一、IGF-1 mRNA expression of adult rat thyroid cell cultured in vitro（论文文献综述）
吕艳敏[1]（2020）在《海藻玉壶汤特定剂量条件下的反药组合加减抗甲状腺肿的作用及机制》文中进行了进一步梳理研究背景:海藻与甘草属于十八反反药组合之一,明代陈实功所着《外科正宗》中的海藻玉壶汤中就含有海藻与甘草这对反药,却是临床常用的经典名方,常用于治疗甲状腺肿大、胆囊息肉等。然而反药组合配伍使用涉及到临床用药的安全性以及合理性问题,是关系到国计民生的社会问题。到目前为止,关于反药组合能否配伍使用,虽然有着越来越多的科研人员的重视和参与,并且取得了一定成果,但依然颇具争议。课题组前期开展的国家973计划课题从方药结合的角度对含海藻甘草反药组合的海藻玉壶汤进行研究,分别从海藻甘草反药组合在复方中的不同配伍比例、甘草的不同炮制品种、海藻甘草同一配伍比例下的不同给药剂量等方面展开实验来研究反药组合在复方中应用的特点及规律。后续开展的国家自然科学基金资助项目研究者依据2015版《中华人民共和国药典·一部》（以下简称《中国药典》）中规定的甘草、海藻的使用剂量,分为《中国药典》底限、高限、高限的两倍三个剂量组,从量-毒-效的角度研究海藻不同品种以及海藻甘草不同配伍剂量是否是影响海藻与甘草配伍反与不反的因素,结果显示各配伍剂量组对纠正甲状腺肿大大鼠甲状腺功能各项指标及甲状腺组织形态的效果有差异,筛选出了“效”相对明显的条件:即海藻品种选用海蒿子,甘草使用生甘草,海藻、甘草的剂量选用《中国药典》高限剂量的两倍;在此条件下模型大鼠的心肝肾各项指标与空白组比较没有明显差异,未发现明显毒性。但关于其起效的物质基础以及起效的作用机制方面,仍需进一步探讨。研究目的:本实验基于课题组前期研究成果,进一步探讨在海藻、甘草剂量为《中国药典》高限剂量的两倍（即海藻24g、甘草20g）条件下,海藻与甘草在海藻玉壶汤中的加减应用,从物质基础,下丘脑-垂体-甲状腺轴的调节作用,甲状腺细胞凋亡等方面进行研究,试图揭示其抗甲状腺肿大的机制,以期为完善海藻与甘草反药组合的配伍实质及指导临床应用提供实验依据。研究方法:1物质基础:选择海藻玉壶汤所含中药材的共有成分以及结合文献报道中提到的反药组合对其溶出含量影响较大的成分:橙皮苷（醋青皮、陈皮共有成分）;阿魏酸（川芎、当归、独活共有成分）;连翘苷;甘草苷、甘草酸（文献报道中提到的反药组合对其溶出含量影响较大的成分）。使用高效液相色谱法作为检测方法,对海藻玉壶汤全方组（以下简称HYD）、海藻玉壶汤减甘草组（以下简称HYD-G）、海藻玉壶汤减海藻组（以下简称HYD-H）、海藻玉壶汤减海藻甘草组（以下简称HYD-GH）、海藻甘草组（以下简称GH）、甘草组（以下简称GC）间相同活性成分溶出含量进行比较。2机制探究:选用健康成年Wistar大鼠,雌雄各半,体重200±20g,分为空白组、模型组、阳性药组（优甲乐）、HYD组、HYD-H组、HYD-G组、HYD-GH组。通过甲状腺病理组织形态方面的变化及检测血液生化指标重点检测甲状腺功能、初步分析成模及药物的起效情况,再通过电镜下观察其微观结构的形态变化以及TUNEL检测凋亡指数后进一步通过蛋白、基因的检测来探究海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减应用抗甲状腺肿大的作用机制。研究结果:1海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减对方中主要活性成分溶出含量的影响比较各组中活性成分溶出含量得出:甘草苷、甘草酸在各组中的溶出含量由高到低为HYD-H>HYD>GC>GH;连翘苷、橙皮苷、阿魏酸在各组中溶出含量由高到低为:HYD-H>HYD-GH>HYD-G>HYD。2海藻玉壶汤中反药组合加减对甲状腺肿大模型大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴的影响比较各组大鼠甲状腺系数,光镜下观察大鼠甲状腺组织形态改变,并统计甲状腺组织切片的细胞核数、滤泡面积发现各拆方组间甲状腺组织病理形态改善情况:HYD>HYD-GH>HYD-H>HYD-G。检测甲状腺激素水平三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）发现海藻玉壶汤及其拆方组均表现出对甲状腺肿大模型大鼠甲状腺激素水平的回调作用,其回调情况从高到低分别为:HYD、HYD-G、HYD-H、HYD-GH;检测甲状腺激素的合成指标并与模型组比较发现HYD组、HYD-G组甲状腺球蛋白（Tg）含量升高,HYD及其各拆方组甲状腺过氧化物酶（TPO）、促甲状腺激素受体（TSHR）水平均降低;检测甲状腺激素的转运指标并与模型组比较发现HYD及其各拆方组甲状腺素结合球蛋白（TBG）、白蛋白（ALB）水平均升高;检测甲状腺激素的调控指标并与模型组比较发现HYD组及其各拆方组促甲状腺激素释放激素（TRH）、促甲状腺激素（TSH）水平均降低,有统计学差异。3海藻玉壶汤中反药组合加减对甲状腺肿大大鼠细胞凋亡及其凋亡通路的影响电镜观察各组细胞微观结构发现,与模型组相比HYD组表现出细胞全面皱缩,细胞核固缩或崩解而弥散在胞浆内,染色质浓缩并边缘化;胞质内粗面内质网减少,线粒体数量减少体积减小,溶酶体数量增多,可见典型的自噬囊泡等凋亡特征,拆方组虽有典型的凋亡特征性变化但凋亡程度不及HYD组。通过TUNEL法检测甲状腺细胞凋亡情况计算凋亡指数发现,与模型组相比,HYD组甲状腺组织凋亡细胞数明显增加,HYD-G组、HYD-GH组未见明显变化,HYD-H组凋亡细胞数明显减少。检测甲状腺组织中Caspase-8、Caspase-9蛋白发现,与空白组相比模型组Caspase-8、Caspase-9水平无明显变化;与模型组比较,给药各组Caspase-8、Caspase-9水平无明显差异。检测Fas、Bcl-2 mRNA发现,与空白组比较模型组Fas、Bcl-2 mRNA表达水平无明显变化;经HYD组及其拆方各组给药治疗后,与模型组比较Fas、Bcl-2 mRNA含量无明显变化。研究结论:1海藻与甘草这对反药组合单独配伍时,表现出引起甘草中甘草苷、甘草酸的溶出含量降低的结果。二者在复方中配伍应用时,甘草苷、甘草酸的溶出含量与甘草组基本持平。而与复方全方组相比,去掉海藻甘草反药组合的拆方组表现出引起甘草苷、甘草酸、连翘苷、橙皮苷、阿魏酸溶出含量升高的结果,可为海藻玉壶汤临床应用及反药组合能否配伍应用研究提供参考。2海藻玉壶汤对甲状腺肿大模型大鼠甲状腺激素水平和组织形态均有改善作用。复方各组比较甲状腺组织病理形态,其改善情况为HYD>HYD-GH>HYD-H>HYD-G;复方各组比较甲状腺激素相关指标水平,其恢复情况为HYD>HYD-G>HYD-H>HYD-GH。在改善甲状腺肿大方面,海藻玉壶汤中反药组合同用的效果优于去反药组合的效果。改善甲状腺肿大的机制与调节甲状腺激素的合成、转运,调控下丘脑-垂体-甲状腺轴有关。3通过电镜微观观察甲状腺细胞及TUNEL法检测甲状腺凋亡指数发现海藻玉壶汤能够促进甲状腺肿大模型大鼠甲状腺细胞的凋亡,全方组促进凋亡的水平强于拆方组。通过分子生物学实验研究发现,本实验中海藻玉壶汤及其拆方促进甲状腺肿大细胞凋亡与Caspase-8、Caspase-9蛋白以及Fas、Bcl-2基因表达无显着相关性,没有统计学差异。
