一、接种堆型艾美耳球虫早熟株对雏鸡血液理化指标及体重的影响（论文文献综述）
程振扬[1]（2021）在《柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价》文中研究指明鸡球虫病是一种呈全球性分布的寄生性原虫病,其病原有7种,其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）和毒害艾美耳球虫（E.necatrix）的致病性最强,分别引起鸡的急性盲肠球虫病和小肠球虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前,鸡球虫病的防治措施主要有在饲料或饮水添加药物和接种活虫苗两种方法。长期添加药物已引起耐药、污染环境和危害肉蛋品质等问题。活虫苗虽可产生较强的免疫保护效果,但存在着扩散病原、毒力返强等缺点,且生产成本较高,对免疫后鸡群的饲养管理要求较高。而基因工程疫苗可以解决这些难题。本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白Etgam22和Etgam59基因进行了克隆与原核表达,获得的重组蛋白rEtGAM22和rEtGAM59能被柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染鸡的康复血清识别,可提高免疫鸡的平均增重、降低卵囊产量。在此基础上,本研究利用杆状病毒表达系统对Etgam22基因进行表达,通过动物试验评价其对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的免疫保护力,并与原核表达的重组蛋白进行比较,最后通过动物试验评价rEtGAM22和rEtGAM59联合免疫的保护效果,为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析将优化后的Etgam22基因插入转座载体pFastbac1构建重组质粒,命名为pFastbac1-Etgam22;然后将pFastbacl-Etgam22转化到DH1OBac感受态细胞,构建重组杆状病毒穿梭载体,命名为Bacmid-Etgam22;将Bacmid-Etgam22转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,命名为reBac-Etgam22。重组杆状病毒在Sf9细胞诱导表达,获得真核表达蛋白rEtGAM22-e,其大小约35 kDa。用IFA检测结果显示重组蛋白能被抗原核表达蛋白rEtGAM22-p多克隆抗体识别;Western blot检测结果显示重组蛋白可被鼠抗His单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示真核表达蛋白rEtGAM22-e具有良好的反应原性和交叉反应原性。2.真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析以黄羽鸡为试验动物,主要以成活率、平均增重、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数、血清抗体水平等为指标,评价杆状病毒表达蛋白rEtGAM22-e对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果,并与原核表达蛋白rEtGAM22-p和rEtGAM59相比较。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:免疫组成活率均为100%,未免疫攻虫组为90%;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e组平均增重稍次于重组蛋白rEtGAM59组,但高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组病变记分高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组和rEtGAM59组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组卵囊减少率高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组;原核表达蛋白rEtGAM59组ACI最高,为158.83;真核表达蛋白rEtGAM22-e组血清抗体水平显着高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组。（2）对毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但ACI值要低。结论:rEtGAM22和rEtGAM59对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫能产生一定的免疫保护力;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e免疫保护力稍高于原核表达的重组蛋白rEtGAM22-p;重组蛋白rEtGAM59免疫保护效力高于重组蛋白rEtGAM22。3.重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析按上一章方法,评价rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:各试验组存活率均为100%;除rEtGAM22-e单免组外,其余各免疫组的平均增重均显着大于未免疫攻虫组（P<0.05）,且与未免疫未攻虫组相比差异不显着（P>0.05）;联合免疫低剂量组病变记分最低;联合免疫组卵囊减少率相近,分别为46.21%和44.70%,高于单免组;联合免疫组的抗球虫指数分别为153.43和157.65,高于单免组;联合免疫组的血清抗体水平显着高于单免组（P<0.05）。（2）对攻毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但抗球虫指数分别为158.28和160.34。结论:rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫保护效力高于单一重组蛋白免疫,联合免疫剂量100 μg（50+50）的保护效力要好于200 μg（100+100）剂量。
徐向东[2]（2021）在《鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用》文中研究表明鸡球虫病是由艾美耳球虫（Eimeria spp.）寄生于鸡肠道引起的一种寄生虫病,其病原有7种,常为混合感染。各种鸡球虫的流行病学、致病性、免疫原性以及对药物敏感性不尽一致。因此,对鸡球虫种类鉴定与流行病学调查有助于鸡球虫病的防控。鸡球虫种类鉴定的传统方法,主要根据卵囊形态、虫体寄生部位、眼观病变特征、潜在期等生物学特征,这不仅要饲养无球虫感染的雏鸡,而且鉴定过程费时费力。为此,本文根据鸡球虫核糖体DNA内转录间隔区1（ITS-1）序列设计7对种特异性引物,建立鉴定鸡球虫种类的单重PCR与多重PCR方法;构建球虫ITS-1重组质粒,以重组质粒DNA为球虫rDNA阳性标准品;最后用多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫流行病学调查。本研究建立的方法为鸡球虫病的防控提供了技术手段。1.鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立根据GenBank中柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）巨型艾美耳球虫（E.maxima）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、和缓艾美耳球虫（E.mitis）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）的ITS-1序列,设计7对种特异性引物,以7种鸡球虫的全基因组DNA为模板,分别进行PCR扩增,优化反应条件,建立7种球虫的单重PCR方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每对引物均能扩增出特异性条带,其大小分别为278bp（柔嫩艾美耳球虫）、383bp（毒害艾美耳球虫）、476bp（堆型艾美耳球虫）、220bp（巨型艾美耳球虫）、390 bp（早熟艾美耳球虫）、350bp（和缓艾美耳球虫）和311 bp（布氏艾美耳球虫）,其最小检测浓度为0.01 ng。