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 脑立体定位微量注射介导KLF_4 表达的慢病毒 |
| 2.5.2 翻正反射实验 |
| 2.5.3 免疫印迹实验 |
| 2.5.3.1 小鼠下丘脑组织收集 |
| 2.5.3.2 下丘脑蛋白提取 |
| 2.5.3.3 免疫印迹实验 |
| 2.5.4 免疫组织化学实验 |
| 2.5.5 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 不同镇静催眠药物对小鼠睡眠行为的影响 |
| 3.2 不同镇静催眠药物对小鼠下丘脑KLF_4 表达的影响 |
| 3.3 KLF_4 过表达对戊巴比妥给药小鼠睡眠行为的影响 |
| 3.4 KLF_4 过表达对下丘脑KLF_4,p53和STAT_3 表达的影响 |
| 3.5 KLF_4 过表达对下丘脑外侧区中c-Fos表达的影响 |
| 3.6 KLF_4 过表达对腹外侧视前区中c-Fos表达的影响 |
| 3.7 KLF_4 过表达对结节乳头体核中c-Fos表达的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介及学术成果 |
| 致谢 |
（8）针刺对PCPA失眠大鼠海马5-HT递质、5-HT1AR(5-HT2AR)/AC信号通路与二者关联性影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对失眠的认识 |
| 1.1 失眠概念及分类 |
| 1.1.1 原发性失眠 |
| 1.1.2 继发性失眠 |
| 1.2 失眠的影响因素 |
| 1.3 失眠发病机制的认识 |
| 1.3.1 与睡眠相关的脑结构及功能 |
| 1.3.2 中枢神经递质与失眠 |
| 1.3.3 下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱与失眠 |
| 1.3.4 AC活性与cAMP含量异常 |
| 1.4 失眠的西医治疗 |
| 1.4.1 药物治疗 |
| 1.4.2 非药物疗法 |
| 1.4.3 现代医学治疗的不足 |
| 2 祖国医学对失眠的研究进展 |
| 2.1 失眠的中医病因 |
| 2.1.1 外感六邪 |
| 2.1.2 内伤情志 |
| 2.1.3 胃肠不和 |
| 2.1.4 气血亏虚 |
| 2.2 失眠的中医病机 |
| 2.2.1 《黄帝内经》的睡眠理论 |
| 2.2.2 阴阳失调 |
| 2.2.3 脏腑不调 |
| 2.2.4 血瘀气郁 |
| 2.2.5 虚实为纲 |
| 2.3 失眠的中医发病学说 |
| 2.4 中药对失眠的治疗 |
| 2.5 针灸治疗失眠 |
| 2.5.1 针刺疗法 |
| 2.5.2 特种针法 |
| 2.5.3 灸法对失眠的治疗 |
| 2.5.4 针灸综合疗法治疗失眠 |
| 2.6 其他疗法 |
| 2.6.1 推拿对失眠的治疗 |
| 2.6.2 民族医学 |
| 2.7 中医针灸治疗的优势 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与设备 |
| 1.2 动物与分组 |
| 1.3 造模 |
| 1.4 干预方法 |
| 1.5 标本采集与储存 |
| 1.6 操作方法 |
| 1.6.1 使用ELISA法测定5-羟色胺(5-HT)含量 |
| 1.6.2 免疫组化染色法检测大鼠海马5-HT_(1A)、5-HT_(2A)受体的表达 |
| 1.6.3 放射免疫分析法(RIA)检测腺苷酸环化酶(AC)活性 |
| 1.7 数据统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各组大鼠海马5-HT、AC活性及二者相关回归方程 |
| 2.2 诸组大鼠海马5-HT_(1A)R、5-HT_(2A)R免疫组化病理影响 |
| 2.2.1 200倍镜下病理形态学描述 |
| 2.2.2 各组大鼠海马5-HT_(1A)R、5-HT_(2A)R的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验研究选择PCPA模型的理由 |
| 3.2 针刺脐内环穴合失眠方组方用穴分析 |
| 3.3 针刺失眠穴方合脐内环有调节睡眠-觉醒周期的作用机制分析 |
| 3.4 针刺脐内环穴合失眠穴方调节海马5-HT_(1A)与5-HT_(2A)受体表达的机制分析 |
| 3.5 针刺脐内环穴合失眠穴方调节失眠大鼠海马5-HT含量及AC活性的作用及意义 |
| 3.5.1 脐内环穴合失眠穴方调节失眠大鼠海马5-HT含量及AC活性的作用 |
| 3.5.2 针刺脐内环穴合失眠穴方调节5-HT含量与AC活性的关联性探讨 |
| 3.5.3 5-HT含量与AC活性关联性研究结果的意义 |