汪宇涵[2]（2020）在《甲状腺相关眼病视网膜血管密度观察及眼眶成纤维细胞中NF-κB抑制剂的治疗作用研究》文中研究表明第一部分:不同病程甲状腺相关眼病的视盘及黄斑区血管密度研究目的:采用相干光层析血管成像术（OCTA）分析不同病程甲状腺相关眼病（TAO）患者的视盘及黄斑区血管密度特征,及其与视功能的相关性。方法:病例对照研究。纳入2019年6月至2019年9月就诊于北京协和医院眼科的TAO患者及同期的健康志愿者。TAO临床活动性评分（CAS）评分≥3分的患者为活动期组,患有甲状腺相关眼病视神经病变（DON）且病程≤6个月的患者为DON急性期组,患有DON且病程>6个月的患者为DON慢性期组,健康志愿者为对照组。每组纳入受检者12例,研究均取右眼进行分析。所有受试者行最佳矫正视力（BCVA）、非接触性眼压（NCT）、裂隙灯联合前置镜检查、眼轴长度测量及视野检查并分析平均缺损（MD）,采用相干光层析成像术测量视网膜神经纤维层（RNFL）及视网膜神经节细胞复合体（GCC）厚度,采用相干光层析血管成像术（OCTA）测量视盘结构参数、视盘及黄斑区血管密度。BCVA随后转换为最小分辨角对数视力（LogMAR）。分析各组间视盘及黄斑区血管密度的差异及其与不同因素的相关性。采用方差分析（ANOVA）、非参数Mann-Whitney U检验及Spearman相关性分析进行统计学分析。结果:共纳入受检者48人,受检者总体年龄（45±11）岁,4组间年龄差异无统计学意义（均P>0.05）;各组性别匹配,男性、女性均为6人。DON急性期组LogMAR为0.1（0,0.2）,较对照组0（0,0）差,差异有统计学意义（U=114.000,P<0.05）。DON急性期组及DON慢性期组视盘全层整体血管密度（54.70%±2.31%、54.31%±3.65%）均低于对照组（62.54%±3.91%）,差异有统计学意义（t=3.104,2.636;均P<0.05）。TAO活动期组、DON急性期组和DON慢性期组黄斑区浅层整体血管密度（46.07%±3.06%、42.26%±5.05%、45.63%±3.87%）均低于对照组（49.34%±3.08%）,差异有统计学意义（t=2.614,4.147,2.603;均P<0.05）。4组间黄斑中心凹无血管区面积及黄斑区深层血管密度的差异均无统计学意义（均P>0.05）。TAO活动期组视盘及黄斑区血管密度与视野平均缺损值、RNFL及GCC厚度均无相关性（均P>0.05）。DON急性期组视盘全层整体血管密度与视野平均缺损值呈负相关（r=-0.591,P=0.043）,与RNFL、GCC 厚度呈正相关（r=0.595,0.693;P=0.041,0.013）;DON 慢性期组视盘整体毛细血管密度与视野平均缺损值呈负相关（r=-0.673,P=0.017）,黄斑区浅层整体血管密度与RNFL、GCC厚度呈正相关（r=0.732,0.712;P=0.007,0.009）。结论:DON急性期患者BCVA受疾病影响较大。TAO活动期仅黄斑区浅层血液供应减少。DON急、慢性期黄斑区浅层和视盘的血液供应均减少,且血管密度越小,视野缺损越严重,RNFL及GCC厚度越薄。第二部分:眼眶成纤维细胞中NF-κB抑制剂对甲状腺相关眼病的治疗作用目的:检测地塞米松、IMD-0354、吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）对NF-κB通路相关转录因子和炎性因子的调节,探索NF-κB抑制剂是否可与糖皮质激素联合抗炎。方法:获取TAO限制性斜视及其他斜视患者的眼眶结缔组织,培养并分离原代眼眶成纤维细胞（OFs）,传代3-5代后用脂多糖（LPS）诱导炎症,加入不同浓度梯度的地塞米松（DEX）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分别检测两组OF中白细胞介素-6（IL-6）、透明质酸合酶1、2、3（HAS1、HAS2、HAS3）mRNA的表达水平。电泳迁移率变动分析（EMSA）检测两组OFs细胞核内NF-κB结合力,筛选出最佳DEX浓度。分别加入NF-κB抑制剂IMD-0354、PDTC进行药物干预。RT-qPCR法分别检测两组OFs中IL-6、HAS1、HAS2、HAS3 mRNA的表达水平;Western Blot法检测P65、磷酸化的P65（p-P65）、IκBα、磷酸化的IκBα（p-IκBα）的表达水平。结果:纳入实验组、对照组OFs各9例。RT-qPCR结果显示,在加用不同浓度的DEX后作用2小时,实验组IL-6相对表达量达到最低点;10-6M DEX作用2小时的IL-6相对表达量均显着小于10-7M、10-8M（均P<0.05）。实验组用不同浓度DEX作用2小时,HAS1、HAS2、HAS3相对表达量减少（均P<0.05）。EMSA实验示DEX作用0.5小时后,两组OFs的NF-κB与靶基因结合力最强。选取10-6M为DEX最适浓度,2H为最适时间。在加入两种NF-κB抑制剂后,RT-qPCR结果显示,与LPS+DEX组相比,实验组5μM IMD-0354、5μM IMD-0354+DEX 和 100μM PDTC+DEX 可有效抑制 IL-6 生成（均 P<0.01）,5μM IMD-0354可有效抑制HAS2和HAS3生成,差异均有统计学意义（均P<0.05）;对照组 5μM IMD-0354、1μM IMD-0354+DEX、5μM IMD-0354+DEX 和 100μM PDTC可有效抑制HAS2和HAS3生成,差异均有统计学意义（均P<0.05）。Western blot结果显示,实验组OFs应用5μM IMD-0354与DEX联合联合用药、50μM PDTC、100μM PDTC单独用药或与DEX联合联合用药,可有效降低NF-κB P65、p-P65、IκBα、p-IκBα 的产生（P<0.001）。结论:OFs在LPS刺激后HAS1、HAS2、HAS3及IL-6表达水平显着增高,其水平受地塞米松抑制。IMD-0354、PDTC可联合DEX有效降低TAO患者OFs的NF-κB通路上炎性因子和转录因子的表达水平。IMD-0354、PDTC可作为DEX治疗TAO的联合用药,增加抗炎效果。