在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的方法具有很强特异性和较高敏感性。2.鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立在7种鸡球虫中,柔嫰、堆型和巨型艾美耳球虫在临床上最常见;柔嫰、毒害和布氏艾美耳球虫致病性大,均在盲肠中形成卵囊,且卵囊形态相似;早熟、和缓和堆型艾美耳球虫潜在期相近,卵囊形态相似。快速鉴别这些球虫种类,有助于鸡球虫病的准确诊断与防控。为此,应用上述鸡球虫虫种特异性引物,建立了能同时鉴定3种鸡球虫的多重PCR方法,并分别对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每个多重PCR反应中的3对引物均能扩增出其特异性条带,其最小检测浓度为0.01 ng,其敏感性与单重PCR一致,在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的多重PCR方法具有很强特异性和较高敏感性。3.鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中的应用纯化7种鸡球虫的单重PCR扩增产物,分别连接到pGEM-TEasy载体中,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选及限制性酶切分析,获得含ITS-1序列的重组质粒;对重组质粒中插入的片段进行测序,用MegAgin 7.1.0软件进行序列分析,并采用邻位相连法（Neighbor-joiningmethod,NJ）构建系统发育进化树;分别以含鸡球虫ITS-1序列的重组质粒DNA为模板,对应已知球虫的卵囊DNA为阳性对照,用上述特异性引物进行PCR扩增,验证构建的7种鸡球虫重组质粒作为球虫rDNA阳性标准品的可能性。结果显示,柔嫩、毒害、巨型、堆型、早熟、和缓和布氏艾美耳球虫的ITS-1 片段大小分别为 278 bp、383 bp、220 bp、476 bp、390 bp、350 bp、311 bp,经系统发育进化树分析,均与GenBank中相应虫种处于同一分枝,表明重组质粒DNA可用作球虫rDNA 阳性标准品。4.多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用采用饱和盐水漂浮法和多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫种类调查。结果显示,饱和盐水漂浮法检查,65%（13/20）养殖户和64.5%（20/31）鸡群感染球虫;多重PCR检测,75%（15/20）养殖户和70.9%（22/31）鸡群感染球虫;共检测到7种球虫,柔嫩艾美耳球虫感染率为64.5%（20/31）,毒害艾美耳球虫为38.7%（12/31）,堆型艾美耳球虫为35.5%（11/31）,早熟艾美耳球虫为45.2%（14/31）,巨型耳艾美球虫为19.4%（6/31）,和缓艾美耳球虫为19.4%（6/31）,布氏艾美耳球虫为12.9%（4/31）;优势种为柔嫩艾美耳球虫;布氏艾美耳球虫感染率最低;球虫均为混合感染（100%）,混合感染2种球虫最多,为36.3%（8/22）。地面圈养鸡群的球虫感染率（80.0%）高于笼养（33.3%）。调查结果为该地区鸡球虫病有效防治提供了依据。
吴文君[3]（2020）在《如东县鸡球虫种类调查及柔嫩艾美耳球虫的耐药性检测》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种严重危害养鸡业的寄生原虫病,其病原有7种,分别是柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）、巨型艾美耳球虫（E.maxima）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、和缓艾美耳球虫（E.mitis）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）。不同种类的球虫其致病性不尽一致,且对同一种药物的敏感性也不一致。在自然情况下,球虫多为混合感染,在不同地区流行的球虫种类有所不同。目前,对该病的防治仍以药物为主,但长期使用药物已导致耐药性产生,影响药物效力。因此,对鸡球虫流行种类的调查与鉴定以及田间分离株的耐药性检测,是防控鸡球虫病的重要基础。为此,本文开展了以下工作。通过采用粪检卵囊、ITS-1序列的PCR检测、卵囊形态观察及动物回归试验相结合的方法,在如东县对21个养殖场（户）的28个鸡群进行了球虫种类和流行病学的调查。结果显示,21个养殖场均检出球虫卵囊,在28个鸡群中26个感染球虫,其中50日龄以下鸡群的卵囊阳性率为83.3%（10/12）,50日龄及以上鸡群的卵囊阳性率为100%（16/16）;共检测到7种鸡球虫,其检出率柔嫩艾美耳球虫为85.7%,堆型艾美耳球虫为92.9%,巨型艾美耳球虫为82.1%,毒害艾美耳球虫为42.9%,和缓艾美耳球虫为42.9%,早熟艾美耳球虫为39.3%,布氏艾美耳球虫为14.3%,优势种为堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫;球虫混合感染率为92.3%（24/26）,其中混合感染4种球虫最高达46.2%（12/26）;PCR检测结果与卵囊形态特征观察及动物回归试验结果相一致。采用动物感染试验法,以相对卵囊产量（ROP）、病变记分减少率（RLS）、最适抗球虫百分数（POAA）和抗球虫指数（ACI）等4项判定指标,分析2株柔嫩艾美耳球虫田间分离株及1株实验室保存株对地克珠利和盐霉素的耐药性。结果显示,分离株1和实验室保存株对地克珠利无耐药性,分离株2对地克珠利无耐药性或轻度耐药;3个虫株对盐霉素均完全耐药。分析其原因,可能是盐霉素在该县曾经或现在已有广泛使用,而地克珠利在该市使用较少或停用时间较长。鉴于这一检测结果,建议养鸡场应停用盐霉素,改用地克珠利。在使用时进行轮换用药或联合用药,以延长药物的使用寿命。结论:如东县养鸡场流行7种鸡球虫,优势种是堆型、柔嫩和巨型艾美耳球虫,多数为混合感染;两鸡场对地克珠利无耐药性或轻度耐药,对盐霉素产生了完全耐药。
余水兰[4]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究》文中研究指明鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种家禽传染性寄生虫病。由于使用药物防治球虫病会产生耐药性及药物残留的问题,因此迫切需要免疫预防替代药物成为球虫病控制的主导途径。由早熟株卵囊组成的减毒活疫苗是目前应用最广泛的球虫病疫苗,但球虫活疫苗对免疫鸡的生长具有潜在不良影响。研究发现免疫增强剂不仅可增强球虫活疫苗的免疫效果,同时也可降低接种疫苗带来的不良影响。与母株相比,球虫早熟株具有潜在期明显缩短、致病性减弱、繁殖能力降低等独特的生物学特性,但其早熟的分子机制不明。为此,本研究一方面通过笼养试验和平养试验研究盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖等对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强效果和免疫鸡增重的影响,以筛选获得每种免疫增强剂的有效剂量,为筛选球虫活疫苗的免疫增强剂奠定基础;另一面通过RNA-seq技术筛选柔嫩艾美耳球虫早熟株与母株孢子化卵囊的转录组差异,并对其中两个差异表达基因——柔嫩艾美耳球虫颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）的功能和特性进行初步分析,为探讨早熟性状产生的分子机制奠定基础。