| 4 问题与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 穴位埋线联合其他疗法治疗失眠的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（9）单色蓝光对小鼠七氟烷全身麻醉的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 单色蓝光对七氟烷麻醉诱导和苏醒的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 单色蓝光对七氟烷麻醉所致脑电爆发抑制的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 单色蓝光通过激活SCN对七氟烷麻醉发挥促觉醒作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 SCN下游促觉醒核团激活参与单色蓝光对七氟烷麻醉发挥促觉醒作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 光参与调节睡眠-觉醒的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读博士学位期间发表的论文 |
（10）基于模式生物平台研究酸枣仁汤对斑马鱼睡眠行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 睡眠的调控机制 |
| 1.1.1 睡眠的内稳态调节 |
| 1.1.2 睡眠的生物钟机制 |
| 1.1.3 睡眠调节的神经化学机制 |
| 1.2 斑马鱼模式生物系统 |
| 1.2.1 斑马鱼作为模式生物在睡眠研究中的独特优势 |
| 1.2.2 斑马鱼模式生物在睡眠相关药理筛选与评价中的应用 |
| 1.2.3 斑马鱼睡眠研究的进展 |
| 1.3 祖国医学对睡眠的认识 |
| 1.4 酸枣仁汤 |
| 1.4.1 酸枣仁汤的中医药文献研究 |
| 1.4.2 酸枣仁汤的化学成分研究 |
| 1.4.3 酸枣仁汤镇静催眠效应的药理研究 |
| 第二章 酸枣仁汤对斑马鱼睡眠/觉醒行为的影响 |
| 2.1 实验材料和仪器设备 |
| 2.1.1 主要实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 斑马鱼的饲养 |
| 2.2.2 药物的提取及配制 |
| 2.2.3 斑马鱼幼鱼的给药处理 |
| 2.2.4 斑马鱼睡眠/觉醒行为学测定 |
| 2.2.5 数据分析与处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 酸枣仁汤、酸枣仁及酸枣仁皂苷A对斑马鱼幼鱼睡眠/觉醒行为参数的影响 |
| 2.3.2 斑马鱼幼鱼睡眠/觉醒行为的变化趋势 |
| 2.3.3 斑马鱼幼鱼睡眠/觉醒行为参数的定量分析 |
| 2.3.4 酸枣仁汤、酸枣仁及酸枣仁皂苷A诱导的行为表型稳定性 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 基于斑马鱼睡眠/觉醒行为探究酸枣仁汤活性成分的生物靶标 |
| 3.1 实验材料和仪器设备 |
| 3.1.1 主要实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 靶向神经递质通路的预测 |
| 3.2.2 靶向神经递质通路的验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 酸枣仁皂苷A靶向神经递质通路的预测 |
| 3.3.2 酸枣仁皂苷A的靶标验证 |
| 3.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
四、睡眠剥夺及恢复睡眠1小时后大鼠脑干中c-Fos蛋白的表达（论文参考文献）
- [1]运用光遗传和神经环路示踪技术研究前庭神经核的功能[D]. 魏梦霞. 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院), 2021(08)
- [2]下丘脑orexin神经元-蓝斑底核神经通路的活动特征及功能研究[D]. 庞钰洁. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]中脑腹侧被盖区多巴胺转运蛋白在丙泊酚全麻大鼠苏醒中的作用[D]. 郭佳. 石河子大学, 2021(02)
- [4]天麻中的有效成分靶向MT1发挥镇静安神作用的研究[D]. 邢其郡. 昆明理工大学, 2021(02)
- [5]肾不藏志不寐的理论及实验研究[D]. 任小娟. 新疆医科大学, 2020(02)
- [6]持续光暴露增强中枢交感输出对正常和心衰大鼠心功能的作用研究[D]. 景佳妮. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [7]KLF4对戊巴比妥诱导的睡眠的调控作用及其机制研究[D]. 程子倩. 吉林大学, 2020(08)
- [8]针刺对PCPA失眠大鼠海马5-HT递质、5-HT1AR(5-HT2AR)/AC信号通路与二者关联性影响研究[D]. 李文康. 广西中医药大学, 2020(02)
- [9]单色蓝光对小鼠七氟烷全身麻醉的影响及机制研究[D]. 刘代强. 华中科技大学, 2020(01)
- [10]基于模式生物平台研究酸枣仁汤对斑马鱼睡眠行为的影响[D]. 陈子文. 广州中医药大学, 2020(06)