房君[3]（2019）在《转录组学揭示德保矮马体尺矮小的分子遗传机制》文中进行了进一步梳理体尺性状是动物间表型差异最直观的表现,也是鉴定家畜品种的关键特征之一。家畜的体尺直接反映了其体格大小和躯体的结构、发育等情况,与家畜的生理机能、生产性能、抗病力以及对外界环境条件的适应能力等密切相关。体尺性状是决定品种优劣和生产性能高低的重要指标,已成为家畜育种中优先考虑的因素。马的体尺性状同样极其重要,是决定马匹性能和经济价值的一个关键因素。中国德保矮马是世界上稀有珍贵、自然形成的最矮马种之一,深入了解控制矮马体尺性状的关键基因及其调控机理对揭示矮马矮小特性的遗传机制具有重要意义。本研究以体格矮小的德保矮马和体格较为高大的蒙古马为研究对象,选取与其体格发育密切相关的幼年期与成体期脑垂体和长骨组织,经转录组测序与数据分析,系统地筛选了马体格性状形成的关键候选基因,一定程度上揭示了候选基因的表达模式与体尺性状之间的关联性,为进·步阐明德保矮马体格矮小特性的分子遗传机制奠定了重要的基础。全文研究结果如下:（1）转录组测序结果显示幼年和成年期德保矮马与蒙古马垂体及长骨骨骺组织差异表达mRNA共有29243个,其中上调基因13946个,下调基因15297个。成年期两种马无论是垂体还是长骨组织,差异基因均表现为蒙古马呈高表达趋势;幼年期,垂体组织在蒙古马中节高表达趋势,而长骨组织则是在矮马中呈高表达趋势。（2）分析发现幼年期德保矮马垂体中GH、TSHB和CGA基因的表达远远高于蒙古马,而成年期两种马上述基因的表达没有显着差异。德保矮马无论成年还是幼年期,IGF-1和GHR基因表达都显着低于蒙古马;Western Blot检测显示,无论幼年期还是成年期,垂体GH激素的表达德保矮马均高于蒙古马。q-PCR检测结果与测序所得数据相符。（3）深入分析德保矮马和蒙古马长骨组织的差异表达基因,发现德保矮马长骨生长发育中起重要作用的GHR信号通路mRAS、MAPK103基因表达显着下调,WNT/Ca2+信号通路PLCβ2基因表达显着上调,同时TLR基因及其信号通路基因TGFβ3、TNFSF14表达显着上调（p≤0.05）。这些通路可导致骨细胞增殖减慢、细胞胞外基质提前矿化使骨生长停止。推测上述3条信号通路相互协作导致德保矮马体格矮小性状形成。（4）在马骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞和ATDC5细胞培养过程中,添加WNT信号通路抑制剂后检测发现,通路中WNT2、WNT5A和PLCg2基因标达下降,经GHR-RNAi慢病毒转染ATDC5细胞后检测显示,GHR及其信号通路中m-RAS和ATF3基因表达均呈下降趋势,这与测序数据结果相一致。（5）血浆检测发现,德保矮马幼年期比成年期血浆IGF-1浓度高,而血浆GH浓度则相反。蒙古马幼年期比成年期血浆GH含量高,而血浆IGF-1浓度则相反,显示不同发育时期两种马GH和IGF-1的分泌有很大不同。这些激素分泌量的变化与转录测序分析显示的基因表达趋势相一致。德保矮马尽管高表达GH,因GHR分泌量少,GH依然不能充分发挥其促生长作用,从而导致德保矮马体高明显低于蒙古马。综上所述,对德保矮马与蒙古马决定其体高关键组织垂体和长骨骨骺组织转录组mRNA水平分析发现,两类体格差异显着的马匹,调控体格发育关键候选基因GHR、IGF-1、TSHB和CGA的表达规律有明显不同;调节体高生长发育主要激素蛋白的血浆含量的变化,与其基因表达趋势相一致;在细胞水平对这些关键激素基因进行敲减,检测其信号通路相关基因的表达变化,得出了与预期一致的结果。以上在基因、蛋白质、细胞水平的综合研究结果,对揭示德保矮马矮小体尺性状形成的分子遗传机制积累了重要的数据,奠定了扎实的基础,对培育特殊用途马的分子育种提供了关键的基因资源,同时为揭示人类体高相关疾病的遗传机制提供了新的研究思路。
张晨[4]（2019）在《海藻玉壶汤中加减高剂量甘草及不同品种海藻的药效及机制探讨》文中研究说明研究背景:“十八反”属于中药配伍禁忌,其中包括海藻、甘草这一对反药组合,与其他反药组合不同的是,海藻、甘草两味中药本身均无毒,配伍使用是否会“相反”值得探究。2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）中记载海藻为马尾藻科植物海蒿子Sargassum pallidum（Turn.）C.Ag.或羊栖菜Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.的干燥藻体。现代研究表明海蒿子与羊栖菜的化学成分及药理作用均存在差异。历代关于海藻、甘草同用的文献记载有很多,现代临床应用含这对反药组合的复方治疗相关疾病的报道也并不少见。海藻甘草这一反药组合应用于临床多为在复方中使用,且针对病理条件,此时是否会“相反”值得探究,其中海藻玉壶汤为含海藻甘草反药组合的经典名方,主要用于治疗甲状腺肿大等疾病。课题组前期研究发现针对丙硫氧嘧啶（PTU）导致的甲状腺肿大模型大鼠使用含反药组合的海藻玉壶汤治疗对于大鼠的甲状腺肿大均有一定的纠正作用,西医对于甲状腺肿大除手术外无有效治疗方法,含反药组合的海藻玉壶汤是通过何种机制对甲状腺肿大进行纠正值得探究;并且前期研究发现海藻（海蒿子、羊栖菜）、甘草在《中国药典》规定高限5倍的给药剂量下,海蒿子与生甘草、羊栖菜与生甘草配伍应用对甲状腺肿大模型大鼠的治疗效果产生了差异。中药配伍禁忌中“相反”可体现为配伍应用产生毒性,如对于心肝肾功能的损害等方面,但对药物的治疗作用是否有影响值得探究。因此在该剂量下海藻玉壶汤对甲状腺肿大大鼠治疗效果的差异是否与不同海藻品种及反药组合相关及其作用机制需要进一步探讨。研究目的:本实验探讨含《中国药典》规定高限5倍剂量反药组合的海藻玉壶汤中海藻不同品种与甘草加减应用对甲状腺肿大大鼠的药效作用及相关的机制,探究海藻甘草反药组合、海藻品种不同是否对甲状腺肿大大鼠治疗效果产生影响,期望对“十八反”配伍禁忌的本质进行探究,为指导临床使用中药提供参考。研究方法:1药效作用:大鼠称重后,依据体重把大鼠随机分为9组:空白组、模型组、阳性药组、含羊栖菜的海藻玉壶汤全方组（以下简称羊栖菜全方组）、含羊栖菜的海藻玉壶汤不含甘草组（以下简称羊栖菜去甘草组）、含海蒿子的海藻玉壶汤全方组（以下简称海蒿子全方组）、含海蒿子的海藻玉壶汤不含甘草组（以下简称海蒿子去甘草组）、海藻玉壶汤不含海藻组（以下简称去海藻组）、海藻玉壶汤不含海藻甘草组（以下简称去海藻甘草组）,每组16只。