1.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验通过笼养试验评价盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖的不同剂量对柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的免疫增强效果,以筛选每种免疫增强剂的有效剂量。3日龄雏鸡进行首次免疫并服用免疫增强剂,10日龄时仅用卵囊进行二免,17日龄时用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体水平等作为评判指标。结果显示,0.05 mg～0.1 mg盐酸左旋咪唑、2.5 mg～5 mg黄芪多糖、2.5 mg～7.5 mg壳寡糖、1.25 mg酵母多糖以及10 mg地衣芽孢杆菌对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有免疫增强和促生长双重作用。2.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验通过平养试验对笼养试验中所获得的5种免疫增强剂的有效剂量进一步验证。3日龄雏鸡用柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊进行免疫并服用免疫增强剂,24日龄用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体、CD4和CD8分子、细胞因子（TNF-α、TGF-β1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10）水平等作为评价指标。结果显示,0.1 mg盐酸左旋咪唑可明显促进鸡CD4、CD8因子的增殖和TNF-α、IL-2的分泌,明显提高柔嫩艾美耳球虫的免疫效果,且有促生长的作用。2 mg和6 mg地衣芽孢杆菌、5 mg和7.5 mg壳寡糖、2.5 mg酵母多糖均可明显促进鸡CD8分子的增殖和TNF-α的分泌,具有免疫增强和促生长的作用。5 mg黄芪多糖对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有促生长作用,但免疫增强效果不显着,黄芪多糖对球虫具有免疫增强作用的有效剂量仍需进一步研究。3.柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析继续对本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育,经过11次的早熟株选育,潜在期由126 h缩短到107 h,缩短了19 h,与同源母株的潜在期141 h相比,缩短了34 h。通过RNA-seq技术比较了该早熟株与母株之间孢子化卵囊的转录组差异,筛选两个虫株之间的差异表达基因。结果共鉴定出差异表达基因6602个,早熟株上调表达基因3888个,下调表达基因2714个。这些差异基因主要与阳离子结合、未折叠蛋白结合、磷酸酯水解酶活性等功能相关,参与细胞内吞作用、泛素介导的蛋白水解、谷胱甘肽代谢、内质网蛋白加工等通路。利用qPCR对转录组数据分析获得的22个差异表达基因和5个非差异表达基因进行验证,结果显示27个基因的mRNA转录水平均与RNA-seq结果一致。研究结果为探索球虫早熟性状产生的分子机制奠定基础。4.柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析根据转录组学结果,选取两个早熟株下调基因——柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）进行特性和功能的初步研究。结果显示,EtRON2的mRNA转录水平在孢子化卵囊中最高,未孢子化卵囊和第二代裂殖子次之,子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子、胞内子孢子和第二代裂殖子顶端棒状体的位置,以及未成熟裂殖体的细胞质中;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON3转录水平在孢子化卵囊阶段转录水平最高,未孢子化卵囊阶段次之,第二代裂殖子和子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子和胞内子孢子顶端棒状体的位置,第二代裂殖子的胞质以及未成熟裂殖体的表面;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON2和EtRON3在早熟株孢子化卵囊中转录水平均明显低于母株,与转录组学分析的结果一致,这提示EtRON2和EtRON3与早熟性状的产生有着一定的关系。但是EtRON2和EtRON3在球虫入侵以及发育调节中的作用仍需深入研究。
华恩玉[5]（2020）在《堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究》文中提出鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生原虫病,据不完全统计每年球虫病给家禽养殖业造成的经济损失超过30亿美元。长期以来,鸡球虫病的防控主要依赖药物。但随着球虫耐药性的不断增强以及药物残留危害食品安全,鸡球虫病的防控措施由药物防治转向疫苗免疫预防。目前,用于临床的鸡球虫病疫苗主要是活虫苗,亚单位疫苗仅见有一种,即由分离于巨型艾美耳球虫（Eimeriamaxima）配子体的3种蛋白研制而成。堆型艾美耳球虫（E.acervulina）是养鸡场流行最广泛的鸡球虫之一,可引起鸡的亚临床球虫病,影响鸡的生长发育,降低饲料利用率。迄今,国内外对堆型艾美耳球虫配子体蛋白及其基因少有报道,其重组蛋白的免疫保护力也尚无见有报道。为此,本文对堆型艾美耳球虫配子体蛋白56基因（Eagam56）与82基因（Eagam82）进行了克隆和序列分析,分别构建了 2个基因的原核表达质粒,诱导表达后鉴定了重组蛋白的免疫原性,并经动物免疫保护试验评价了重组蛋白对堆型艾美耳球虫的免疫保护力,研究结果将为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.堆型艾美耳球虫Eagam56基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam56基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam56表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后进行诱导表达,表达产物分别进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam56基因全长为1323 bp,具有一个大小为1323 bp的完整开放阅读框,编码440个氨基酸;与Genbank上的Eagam56基因序列对比,其同源性为99.9%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam56基因含有10个抗原决定簇,其中3个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约49 kDa,以可溶蛋白形式居多,可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM56具有良好的免疫原性和交叉抗原性。2.堆型艾美耳球虫Eagam82基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam82基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam82表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后,对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam82基因全长为1704bp,具有一个大小为1704bp的完整开放阅读框,编码568个氨基酸;与Genbank上的Eagam8基因序列对比,其同源性为99.4%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam82基因含有15个抗原决定簇,其中2个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约82 kDa,以可溶蛋白形式为多;可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM82具有良好免疫原性和交叉抗原性。3.重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力以黄羽肉鸡为试验动物,以鸡的增重、相对增重率、卵囊减少率、病变记分、抗球虫指数（ACI）以及血清抗体水平等为评价指标,评价重组蛋白rEaGAM56、rEaGAM82以及2种重组蛋白联合应用的免疫保护效果。结果显示,rEaGAM56与rEaGAM82高（200 μg/鸡）、中（100 μg/鸡）剂量免疫组以及联合免疫组,鸡临床症状减轻。随着免疫剂量的增加,鸡的相对增重率与卵囊减少率增加,平均肠道病变记分减少。联合免疫高剂量组（各100 μg/鸡重组蛋白）的相对增重率与卵囊减少率达73.74%和74.27%。rEaGAM56、rEaGAM82、联合免疫高剂量组的 ACI 分别为 148.24、143.92 和 148.74。rEaGAM56的免疫保护力较rEaGAM82的强,rEaGAM56和rEaGAM82免疫鸡后均能产生血清抗体。结论:两种重组蛋白免疫均能产生一定的免疫保护力。
赵玉洁[6]（2020）在《鸡球虫卵黄抗体的制备及其应用研究》文中研究说明鸡球虫病是由艾美尔属（Eimeria）的一种或多种艾美尔球虫引起的一种严重危害养鸡业的广泛性寄生虫病。近年来,随着养鸡集约化、规模化提高,对于鸡球虫病的防治提出更高要求。长期以来,化学药物是防治鸡球虫病的主要手段,因药物的频繁使用,导致球虫耐药性增加,且化学药物残留也给公共卫生带来极大危害。此外,球虫疫苗的研制和应用在生产得到初步应用,但尚存在毒力返强、免疫保护力不足等问题,从而疫苗的使用存在一定的局限性。因此,寻找安全高效防治鸡球虫病成为该领域的研究热点之一。卵黄抗体具有高特异性,且无副作用,在多种疾病的防治中实践中的作用业已证实。由此可见,通过抗球虫的卵黄抗体来防治球虫病可成为该病防控的新途径。本研究利用4种球虫活卵囊免疫蛋鸡,制备其卵黄抗体,将其作为饲料添加剂饲喂球虫感染的雏鸡,以探究卵黄抗体在实际治疗球虫病的效果,为日后在临床上防治该病提供参考依据。1抗球虫四价IgY的制备与鉴定将纯化后的柔嫩、巨型、堆型和早熟艾美耳球虫的活卵囊按照同等比例混合,超声破碎后与佐剂混匀作为免疫原,对180日龄蛋鸡进行肌注免疫,剂量为1×105个/只,10 d一免,共免疫5次。产蛋后每隔10 d取蛋分离卵黄,采用水稀释法结果饱和硫酸铵法提取卵黄抗体。通过SDS-PAGE对提纯的IgY进行纯度测定SDS-PAGE分析表明,提纯的卵黄抗体由约66 KDa的重链和约40 KDa的轻链组成,纯度可达95%。2建立间接ELISA方法分析免疫后抗体消长规律柔嫩、堆型、巨型和早熟球虫卵囊经超声破碎,将抗原浓度调整为0.74mg/m L,通过对反应条件的优化,筛选间接ELISA方法的最优条件;对其特异性和敏感性进行分析。同时运用已建立方法评估免疫后抗体消长规律。结果显示抗原最佳稀释度为1:400,;特异性试验证明卵黄抗体能特异性识别球虫抗原。且该方法具有良好的敏感性和重复性;3免后卵黄中抗体水平开始逐渐上升,并在第60 d达到峰值,最高效价达到1:25600,并较长时间之内保持高水平3 IgY在抗鸡球虫病中的效果评估将15日龄白羽肉鸡随机分成9组,分别为白对照组、红对照组、阴性卵黄粉对照组、药物添加组和卵黄粉添加组Ⅰ～Ⅴ,每组15只。从15日龄开始在饲料中添加卵黄抗体,连续6 d,药物添加组接受0.25g/只,连用4 d;在鸡群16日龄时,除白对照组外,其他组别均灌服感染性球虫卵囊1×104个/只。分别计算相对增重率、卵囊排出数、盲肠病变和抗球虫指数等为指标,综合评价卵黄抗体治疗鸡球虫感染效果。结果表明,饲喂卵黄抗体后各试验组的平均增重、病变记分、卵囊减少率和ACI等指标均优于感染对照组和阴性对照组。
刘国辉[7]（2019）在《不同球虫疫苗商品肉鸡免疫效果研究》文中提出鸡球虫病是危害严重的寄生虫病之一,以往主要依靠药物来进行防治,但是耐药性的产生较快,食品安全要求越来越高,尤其是欧盟要求肉鸡不使用球虫药,依靠免疫方法来控制鸡球虫病,逐渐成为出口欧盟肉鸡球虫病防控的主要手段。本试验通过对规模化地面养殖商品肉鸡,使用不同球虫疫苗、不同免疫剂量、不同免疫方式与用药对照组比较。利用每克粪便球虫卵囊数值（OPG）进行计数,球虫肉眼病变评分,肠道损伤肉眼病变评分等方法,对免疫后鸡的卵囊排出情况、感染程度和肠道损伤程度进行对比评估。通过对成活率、单只均重、料肉比、欧洲指数、ND、AI抗体等指标进行数据分析,对比鸡只健康状况和生产成绩。筛选出最佳免疫方案,为将来商品肉鸡正确球虫免疫提供第一手数据支持。试验结果表明:（1）Y疫苗1倍量0天喷雾组与Y疫苗0.6倍量0天喷雾组,两组均在免疫后19天出现了OPG均值最高峰;但0.6倍量组峰值低,高峰出现后,OPG均值下降缓慢,又在免疫后23天和33天出现两个较小峰值,因此,1倍量OPG均值趋势明显好于0.6倍量。从球虫眼观病变评分、肠道眼观病变评分结果看1倍量与0.6倍量差异不显着,说明损伤与剂量关系不大,可能与疫苗本身毒力关系更大。从生产成绩方面Y疫苗1倍量与0.6倍量差异不显着。（2）Z疫苗1倍量3天拌料组嗉囊饱食率（91%±2.22%）高于Y疫苗0天喷雾组舌尖红染率（81%±3.11%）,拌料组有更多的鸡可以接触到疫苗,每只鸡可以接触到更多的疫苗。Z疫苗1倍量3天拌料组免疫后17天出现OPG高峰,早于Y疫苗1倍量喷雾或0.6倍量喷雾组免疫后19天出现OPG高峰,更有利于尽早建立免疫力,后期补偿性生长。从球虫眼观病变评分、肠道眼观病变评分结果看Z疫苗1倍量3天拌料组病变程度较Y疫苗1倍量或0.6倍量喷雾组轻,进一步说明3日龄拌料组好于0日龄喷雾组,同时,说明Z疫苗本身毒力低于Y疫苗,符合供应商提供的说明。从生产成绩看,Z疫苗成绩优于Y疫苗。（3）各组出栏成活率为92.19%±2.93%,93.57%±1.33%,92.19%±5.17%,92.76±4.32%。各组间成活率差异均不显着（P>0.05）,说明球虫免疫对成活率几乎没有影响。（4）各组ND抗体分别为7.21±0.67,6.70±1.22,7.01±1.01,7.06±0.60;H9抗体分别为7.22±1.23;6.94±1.55;6.53±1.29;6.95±0.90。各组间ND、H9抗体差异均不显着（P>0.05）,说明球虫免疫对出栏前体液免疫ND、H9抗体几乎没有影响。（5）使用活疫苗进行球虫免疫快大型商品肉鸡,可以取得满意效果,防治球虫感染效果优于用药对照组。但从单只均重（试验组低于对照组0.27kg,0.23kg,0.09kg）、料肉比（试验组高于对照组0.14,0.13,0.09）、欧洲指数（试验组低于对照组50.2,46.4,30.5）等生产成绩看,用药对照组较疫苗免疫组优势明显。