造模期间,除空白组大鼠,其余各组大鼠灌服PTU 10 mg/kg,每日1次,共灌服造模药14d。造模后给大鼠灌胃服用治疗药物,周期为28 d,其中,空白组与模型组给予等量生理盐水灌胃,阳性药组大鼠使用优甲乐灌胃,给药剂量为20μg/kg,每日1次,其余各给药组给予相应的海藻玉壶汤加减应用的中药液灌胃,大鼠每日给药1次,给药剂量各组不同:海蒿子/羊栖菜去甘草组给药剂量13.5 g/kg,去海藻组剂量12.6g/kg,海蒿子/羊栖菜全方组剂量18.0g/kg,去海藻甘草组剂量8.1g/kg。给药期间,为了稳定大鼠甲状腺肿大模型,除空白组外,每隔1天,其余各组灌服PTU,给药剂量不变。给药结束后计算各组大鼠甲状腺系数,观察大鼠甲状腺的组织病理形态,检测大鼠甲状腺功能。观察海藻不同品种与生甘草在《中国药典》规定剂量高限5倍剂量下加减应用对甲状腺肿大大鼠药效作用的影响。2机制探讨:检测甲状腺组织TPO、Tg的基因表达,探究含《中国药典》规定剂量高限5倍剂量的不同海藻品种及生甘草的海藻玉壶汤,加减反药组合对甲状腺肿大大鼠甲状腺激素合成的影响机制;检测甲状腺组织Bax、Bcl-2mRNA的表达,探究对甲状腺细胞凋亡的相关影响机制。研究结果:1含高剂量药组合的海藻玉壶汤中海藻不同品种与甘草加减应用对甲状腺肿大大鼠药效作用的影响:首先复制甲状腺肿大模型,与空白组比较,模型组大鼠血清T4、FT3、FT4水平显着降低,TSH水平显着升高,甲状腺系数显着升高,大鼠甲状腺组织形态改变:甲状腺组织小叶排列紊乱,小叶结构较模糊,甲状腺滤泡上皮细胞弥漫性增生肥大,甲状腺滤泡大小不均匀,滤泡内分泌物变少。造模大鼠的体重、肛温均较空白组下降,大鼠出现低代谢状态,喜堆聚,反应迟缓,提示模型复制成功;给药治疗后阳性药治疗组纠正了大鼠甲状腺激素下降导致的低代谢状态,回调了降低的体重、肛温及血清T4、FT4、TSH水平,但对甲状腺系数及组织结构形态方面未见改善。海藻玉壶汤加减应用各组对造模大鼠体重、肛温、血清T4、FT3、FT4水降低无显着效果,海藻玉壶汤加减反药组合各组均回调了甲状腺肿大大鼠血清TSH水平;与模型组比较,海蒿子去甘草组、羊栖菜全方组、去海藻组、去海藻甘草组大鼠血清TBG水平升高;海蒿子去甘草组、羊栖菜全方组大鼠血清TRH较空白组升高;各组大鼠血清TPO、Tg水平无显着差;但对甲状腺肿大有显着改善包括甲状腺系数、组织结构形态等方面。2机制探讨2.1对甲状腺激素合成相关基因的影响:在本实验中PTU对大鼠甲状腺组织Tg mRNA表达影响无显着差异,抑制了大鼠甲状腺组织TPO mRNA表达。羊栖菜去甘草组则抑制了大鼠甲状腺组织Tg mRNA的表达,海蒿子去甘草组纠正了PTU对TPO mRNA表达的抑制作用,羊栖菜去甘草组则未能纠正,在促进TPO mRNA表达上,海蒿子去甘草组效果优于羊栖菜去甘草组。海蒿子及羊栖菜全方组效果无显着差异,均未能促进TPO mRNA表达。2.2对甲状腺细胞凋亡的影响:与空白组比较模型组Bax mRNA表达水平降低,Bax/Bcl-2降低,含不同品种海藻的海藻玉壶汤全方及加减海藻甘草反药组合各组可使Bax mRNA表达水平升高,未对Bcl-2mRNA表达产生影响,Bax/Bcl-2升高。研究结论:1含《中国药典》规定高限的5倍剂量海藻不同品种与甘草反药组合的海藻玉壶汤加减反药组合应用各组,对PTU造模导致的甲状腺激素水平下降无显着改善效果,但对TSH均有回调作用,TSH可促进TPO、Tg的生成,大鼠甲状腺组织TPO、Tg mRNA表达结果表明。在纠正甲状腺功能方面海藻玉壶汤中在去掉甘草单独使用高剂量海藻的情况下,海蒿子的效果可能优于羊栖菜,在与甘草配伍使用的情况下海蒿子与羊栖菜并未表现显着差异。海藻玉壶汤中反药组合加减应用各组未表现出显着差异。2含《中国药典》规定高限的5倍剂量海藻不同品种与甘草反药组合的海藻玉壶汤加减反药组合应用各组对甲状腺肿的治疗包括甲状腺系数、甲状腺组织形态结构有显着的治疗效果。其作用机制可能与促进甲状腺细胞的凋亡相关。反药组合加减应用以及不同海藻品种间并未表现出显着差异。
符园园[5]（2019）在《孕哺期大鼠母体邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯暴露影响子代小脑颗粒细胞增殖与凋亡的机制研究》文中指出目的:邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）因其在塑料制品中的广泛应用以及在环境中的不易降解,成为了一种普遍存在的环境污染物。作为一种环境内分泌干扰物,DEHP在土壤,水体以及空气中均被发现,并可通过多种途径进入人体。流行病学报道孕期及哺乳期DEHP暴露会影响胎儿的神经发育,小脑是神经发育中重要的脑区,与机体的运动功能,协调性以及运动学习都有关,小脑颗粒细胞是小脑中数量最多且其正常发育是保证小脑功能的前提。但目前母体孕期和哺乳期暴露DEHP是否影响仔鼠小脑颗粒细胞的发育还不明确,其相关机制也有待研究。本研究通过在孕期及哺乳期通过灌胃的方式构建DEHP暴露模型,探讨妊娠期及哺乳期母体DEHP暴露对子代小脑颗粒细胞的增殖凋亡以及其相关行为学发育的影响,并探明其可能作用机制。研究方法:本研究以Wistar孕鼠和原代提取的小脑颗粒细胞为研究对象,首先将雌性 Wistar 大鼠随机分为四组:0 mg/kg/day,30 mg/kg/day,300 mg/kg/day和750 mg/kg/day DEHP暴露组。按着对应的剂量对其从怀孕第一天到仔鼠出生后21天进行DEHP灌胃构建DEHP暴露动物模型。利用气相色谱-质谱联用仪检测四个剂量组中怀孕第19天母鼠尿液中DEHP的五种代谢产物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）、邻苯二甲酸单（2-乙基-5-羟己基）酯（MEHHP）、邻苯二甲酸单（2-乙基-5-氧己基）酯（MEOHP）、邻苯二甲酸（2-乙基-5羧基戊基）酯（MECPP）和邻苯二甲酸（2-羧基甲基已基）酯（MCMHP）的含量,初步证明DEHP暴露动物模型是否成立。对其出生后各个时间段的仔鼠进行相应的小脑相关的神经行为学检测,包括平面翻正反射,负屈地性反射和抓力测试。在仔鼠出生后7天和14天,采用免疫荧光染色观察各组仔鼠小脑小脑颗粒细胞增殖的情况,并通过Realtime PCR和Western blot检测Shh信号通路中相关蛋白的表达。