于林增[8]（2019）在《抗柔嫩艾美耳球虫天然化合物及中药复方制剂的筛选》文中认为鸡球虫病由寄生在鸡肠上皮细胞内的艾美耳属多种球虫引发,该病发生率高,分布范围广,危害严重,给养鸡业造成严重的经济损失。长期以来,化学药物作为控制鸡球虫病的主流策略,使用化学药物防治鸡球虫病极易导致球虫产生耐药性,及鸡体抗球虫药物残留,从而影响人类健康。在饲料中添加各种抗球虫药虽然可以预防并控制球虫病,但往往诱发球虫的抗药性和药物残留等问题,是化学药物使用面临的挑战之一。中草药制剂的使用是防控鸡球虫病的有效策略之一,具有不易产生耐药性,毒副作用小等优点,具有较好的应用前景。本文通过体外传代细胞筛选法,确定有效天然化合物单体,并选择对应的有效中药组成方剂进行动物实验验证。首先,我们从华南部分地区主要为广东的部分地区不同规模的养鸡场采集粪便（垫料）样品,收集不同地理来源的球虫虫株,进行抗球虫药的耐药性调查,由于采样的特殊性,采样的鸡场均为发病鸡场。有针对性的采样,导致阳性率偏高。除广东揭阳和广东云浮两地,分离株中检测鸡球虫其他地区阳性率均为100%。全部都为混合感染,其中艾美耳球虫感染率67%,堆型艾美耳球虫感染率65%,这两类在感染中占绝对优势,属于优势虫种。根据卵囊强度统计,感染强度在“++++”的样品的所占比例42%,强度在“+++”的样品所占比例21%,感染强度在“++”的样品占21%,感染强度在“+”的样品占17%,卵囊强度偏高。根据所测11种目前应用较多抗球虫药物耐药性分析,耐药程度严重,同一株虫株,对多种药物同时耐药。球虫虫株对药物耐药性严重,通过结果可知拉沙洛西钠药物耐药性情况较轻,鸡球虫对其相对敏感。同时利用柔嫩艾美耳球虫MDBK细胞培养体系筛选单体化合物,获得在细胞上抗球虫生长效果较好的青蒿素、肉桂醛和常山酮。其中检测样品中,青蒿素和常山酮IC50值分别为7±0.6μM和2±0.3μM,敏感性较好。将其对应的中药成分,购买相应的中药,并根据鸡球虫病的特点和药典配伍禁忌,依据中药的有效成分和精简高效的原则组成三个中药方剂,通过观察治疗球虫病的临床效果,进行抗球虫方剂的筛选试验。通过中药复方抗球虫效果试验的动物实验,可筛选出方剂1（肉桂20、大黄10、青蒿20、仙鹤草18、伏龙肝20、陈皮18）和方剂3（白头翁1、仙鹤草1、青蒿1）效果优秀,方剂2（仙鹤草100、何首乌100,白头翁60、青蒿60、肉桂52）效果相对较差,并且在每只鸡每天1 g用量的时候效果最好,且在攻虫的当天给药效果相对更好,对抗柔嫩艾美耳球虫有一个较好的效果。方剂1和方剂3的ACI值分别为165.13和173.90,与药物对照组磺胺氯吡嗪钠的ACI值169.01相比,效果相当。以ELISA检测试剂盒测定各阶段鸡血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-12水平变化来看,攻虫对照组在中整个实验过程中并无明显变化,中药方剂以及药物对照组血清中的细胞因子也基本保持稳定,说明试验中药物对鸡血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-12水平没有影响。从临床病理组织切片来看,在攻虫的当天给药,抗球虫效果较好;攻虫前两天给药的鸡肠道会有轻微的炎性反应,分析原因可能是方剂的泻下作用会对鸡体肠道造成轻微损伤。结合体内外试验结果,对中药配方及使用剂量进行优化,进一步分析其抗球虫效果,为今后鸡球虫病的有效防控提供理论依据。
王晶[9]（2019）在《柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用》文中提出鸡球虫病由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道引起,其所属的顶复门寄生虫可引起许多动物的肠道球虫病,其中7种艾美耳属球虫特异性感染家禽后,定植于肠道特定部位黏膜上皮细胞形成病灶,引起吸收不良或出血性肠炎,对家禽养殖业危害严重。多年来科研人员先后研制出大量抗球虫药物应用于临床治疗,但由于出现耐药虫株及药物残留引发的食品安全问题,免疫预防已成为当前研究热点。本试验将来自不同地域的野毒株柔嫩艾美耳球虫（山东株、吉林株、黑龙江株）用单孢子囊接种技术进行杂交,利用RAPD技术进行多态性分析,筛选出杂交株F2,再对杂交株F2代卵囊进行物理和化学两种方法致弱并进行抗球虫效果检测,具体内容如下:杂交虫株的培育:将山东株（S）与吉林株（J）柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊通过单卵囊技术接种雏鸡,收获卵囊后提取基因组DNA,利用RAPD技术对16个山东株与吉林株杂交后代的单孢子囊扩增产物进行了分析。在分析中发现1株单孢子囊扩增产物的RAPD谱带与其它株和亲本株都不同,此虫株与两亲本株间的相似值为0.83480.8340,远远小于子代株与亲本株平均相似值0.9604,又远远大于株间相似值的平均值0.6627。因此该虫株为山东株与吉林株的杂交虫株（杂交一代,F1）。获得的杂交F1进一步与黑龙江株进行杂交（杂交二代,F2）,并用RAPD方法对14个杂交后代单孢子囊扩增产物进行分析,找到了1株与亲本株相似性为0.83570.8354的虫株,确定其为杂交株F2。杂交株F2致弱及抗球虫效果检测:将柔嫩艾美耳球虫卵囊进行物理和化学两种方法致弱,物理方法采用超声波细胞破碎仪处理孢子化卵囊,超声条件为功率200W致弱10min,化学方法采用含有叠氮钠的化学致弱剂与孢子化卵囊混合,置于4℃冰箱致弱40d。免疫后根据雏鸡存活率、体重变化、粪便计分、粪便中卵囊计数、盲肠病变计分、血液中抗体OD值变化对免疫效果进行评价。试验表明,超声波致弱柔嫩艾美耳球虫杂交株F2卵囊10min可完全破碎球虫卵囊但使其仍保持良好的免疫原性,在7日龄和14日龄时对雏鸡免疫4×103个卵囊,攻虫后7d雏鸡平均增重达89.01g,与对照组每只鸡平均增重21.31g相比差异极显着（p<0.01）,攻虫存活率达100%。在7日龄和14日龄时给雏鸡灌服化学致弱的球虫卵囊8×103个,21日龄攻虫,攻虫后7d雏鸡平均增重达90.61g,与对照组相比差异极显着（p<0.01）,攻虫存活率也达100%。其他指标也说明免疫效果较好,在二次免疫后7d,使用间接ELISA法可以在血清中检测到抗体。因此,在一定功率下超声处理杂交株F2卵囊和使用化学致弱剂致弱F2株卵囊,能使其毒力降低并保持良好的免疫原性,可作为疫苗使用。确定雏鸡最佳免疫时间为7日龄和14日龄,确定最佳免疫剂量为超声波致弱的卵囊每个雏鸡4×103个,化学致弱剂致弱的卵囊每个雏鸡8×103个。将这两种方法致弱的卵囊初步制成弱毒苗,使用饮水投苗和饲料投苗两种方法,投放到长春吉星实业有限公司、吉林德翔牧业有限公司、正大集团德大有限公司的四个养鸡场,共免疫了88万只雏鸡,据合作公司统计,增加了一定经济效益,减少了球虫病造成的损失。
易永萍[10]（2018）在《柔嫩艾美耳球虫临床分离株生物学特性研究》文中研究指明艾美耳球虫引起的鸡球虫病是一种严重危害养禽业的寄生虫病,柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）属于致病力最强的一种,在集约化养鸡场中流行率较高,对鸡的生长发育和饲料转化率有明显的影响。本试验对广东博罗地区鸡柔嫩艾美耳球虫分离株进行了分离鉴定,并对分离株的卵囊大小、形状指数、潜隐期、繁殖力、致病性、耐药性以及免疫原性进行研究,为广东博罗地区柔嫩艾美耳球虫病的有效防控奠定理论基础。本研究第一部分对柔嫩艾美耳球虫临床分离株生物学特性进行研究,结果表明:卵囊平均大小为22.46μm×18.82μm,卵囊形状指数1.19,潜隐期为116 h。按1,000个孢子化卵囊感染7日龄鸡,其排卵高峰期时间为168192 h,经鸡体繁殖产生3.04×108个卵囊,每个卵囊的繁殖指数为3,000。将48只7日龄鸡平均分成6组,分别感染柔嫩艾美耳球广东博罗株孢子化卵囊0、5,000、10,000、30,000、50,000、100,000个/羽。结果表明,感染剂量越高病变越严重,剂量以感染1×105个/羽的组最严重,感染剂量达到5×104个/羽时开始引起雏鸡致死,解剖发现肠腔内无正常内容物,多见盲肠外观肿胀,盲肠肠腔内有大量带血的肠芯,盲肠壁增厚及出血点。应用特异性PCR方法进一步分子鉴定,结果确定分离株球虫卵囊为柔嫩艾美耳球虫纯种,未被其他种球虫感染。第二部分评价柔嫩艾美耳球虫的药物敏感性。将56只14日龄鸡平均分成7组,设立5个用药组、1个感染不用药对照组和1个不感染不用药对照组,以肠病变记分减少率（RLS）、血便记分比、抗球虫指数（ACI）为指标综合评定此株柔嫩艾美耳球虫对托曲珠利、癸氧喹酯、盐霉素、马杜米星铵、磺胺氯吡嗪钠等5种常用抗球虫药的耐药性。结果表明:抗球虫药中癸氧喹酯、磺胺氯吡嗪钠敏感,托曲珠利、盐霉素、马杜米星铵部分耐药。第三部分评价柔嫩艾美耳球虫的免疫原性。将分离株作为免疫虫株,以平均增重、血便记分、存活率及病变记分、粪便OPG、抗球虫指数（ACI）等评价指标对柔嫩艾美耳球虫进行免疫原性分析,结果表明:所有免疫组均产生了一定免疫保护力,其中一次免疫卵囊300个/羽抗球虫指数为192.27,其免疫效果最佳。
二、接种堆型艾美耳球虫早熟株对雏鸡血液理化指标及体重的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、接种堆型艾美耳球虫早熟株对雏鸡血液理化指标及体重的影响（论文提纲范文）
（1）柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 鸡球虫免疫机理 |
| 2 鸡球虫病疫苗类型 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述: 鸡球虫病研究概述与进展 |
| 1 鸡球虫病的病原生物学 |
| 2 鸡球虫病的临床症状与眼观病变 |
| 3 鸡球虫病的防控 |
| 4 鸡球虫种类的鉴定方法 |
| 5 本研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）如东县鸡球虫种类调查及柔嫩艾美耳球虫的耐药性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述:鸡球虫病的病原学及其防治研究进展 |
| 1 鸡球虫病的病原学 |
| 1.1 鸡球虫病的病原种类 |
| 1.2 鸡球虫种类的鉴定方法 |
| 1.3 鸡球虫种类的鉴别特征 |
| 1.4 鸡球虫病的流行特点 |
| 2 鸡球虫病的药物防治 |
| 2.1 抗球虫药种类 |
| 2.2 抗球虫药的合理使用 |
| 2.3 抗球虫药的耐药性检测 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 如东县小型鸡场鸡球虫感染情况与种类的调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 鸡球虫卵囊基因组DNA与实验动物 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 粪样采集 |
| 1.4 粪检卵囊 |
| 1.5 卵囊分离与培养 |
| 1.6 鸡球虫种类鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 球虫感染情况 |
| 2.2 球虫种类鉴别特征 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫田间分离株的耐药性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验虫株 |
| 1.3 试验药物与给药途径 |
| 1.4 试验分组 |
| 1.5 感染剂量 |
| 1.6 临床观察 |
| 1.7 耐药性评价指标 |
| 1.8 耐药性判断标准 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 临床观察及血便情况 |
| 2.2 存活率 |
| 2.3 平均增重与最适抗球虫百分数 |
| 2.4 病变记分与病变记分减少率 |
| 2.5 卵囊产量与相对卵囊产量 |
| 2.6 抗球虫指数 |
| 2.7 耐药性判定结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.1.1 鸡球虫病原 |
| 1.1.2 鸡球虫病的防治 |
| 1.2 鸡球虫疫苗研究进展 |
| 1.2.1 活疫苗 |
| 1.2.2 DNA疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 活载体疫苗 |
| 1.3 禽用免疫增强剂研究进展 |
| 1.3.1 微生态制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.2 生物制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.3 中草药及多糖类免疫增强剂 |
| 1.3.4 化学合成小分子类免疫增强剂 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 实验试剂和仪器 |
| 2.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 2.2.5 免疫增强剂的配制 |
| 2.2.6 实验动物分组 |
| 2.2.7 免疫攻虫程序 |
| 2.2.8 主要观察指标 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 免疫期间动物体重变化 |
| 2.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 2.3.3 血清抗体水平检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验虫株 |
| 3.2.3 实验试剂和仪器 |
| 3.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 3.2.5 免疫增强剂的制备 |
| 3.2.6 实验动物分组 |
| 3.2.7 免疫攻虫程序 |
| 3.2.8 主要观测指标 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫增强剂对免疫期间动物体重变化 |
| 3.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 3.3.3 免疫增强剂对鸡群抗体和细胞因子水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂和仪器 |
| 4.2.4 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育 |
| 4.2.5 柔嫩艾美耳球虫母株卵囊的收集和纯化 |
| 4.2.6 柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的繁殖和纯化 |
| 4.2.7 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组测序 |
| 4.2.8 荧光定量PCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株的早熟选育结果 |
| 4.3.2 早熟株与母株转录组测序结果 |
| 4.3.3 差异基因的筛选 |
| 4.3.4 差异基因功能分类 |
| 4.3.5 转录组差异表达基因的荧光定量验证结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验虫株和细胞 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 柔嫩艾美耳球虫四个阶段虫体的纯化以及cDNA制备 |
| 5.2.4 EtRON2和EtRON3 转录水平分析 |
| 5.2.5 DF-1细胞的传代培养 |
| 5.2.6 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段虫体中的分布 |
| 5.2.7 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 EtRON2和EtRON3 在早熟株和母株孢子化卵囊的转录水平差异 |
| 5.3.2 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段中转录水平的差异 |
| 5.3.3 EtRON2和EtRON3 在虫体不同发育阶段的分布情况 |
| 5.3.4 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 鸡球虫病防治研究进展 |
| 1 鸡球虫的生物学特征 |
| 2 鸡球虫病的诊断与防治 |
| 3 鸡球虫病的免疫预防 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第一章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam56基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam82基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）鸡球虫卵黄抗体的制备及其应用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写与符号清单 |