采用ELISA检测子代小脑内的雌激素水平以及Western blot检测芳香化酶的表达情况。此外在体内采用TUNEL检测各剂量组仔鼠在PN 7和PN 14天小脑颗粒细胞的凋亡水平,并通过Western blot检测各组仔鼠小脑颗粒细胞PI3K/Akt信号通路中相关蛋白的表达情况。同时体外实验提取原代小脑颗粒神经元,建立原代小脑颗粒神经元MEHP暴露模型,采用CCK8检测MEHP对小脑颗粒神经元的耐受情况,并用TUNEL染色检测MEHP染毒后各组小脑颗粒神经元的凋亡水平以及采用免疫荧光染色检测其各剂量组的Cleaved caspase 3的表达情况;同时采用Western blot检测MEHP染毒后小脑颗粒神经元PI3K/Akt信号通路中相关蛋白的表达情况;并通过使用PI3K/Akt信号通路的激活剂IGF1以及抑制剂LY294002后检测各组小脑颗粒细胞的凋亡水平以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的变化情况。结果:1、孕期及哺乳期DEHP暴露对仔鼠小脑体重以及小脑脏器系数的影响。于仔鼠PN 7和PN 14天取材并称量仔鼠体重以及小脑的重量,称量结果表明,各组仔鼠（雌性与雄性）其小脑重量以及仔鼠的体重均无统计学差异。2、DEHP暴露模型中母鼠尿液中DEHP主要五种代谢产物的浓度。气相色谱-质谱联用仪检测四个剂量组中怀孕第19天母鼠尿液中DEHP的五种代谢产物MEHP、MECPP、MEOHP、MEMHP和MEHHP的含量。结果显示对照组的五种DEHP代谢产物的含量均低于最低检测限,但随着染毒剂量的增加,这五种代谢产物的含量也随之增加,并呈剂量反应关系（P<0.05）。这些结果表明我们成功建立了 DEHP暴露的动物模型。3、孕期及哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞的增殖的影响。免疫荧光结果显示,在PN 7和PN 14天,与对照组相比,300 mg/kg/d与750 mg/kg/d DEHP暴露组中雄性仔鼠小脑外颗粒层颗粒细胞的增殖率（Pax6+PCNA+/Pax6+）显着下降（P<0.05）。然而,对照组与 30 mg/kg/d DEHP暴露组之间仔鼠小脑颗粒细胞的增殖率并无明显差异（P>0.05）。此外,对于雌性仔鼠其各组之间增殖率并没有明显的差异（P>0.05）。4、孕期及哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠神经行为发育的影响。在PN 3,PN 5和PN 7天,与对照组相比,暴露于300与750 mg/kg/d DEHP剂量组的雄性仔鼠的平面翻正反射的时间均延长,且差异具有统计学意义（P<0.05）。而雌性仔鼠的平面翻正反射时间在各组间无明显差异（P>0.05）。对于抓力测试,暴露于300与750 mg/kg/d DEHP剂量组的雄性仔鼠仔鼠握杆时间与对照组相比显着减少（P<0.05）。而雌性仔鼠的握杆时间在各组间无明显差异（P>0.05）。此外,各组雌雄仔鼠前肢抓力实验时间均无明显差异。对于负趋地性反射实验,各个暴露组的雌雄仔鼠由头朝下转变到头朝上即旋转180°所需的时间均无明显差异（P>0.05）。5、孕期及哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞Shh信号通路的影响。Real time RCR结果显示,在PN 7和PN 14天,与对照组相比,暴露于300与750 mg/kg/d DEHP剂量组的雄性仔鼠小脑Shh,Gli1,N-Myc以及Cyclind1基因水平显着下降（P<0.05）。Western blot结果同样说明,在各个时间点,300与750 mg/kg/d DEHP暴露组的雄性仔鼠小脑Shh,Gli1,N-Myc以及Cyclind1蛋白表达水平比对照组也明显降低（P<0.05）,然而对于雌性仔鼠,在PN 7和PN 14天各剂量暴露组之间的仔鼠小脑Shh,Gli1,N-Myc以及Cyclind1的mRNA水平以及蛋白的表达均无明显变化（P>0.05）。6、孕期及哺乳期DEHP暴露对仔鼠小脑雌激素水平以及芳香化酶表达的影响。在各时间点暴露于300与750 mg/kg/d DEHP剂量组的雄性仔鼠小脑的芳香化酶的蛋白表达与对照组相比显着降低（P<0.05）,而雌性仔鼠的小脑的芳香化酶的蛋白表达在四个剂量组各个时间点均无明显差异（P>0.05）。此外,ELASA结果显示,与对照组相比,暴露于300与750 mg/kg/d DEHP剂量组的雄性仔鼠小脑的雌激素水平也有明显下降（P<0.05）,同样,雌性仔鼠小脑的雌激素水平在四个剂量组各个时间点均无明显差异（P>0.05）。7、孕期与哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞凋亡的影响。TUNEL结果显示300 mg/kg/d和750 mg/kg/d DEHP暴露组的雄性仔鼠的TUNEL阳性细胞率与对照组相比明显增加（P<0.05）,然而对雌性仔鼠的TUNEL阳性细胞率无明显影响（P>0.05）。8、孕期与哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠小脑Total caspase 3以及Cleaved caspase 3蛋白表达的影响。在雄性仔鼠中,在PN 7和PN 14天,300 mg/kg/d和750 mg/kg/d DEHP暴露组中Cleaved caspase 3的表达水平明显高于对照组（P<0.05）,而Total caspase 3的表达水平与对照组相比却反而下降（P<0.05）。对于雌性仔鼠各暴露剂量组间的Cleaved caspase 3的表达无明显差异（P>0.05）,Total caspase 3的表达也无明显差异（P>0.05）。9、孕期与哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠小脑PI3K/Akt信号通路的影响。Western Blot 结果显示,在 PN 7 和 PN 14 天,300 mg/kg/d 和 750 mg/kg/d DEHP暴露组雄性仔鼠小脑组织中的p-PI3K,p-Akt和Bcl-2水平与对照组相比显着下降（P<0.05）,而Bax的蛋白表达却明显上升（P<0.05）,各组雄性仔鼠小脑中PI3K,Akt蛋白表达无明显差异（P>0.05）。各剂量暴露组中雌性仔鼠的小脑中PI3K/Akt信号通路中相关蛋白水平均无明显变化（P>0.05）。10、MEHP对小脑颗粒神经元活力的影响。