| 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 虫株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 球虫卵囊的增殖与纯化 |
| 2.2.2 球虫抗原的制备和蛋鸡免疫 |
| 2.2.3 采用水稀释法对卵黄抗体初步分离 |
| 2.2.4 饱和硫酸胺方法纯化 |
| 2.2.5 IgY浓度测定 |
| 2.2.6 SDS-PAGE电泳法测定IgY纯度 |
| 2.2.7 间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.7.1 包被抗原的制备 |
| 2.2.7.2 最佳抗原包被浓度的确定 |
| 2.2.7.3 抗原包被时间和温度的确定 |
| 2.2.7.4 最佳封闭液的筛选及作用时间的确定 |
| 2.2.7.5 一抗最佳作用时间的确定 |
| 2.2.7.6 酶标二抗最佳作用时间和稀释度的确定 |
| 2.2.7.7 TMB最佳作用时间和温度的确定 |
| 2.2.7.8 临界值的确定 |
| 2.2.8 间接ELISA方法的评估 |
| 2.2.8.1 敏感性试验 |
| 2.2.8.2 特异性试验 |
| 2.2.8.3 重复性试验 |
| 2.2.9 对3免后的卵黄抗体水平进行检测 |
| 2.2.10 抗鸡球虫四价卵黄抗体的效果评价 |
| 2.2.10.1 抗鸡球虫四价卵黄抗体冻干粉的制备 |
| 2.2.10.2 试验分组 |
| 2.2.10.3 抗球虫病评价指标 |
| 3 结果 |
| 3.1 纯化卵黄抗体的鉴定 |
| 3.2 卵黄抗体间接ELISA优化结果 |
| 3.2.1 最适抗原稀释度的确定 |
| 3.2.2 抗原包被时间和温度的确定 |
| 3.2.3 最佳封闭液及时间的确定 |
| 3.2.4 一抗最佳反应时间的确定 |
| 3.2.5 酶标二抗最佳作用时间和稀释度的确定 |
| 3.2.6 TMB最佳作用时间和温度的确定 |
| 3.2.7 临界值的确定 |
| 3.3 敏感性试验结果 |
| 3.4 特异性试验结果 |
| 3.5 重复性试验结果 |
| 3.6 卵黄抗体消长规律检测结果 |
| 3.7 IgY抗球虫感染效果评估 |
| 3.7.1 卵黄粉的制备和鉴定 |
| 3.7.2 卵黄抗体抗鸡球虫效果评估 |
| 3.7.2.1 对增重的影响 |
| 3.7.2.2 对卵囊产出影响 |
| 3.7.2.3 对病变减少率的影响 |
| 3.7.2.4 抗球虫指数 |
| 4 讨论 |
| 4.1 卵黄抗体(IgY)的制备 |
| 4.2 卵黄抗体ELISA方法的建立及抗体水平检测 |
| 4.3 卵黄抗体抗球虫效果研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）不同球虫疫苗商品肉鸡免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.鸡球虫病国内外研究现状 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.2 鸡球虫病原的形态及分类 |
| 1.3 鸡球虫病原生物学特性 |
| 1.4 鸡球虫生活史 |
| 1.5 流行病学 |
| 1.6 发病机理 |
| 1.7 症状和病变 |
| 1.8 诊断 |
| 1.9 防治 |
| 2 试验研究的目的和意义 |
| 第二章 不同球虫疫苗商品肉鸡免疫效果研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 疫苗、药物、仪器、试剂 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 试验分组 |
| 1.2.2 喷雾免疫方法 |
| 1.2.3 拌料免疫方法 |
| 1.2.4 用药组药物添加方法 |
| 1.3 球虫免疫效果评价 |
| 1.3.1 舌尖红染率、嗉囊饱食率 |
| 1.3.2 卵囊计数(OPG) |
| 1.3.3 球虫肉眼病变评分方法: |
| 1.3.4 肠道病变评分方法: |
| 1.3.5 生产成绩指标: |
| 2.结果 |
| 2.1 舌尖红染率和嗉囊饱食率结果 |
| 2.2 OPG检测结果 |
| 2.2.1 不同剂量的Y疫苗免疫后OPG值 |
| 2.2.2 Z疫苗1 倍量拌料与Y疫苗1 倍量喷雾、Y疫苗0.6 倍喷雾OPG平均值对比 |
| 2.2.3 用药组OPG趋势 |
| 2.3 球虫肉眼病变评分结果比较 |
| 2.4 肠道损伤肉眼病变评分结果比较 |
| 2.5 生产成绩比较 |
| 2.5.1 成活率对比结果 |
| 2.5.2 单只均重对比结果 |
| 2.5.3 出栏料肉比(FCR)结果对比 |
| 2.5.4 出栏欧洲指数(EPI)对比结果 |
| 2.5.5 出栏前ND抗体均值比较 |
| 2.5.6 出栏前H9 抗体比较 |
| 3.讨论 |
| 3.1 OPG监控、肉眼病变评分的目的和意义 |
| 3.2 拌料法与喷雾法影响 |
| 3.3 生产成绩影响 |
| 3.4 对抗体的影响 |
| 3.5 免疫鸡群早期垫料管理 |
| 3.6 应用前景与建议 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师组意见 |
| 致谢 |
（8）抗柔嫩艾美耳球虫天然化合物及中药复方制剂的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫 |
| 1.1.1 鸡球虫分类 |
| 1.1.2 鸡球虫的生活史 |
| 1.2 鸡球虫病流行概况 |
| 1.3 鸡球虫病的控制策略及其局限性 |
| 1.4 抗球虫药物使用现状 |
| 1.5 中药提取物对鸡球虫抗药性的研究现状 |
| 1.6 中药提取物复合使用抗球虫研究进展 |
| 1.7 中药提取物作为抗球虫药的限制和问题 |
| 1.8 研究思路 |
| 1.9 技术方法 |
| 1.10 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物与日粮 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.1.5 虫株与细胞 |
| 2.1.6 化合物单体 |
| 2.1.7 药物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 鸡球虫病流行情况与耐药性调查 |
| 2.2.2 柔嫩艾美耳球虫MDBK细胞培养体系筛选单体化合物 |
| 2.2.3 中药复方抗球虫效果试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸡球虫病流行情况与耐药性调查 |
| 3.1.1 华南部分地区鸡球虫流行情况 |
| 3.1.2 华南部分地区鸡球虫耐药性情况 |
| 3.2 柔嫩艾美耳球虫MDBK细胞培养模型筛选单体化合物 |
| 3.2.1 卵囊的纯化和子孢子制备 |
| 3.2.2 荧光定量测定化合物对子孢子入侵的抑制率 |
| 3.3 中药复方抗球虫效果试验 |
| 3.3.1 方剂的初筛 |
| 3.3.2 方剂有效剂量的筛选 |
| 3.3.3 方剂作用峰期的研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸡球虫病流行情况与耐药性调查 |
| 4.1.1 感染情况 |
| 4.1.2 优势虫种 |
| 4.1.3 耐药情况 |
| 4.1.4 耐药分析 |
| 4.1.5 耐药性的延缓或解决措施 |
| 4.2 柔嫩艾美耳球虫MDBK细胞培养模型筛选单体化合物 |
| 4.2.1 技术优势 |
| 4.2.2 筛选结果 |
| 4.3 中药复方抗球虫效果试验 |
| 4.3.1 筛选结果 |
| 4.3.2 实验方剂优势 |
| 5 全文讨论与总结 |
| 5.1 全文讨论 |