CCK8结果显示随着MEHP染毒剂量和时间的增加,细胞活力随之下降。25 lμM MEHP处理原代提取的小脑颗粒细胞12 h和24 h后,并没有明显影响小脑颗粒细胞的活力,但25 μM的MEHP作用在小脑颗粒神经元48 h后细胞活力显着下降（P<0.05）。此外,250 μM MEHP作用在小脑颗粒细胞24 h后,细胞活力与对照组相比大约下降了 20%,当1000 μM MEHP作用于细胞24h后,细胞活力下降了 50%。11、MEHP促进了原代小脑颗粒神经元凋亡。TUNEL染色结果显示随着MEHP染毒剂量的增加,小脑颗粒神经元TUNEL阳性细胞率随之增加（P<0.05）。同时我们还发现,随着MEHP的浓度增大,小脑颗粒神经元Cleaved caspase-3阳性细胞数也随之增多（P<0.05）。Western blot结果也显示,与对照组相比,MEHP染毒组的Cleaved caspase-3的蛋白水平明显增加（P<0.05）,而Total caspase-3的蛋白表达水平却反而下降（P<0.05）。12、MEHP干扰PI3K/Akt信号通路蛋白分子的表达。结果显示,与对照组相比,小脑颗粒神经元MEHP染毒组中p-PI3K,p-Akt和Bcl-2的蛋白表达水平明显下降（P<0.05）,而Bax的蛋白表达水平明显增加（P<0.05）。此外,在各个组中PI3K和Akt的蛋白表达水平无明显差异（P<0.05）。13、IGF1通过激活PI3K/Akt信号通路降低小脑颗粒细胞的凋亡,LY294002通过抑制PI3K/Akt信号通路加重了 MEHP诱导的小脑颗粒细胞的凋亡。MEHP单独处理组中的Bax和Cleaved caspase 3的蛋白表达水平增加（P<0.05）,而p-PI3K,p-Akt,Bcl-2和Totalcaspase3的蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。与MEHP单独处理组相比,IGF1与MEHP共同处理组中p-PI3K,p-Akt,Bcl-2 和 Total caspase 3 的蛋白水平明显增加（P<0.05）,而 Bax 和 Cleaved caspase3的蛋白表达水平降低（P<0.05）。此外,在IGF1单独处理组与对照组之间,各蛋白的表达水平无明显差异。同时TUNEL结果显示,与MEHP单独处理组相比,预先给予IGF1的MEHP处理组中的TUNEL阳性细胞数明显减少（P<0.05）。而在对照及IGF1单独处理组之间TUNEL阳性细胞数没有明显的差异（P>0.05）。与对照组相比,DEHP与PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002组一样可以抑制PI3K/Akt信号通路,且增加小脑颗粒细胞的TUNEL阳性细胞率（P<0.05）。与LY294002单独处理组相比,MEHP与LY294002共同处理组的p-PI3K,p-Akt,Bcl-2和Total caspase 3的蛋白表达水平显着降低（P<0.05）,Bax和Cleaved caspase 3的蛋白表达水平明显增高（P<0.05）,且小脑颗粒细胞的TUNEL阳性细胞率也明显增加（P<0.05）。结论:1、孕哺期DEHP暴露可通过下调Shh信号通路抑制雄性仔鼠小脑颗粒细胞的增殖,并导致神经发育障碍。2、孕哺期DEHP暴露可通过抑制PI3K/Akt信号通路诱导小脑颗粒细胞的过度凋亡。3、DEHP损伤小脑颗粒细胞的性别差异性可能与仔鼠小脑内雌激素水平以及芳香化酶表达有关。
郑慧娟[6]（2018）在《中药甲亢宁胶囊干预Graves病细胞增殖的自噬机制研究》文中认为研究背景Graves病（Graves disease,GD）又称毒性弥漫性甲状腺肿,是引起甲状腺功能亢进症（以下简称甲亢）最常见的原因。当前随着环境污染加重、生活节奏加快及压力增加,GD的发病率呈上升趋势。其每年100000名个体中约20～30例患者。在一生中,约3%的女性和0.5%的男性会患有GD,GD发病高峰期虽然在30-60岁之间,但各年龄段人群均可累及,影响着患者的身心健康和生活质量。研究认为,GD主要是由于遗传因素、环境因素、感染、精神创伤等因素诱发的免疫紊乱,产生的促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone,TSH）受体抗体（Thyrotropin receptor antibody,TRAb）与甲状腺细胞膜上的TSHR位点结合,其中甲状腺刺激性抗体（Thyroid Stimulating Antibody,TSAb）持续刺激胞膜TSHR,激活腺苷酸环化酶,使甲状腺细胞内环磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP）含量增加,从而促进甲状腺细胞过度增殖,导致甲状腺激素合成、分泌增加,引起甲状腺功能亢进和甲状腺肿大。可见,TSAb引起的细胞过度增殖是GD发病的基本病理环节,因此研究其作用机制与相应的干预措施对于防止GD发生发展具有重要的理论意义和实际应用价值。细胞自噬是真核细胞内大分子物质降解的主要途径,参与细胞生长、增殖、分化、衰老、凋亡等多种重要细胞生理病理过程的调节,这在维持细胞的稳态中发挥具有重要意义。自噬的形成是受一系列自噬相关基因（autophagy associated gene,ATG）及信号转导途径的严格调控。其中,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）,是 PI3K/Akt 通路下游的一种重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,通过活化下游p70核糖体蛋白S6激酶（p70 ribosomal proteinS6kinase,p70S6K）,参与调控甲状腺细胞的增殖和自噬活性。细胞自噬形成过程中,Beclinl是自噬启动阶段的主要调控分子;微管相关蛋白轻链3（Microtubule related protein light chain 3,LC3）有两种形式,LC3Ⅰ 和 LC3Ⅱ,当自噬发生时,Ⅰ型LC3经泛素样加工修饰过程,与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合,形成LC3Ⅱ。同时,ATG12与ATG5结合,在ATG16作用下,形成Atg12-Atg5-Atg16L复合物,与LC3系统结合,有助于自噬体的形成。近年来,随着自噬作用机制的研究深入,人们试图通过调控自噬功能来防治疾病,自噬相关蛋白已经成为疾病干预新的候选靶标,逐渐受到医学界的密切关注。研究自噬在TSAb刺激甲状腺上皮细胞增殖中的作用,对于通过调控甲状腺细胞自噬防治GD发病具有重要的指导意义。甲亢宁胶囊是我院林兰教授研制的具有滋阴潜阳、化痰散结作用治疗甲亢症的中药制剂。临床观察表明中药甲亢宁在缓解甲状腺肿大、减轻临床症状及不良反应等方面具有明显优势。为了进一步明确该理论的生物学内涵,探明滋阴潜阳化痰散结中药对GD的作用机制,导师团队以细胞过度增殖为切入点,对中药干预GD甲状腺细胞的生物学行为和机制展开深入研究。既往课题组发现甲亢宁可能通过下调Akt/mTOR和ERK1/2信号通路抑制甲状腺细胞的增殖,为深入研究中药甲亢宁是否通过调控自噬上游信号途径mTOR影响自噬活性的表达,进而发挥细胞增殖抑制的作用。本研究依托国家自然科学基金（81573961）,观察自噬在GD甲状腺细胞增殖过程中的作用及甲亢宁干预机制,在丰富中医药理论的同时,也为中医药防治GD的多靶点和多环节机制提供实验依据。目的1.明确自噬参与GD甲状腺细胞增殖病理过程及中药甲亢宁胶囊的干预作用。2.进一步从调控mTOR/p70S6K信号通路并影响自噬体膜形成角度探索中药甲亢宁抑制GD细胞增殖的作用机制。研究方法1.体内实验:采用致病性TSHR-α亚单位重组腺病毒免疫注射雌性Balb/c小鼠建立GD动物模型。通过观察血清中TRAb、T4表达鉴定模型的有效性,并采用甲状腺病理组织学观察,免疫组化检测Ki67及Western blot法检测Cyclin D1蛋白表达证实GD甲状腺细胞的增殖状态。分别采用透射电镜形态观察、免疫荧光标记自噬特异蛋白LC3的分布及Western blot法检测LC3B-Ⅱ和Beclin 1表达水平,从而明确GD模型小鼠甲状腺细胞增殖过程中的自噬表达变化及甲亢宁干预作用。为进一步探讨甲亢宁干预GD细胞增殖过程中的自噬发生分子机制,分别采用RT-PCR和Western-blot法检测自噬形成复合物ATG12、ATG5、ATG16L及信号通路蛋白p-mTOR、p-p70S6K在基因和蛋白层面的表达水平。2.体外实验:采用TSAb单克隆抗体（M22）诱导正常甲状腺上皮细胞Nthy-ori-3-1细胞,建立GD体外研究的细胞增殖模型,通过CCK8法检测M22诱导Nthy-ori-3-1细胞增殖的时效、量效关系。进而分别采用CCK8法、流式细胞术法、Western blot法及ELISA法检测甲亢宁含药血清干预前后细胞增殖-抑制率、细胞周期分布、周期蛋白CyclinD1表达水平及上清液中cAMP释放量的变化。进一步分别通过透射电镜、免疫荧光染色和Western blot法检测自噬体超微结构变化、自噬囊泡和LC3定位表达及自噬形成关键蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62的表达,从而明确M22诱导甲状腺细胞增殖过程中的自噬表达及中药甲亢宁的作用机制。为明确中药甲亢宁是否通过调控自噬机制进而干预甲状腺细胞的过度增殖,分别采用了自噬抑制剂3-MA和自噬经典诱导剂雷帕霉素验证其作用机制,观察自噬形成相关蛋白 LC3B-Ⅱ、ATG12、ATG16L、p-mTOR、p-p70S6K 的 mRNA 和蛋白表达,从细胞层面对动物实验结果加以验证。结果1.甲亢宁干预可显着降低GD模型小鼠血清TRAb、T4浓度水平,改善甲状腺肿大形态学及病理改变,降低GD模型小鼠甲状腺细胞中增殖标记蛋白Ki67表达水平和甲状腺周期蛋白CyclinD1表达水平。2.透射电镜观察自噬超微结构显示,GD模型小鼠甲状腺滤泡内核异染色质较多,无双层膜包饶的自噬体出现,甲亢宁干预后细胞内可见核固缩,染色质积聚,由双层隔离膜包裹的自噬体结构和自噬溶酶体消化后的空泡明显增多;Western blot结果提示甲亢宁可增加GD小鼠自噬膜关键蛋白LC3BⅡ和Beclin 1的表达水平。3.Western blot及RT-PCR法检测结果显示,甲亢宁可增加GD模型小鼠甲状腺ATG5、ATG12、ATG16L蛋白及基因表达水平;降低GD模型小鼠甲状腺p-mTOR、p-P70S6K蛋白及mTOR、p70S6K基因表达水平。4.CCK8法及ELISA法检测结果显示M22诱导的Nthy-ori-3-1细胞增殖活性明显增强,同时细胞上清液中的cAMP释放量显着增加;经不同浓度甲亢宁含药血清干预后,中、高剂量均可抑制其增殖活性,并显着减少M22诱导的cAMP含量;流式细胞术及Western blot法显示甲亢宁可抑制模型细胞周期分布及周期蛋白CyclinD1表达水平。5.透射电镜及荧光标记法观察显示甲亢宁可增加GD模型细胞中自噬体数量;WestenBlot检测结果显示甲亢宁可增加LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白表达水平,而降低p62蛋白表达。6.采用Western blot法检测中药干预对自噬潮的影响,结果显示,与模型组比较,模型+CQ组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平显着增加,中药组及中药+CQ组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平显着增加;与模型+CQ组比较中药+CQ组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平显着增加（p<0.05）。7.Western blot及RT-PCR法结果显示甲亢宁干预可增加GD模型细胞LC3b、ATG12、ATG16L蛋白及基因表达水平;降低GD模型细胞p-mTOR、p-P70S6K蛋白及mTOR、p70S6K基因表达水平。结论1.中药甲亢宁可降低GD模型小鼠甲状腺激素和TRAb水平,缓解甲状腺肿大和增生,抑制GD甲状腺细胞增殖标记蛋白Ki67表达水平和甲状腺周期蛋白CyclinD1表达水平。2.1 μg/ml M22刺激Nthy-ori-3-1甲状腺细胞24h建立GD甲状腺细胞增殖模型具有可行性;高剂量甲亢宁含药血清可明显抑制GD甲状腺细胞增殖和上清cAMP释放,并抑制细胞周期至G0G1期,减少CyclinD1蛋白表达水平。3.分别采用自噬体超微结构、免疫荧光染色及自噬标记蛋白检测法共同说明中药甲亢宁可促进GD甲状腺细胞的自噬活性表达。4.通过自噬流检测发现,中药甲亢宁促进LC3B-Ⅱ蛋白表达可能是与促进自噬体的形成以及抑制其降解过程有关。通过影响自噬体膜关键分子ATG12-ATG5-ATG16L的形成可能为其作用机制之一。5.进一步从基因和蛋白层面分析中药甲亢宁可能是通过下调mTOR/p70S6K信号通路介导细胞自噬的形成,进而发挥甲状腺细胞增殖的抑制作用。综合分析细胞实验所得结果,基本与动物实验结果相一致。