| 5.2 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（9）柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫病概述 |
| 1.1 鸡球虫分类 |
| 1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.3 柔嫩艾美耳球虫发育过程 |
| 1.4 鸡感染球虫后的发病机制 |
| 1.5 柔嫩艾美耳球虫病变特点 |
| 1.6 展望 |
| 第二章 鸡球虫病活疫苗的研究进展 |
| 2.1 强毒苗的研制 |
| 2.2 弱毒苗的研制 |
| 2.3 鸡对球虫的免疫应答 |
| 2.4 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫不同地理株杂交株制备 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 实验动物及饲养 |
| 1.2.2 虫株复壮 |
| 1.2.3 卵囊分离 |
| 1.2.4 卵囊孢子化 |
| 1.2.5 孢子化卵囊的灭菌和纯化 |
| 1.2.6 孢子囊的制备 |
| 1.2.7 单孢子囊胶囊制备及扩增 |
| 1.2.8 柔嫩艾美耳球虫DNA的提取 |
| 1.2.9 选择引物 |
| 1.2.10 PCR反应条件 |
| 1.2.11 数据分析 |
| 1.2.12 虫株的培育及鉴定 |
| 1.2.12.1 杂交F1 虫株的培育 |
| 1.2.12.2 杂交F1 虫株的鉴定 |
| 1.2.12.3 杂交F2 虫株的培育 |
| 1.2.12.4 杂交F2 虫株的鉴定 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 杂交虫株F1 的培育结果 |
| 1.3.2 杂交虫株F2 的培育 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫杂交株F2致弱方法及抗球虫效果检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 免疫保护效果评价指标 |
| 2.2.1.1 测量体重 |
| 2.2.1.2 存活率 |
| 2.2.1.3 血便计分 |
| 2.2.1.4 麦克马斯特法检测粪便中卵囊数(OPG) |
| 2.2.1.5 盲肠病变计分 |
| 2.2.2 超声波致弱卵囊方法 |
| 2.2.3 化学致弱剂的配制及致弱方法 |
| 2.2.4 动物试验免疫程序设计 |
| 2.2.5 ELISA检测雏鸡抗体水平 |
| 2.2.6 卵囊抗原制备 |
| 2.2.7 间接ELISA最佳反应条件的选择 |
| 2.2.8 间接ELISA实验步骤 |
| 2.2.9 数据处理 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 体重变化 |
| 2.3.2 攻虫7d存活率 |
| 2.3.3 血便计分 |
| 2.3.4 攻虫后第7d卵囊数OPG |
| 2.3.5 盲肠病变计分 |
| 2.3.6 血清抗体OD值 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 弱毒苗试验推广 |
| 3.1 试验方法 |
| 3.1.1 计算雏鸡每日饮水和饲料量 |
| 3.1.2 计算免疫剂量 |
| 3.1.3 弱毒苗的使用方法 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 疫苗特性 |
| 3.3.2 投苗方法比较 |
| 3.3.3 弱毒苗免疫效果比较 |
| 3.3.4 经济效益分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）柔嫩艾美耳球虫临床分离株生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫卵囊生物学特性 |
| 1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.3 鸡球虫病的流行病学 |
| 1.4 鸡球虫病的药物防治状况 |
| 1.5 鸡球虫疫苗 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试虫株 |
| 2.2 供试动物 |
| 2.3 饲料 |
| 2.4 主要实验试剂 |
| 2.5 供试药物 |
| 2.6 主要实验仪器 |
| 2.7 试验方法 |
| 2.7.1 鸡球虫卵囊的分离与收集 |
| 2.7.2 鸡球虫卵囊的繁殖和复壮 |
| 2.7.3 潜隐期测定 |
| 2.7.4 卵囊大小测定 |
| 2.7.5 卵囊繁殖力测定 |
| 2.7.6 卵囊致病性测定 |
| 2.7.7 柔嫩艾美耳球虫分子鉴定 |
| 2.7.8 耐药性试验分组与处理 |
| 2.7.9 免疫原性试验分组与处理 |
| 2.7.10 评价指标及标准 |
| 2.7.11 统计项目 |
| 2.8 实验数据处理与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 柔嫩艾美耳球虫分离、繁殖及复壮结果 |
| 3.2 潜隐期测定结果 |
| 3.3 卵囊大小及形状指数 |
| 3.4 柔嫩艾美耳球虫虫株的繁殖能力结果 |
| 3.5 柔嫩艾美耳球虫致病力 |
| 3.5.1 临床症状、致病力 |
| 3.5.2 增重、盲肠病变及血便记分 |
| 3.6 柔嫩艾美耳球虫分子鉴定 |
| 3.6.1 特异性PCR鉴定结果 |
| 3.6.2 外源虫株鉴定结果 |
| 3.7 柔嫩艾美耳球虫虫株耐药性试验 |
| 3.7.1 病变记分减少率 |
| 3.7.2 血便记分比 |
| 3.7.3 抗球虫指数 |
| 3.7.4 药物耐药性试验综合评价 |
| 3.8 柔嫩艾美耳球虫免疫原性试验 |
| 3.8.1 增重情况 |
| 3.8.2 血便记分 |
| 3.8.3 存活率及病变记分 |
| 3.8.4 OPG变化 |
| 3.8.5 血清中IgG、IgA浓度变化 |
| 3.8.6 抗球虫指数 |
| 4 讨论 |
| 4.1 柔嫩艾美耳球虫生物学特性 |
| 4.2 鸡球虫卵囊特异性PCR鉴定 |
| 4.3 药物耐药性 |
| 4.4 临床分离株免疫原性 |
| 5 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
四、接种堆型艾美耳球虫早熟株对雏鸡血液理化指标及体重的影响（论文参考文献）
- [1]柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价[D]. 程振扬. 扬州大学, 2021
- [2]鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用[D]. 徐向东. 扬州大学, 2021
- [3]如东县鸡球虫种类调查及柔嫩艾美耳球虫的耐药性检测[D]. 吴文君. 扬州大学, 2020(04)
- [4]柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究[D]. 余水兰. 中国农业科学院, 2020
- [5]堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究[D]. 华恩玉. 扬州大学, 2020
- [6]鸡球虫卵黄抗体的制备及其应用研究[D]. 赵玉洁. 安徽农业大学, 2020(04)
- [7]不同球虫疫苗商品肉鸡免疫效果研究[D]. 刘国辉. 青岛农业大学, 2019(03)
- [8]抗柔嫩艾美耳球虫天然化合物及中药复方制剂的筛选[D]. 于林增. 华南农业大学, 2019
- [9]柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用[D]. 王晶. 吉林农业大学, 2019(03)
- [10]柔嫩艾美耳球虫临床分离株生物学特性研究[D]. 易永萍. 华南农业大学, 2018(08)