李楠[7]（2017）在《贝牡莪消中药复方对FRTL-5细胞增殖与凋亡影响的实验研究》文中研究表明研究目的:利用体外细胞培养的研究方法,从细胞水平观察贝牡莪消中药复方对体外细胞培养的FRTL-5细胞增殖和凋亡的影响,探讨以"活血行气,化痰散结"为原则创制的贝牡莪消中药复方对甲状腺肿大的作用机制。研究方法:1、细胞增殖抑制实验对照组为正常L-15完全培养基;实验组分别为浓度为1.Omg/ml、2.Omg/ml、5.0mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml 的贝牡莪消培养液。取对数生长期的FRTL-5细胞,接种在96孔板中,加入不同含药浓度的培养基,于24h、48h观察细胞增殖状态,采用CCK-8检测法在酶标仪450nm波长下测定吸光度值（OD值）.计算贝牡莪消中药复方对FRTL-5细胞生长抑制率。2、Bax,Bcl-2的mRNA水平检测收集各组细胞,提取RNA,采用实时荧光定量PCR法检测Bax,Bcl-2的mRNA表达。采用SPSS 20.0软件分析不同浓度贝牡莪消中药复方在不同时间对FRTL-5细胞增殖抑制情况及各组细胞Bax,Bc l-2 mRNA的表达数据。结果:1、采用CCK-8检测法测得不同浓度贝牡莪消培养液对FRTL-5细胞增殖具有抑制作用。2、贝牡莪消中药复方能使FRTL-5细胞促凋亡基因Bax的mRNA表达水平明显升高,尤其以浓度为15mg/ml和20mg/ml的贝牡莪消培养液效果明显,以20mg/ml差异最为显着（p<0.05）,贝牡莪消中药复方能使甲状腺细胞抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达水平下降,以浓度为15mg/ml的贝牡莪消培养液效果最为明显。结论:贝牡莪消中药复方有抑制FRTL-5细胞增殖及促进FRTL-5细胞凋亡的作用,可能是通过上调促凋亡基因及下调抗凋亡基因以达到促进甲状腺细胞凋亡的目的,提示贝牡莪消中药复方治疗甲状腺肿大的机制可能是通过抑制甲状腺细胞增殖及促进甲状腺细胞凋亡而实现。
王秋虹[8]（2016）在《林兰教授治疗甲亢经验及甲亢宁胶囊调控FRTL-5细胞ERK通路的机制研究》文中认为甲状腺机能亢进症（以下简称甲亢）是当前最常见的甲状腺疾病之一。口前该病的发病机制尚不明确,尚缺乏针对性的治疗药物,常规抗甲状腺药物无法解决甲状腺细胞过度增殖和甲亢复发问题。林兰教授从医50余载,对甲亢的治疗等方面认识深刻,研发了许多有效的治疗方剂,中药甲亢宁胶囊（以下简称“甲亢宁）即是其防治甲亢的临床经验的精髓之一。本论文首先对导师林兰教授治疗甲亢的经验进行了系统的整理,然后以体外培养的FRTL-5甲状腺细胞作为研究对象,从干扰和过表达两个方面,探讨甲亢宁通过调控ERK信号通路,抑制甲状腺细胞增殖、促其凋亡从而调节甲状腺细胞生长的可能分子机制。1临床研究目的：基于导师林兰教授治疗甲亢的临床资料,通过数据分析,总结其治疗甲亢的方药运用规律。结合与导师交流,人机结合,以人为主,总结其治疗甲亢肝损害、甲亢合并白细胞减少症、甲亢合并突眼、甲亢伴月经病等的临床经验。为总结和提炼甲亢中医药防治规律提供循证依据。方法：将2013年12月-2015年12月林兰教授在广安门医院内分泌门诊确诊的160例甲亢患者的437诊次的病例录入EXCEL2007表格。利用SPSS19.0软件、weka3.7数据挖掘软件、Liquorice数据挖掘软件,运用频数分析、聚类分析、关联规则、复杂网络等方法分析林兰教授处方用药规律。通过与导师交流,整理导师治疗甲亢、甲亢合并肝损害、甲亢合并白细胞减少症、甲亢合并突眼、甲亢伴月经病等的临床经验。结果：（1）筛选出符合标准的甲亢病例160例,得到治疗本病所涉及的中药167味,使用总频次为9032次,其中频数在10次以上的药物共有64味,总频数为8634次。其中生龙骨、煅磁石、珍珠母、麦冬、酸枣仁、五味子、夏枯草、法半夏、山慈菇等是林老治疗甲亢的核心药物。（2）将林教授437诊次治疗甲亢的处方中所有中药按照药物出现的总频次进行排序,频次超过10次的作为高频中药。参考第七版《中药学》教材及《中华本草》,将69味高频中药按照功效进行分类,并将各类中药中的所有药物使用频次加和并排序。统计结果显示,林兰教授治疗甲亢使用最多的是补虚药、安神药,其次为清热药、活血化瘀药、平肝息风药等。在补虚类药物使用上,以用补血药和补阴药为主,补气药和补阳药为次。林教授治疗甲亢常用具有滋阴潜阳、安神功效的中药。（3）采用SPSS19.0软件对高频中药进行聚类分析,结果显示林兰教授的治疗甲亢的处方分为九类：益母草、丹皮、山萸肉、紫河车、当归；盐杜仲、泽泻、炒白术、覆盆子、益智仁、香附、黄连、木香、红花、川芎、檀香、生黄芪、制远志、决明子：菌陈、黄柏、生牡蛎、珍珠母；白芍、生龙骨、五味子、夏枯草、麦门冬、太子参、柏子仁、酸枣仁；山慈菇、牛蒡子；枸杞子、煅磁石、钩藤；郁金,元胡；半夏,枳实。（4）采用Liquorice数据挖掘软件对高频中药进行分析,结果显示林兰教授的治疗甲亢的核心处方以滋阴潜阳、化痰散结、益气养阴功效为特点,生龙骨、煅磁石、夏枯草、枸杞子、钩藤、太子参、麦冬、白芍、五味子、生地、熟地、柏子仁、酸枣仁是最常见的方剂组合。（5）采用weka3.7数据挖掘软件,运用关联规则方法分析常用药对,并结合与导师交流,总结出林教授临床常使用的药对为：熄风潜阳组合—生龙骨、煅磁石；化痰散结组合—山慈菇、牛蒡子、浙贝母、连翘；疏肝理气组合—柴胡、白芍；理气化痰组合—半夏、枳实、郁金、元胡；益气养阴组合—太子参、麦冬、五味子；健脾燥湿组合—苍术、厚朴；安神组合—生龙骨、生牡蛎、煅磁石、珍珠母；酸枣仁、柏子仁；健脾化湿组合—茯苓、泽泻；滋补肝肾组合—覆盆子、益智仁、杜仲；养肝明目组合—枸杞子、决明子；祛风明目组合—青葙子、密蒙花。（6）通过与导师交流,总结了导师治疗甲亢分气滞痰凝、阴虚阳亢、阴虚火旺、气阴两虚四型论治,重视化痰活血,强调配合西药治疗。导师治疗甲亢合并突眼,强调辨主症论治。治疗甲亢合并肝损害,提倡分期论治。治疗甲亢伴白细胞减少症,以益气滋阴养血为治疗大法。治疗甲亢伴月经病,应用甲状腺药物维持治疗的同时,运用中药人工周期疗法。结论：本课题首次利用频数分析、聚类分析、关联规则、复杂网络等数据挖掘技术,对林兰教授治疗甲亢的临床用药规律进行了分析,并结合口传心授,总结出了林兰教授对甲亢、甲亢突眼、甲亢合并肝损害、甲亢合并白细胞减少、甲亢伴月经病的处方用药规律和治疗体会。2实验研究目的：从ERK信号传导通路探讨中药甲亢宁胶囊治疗甲亢的分子机制。方法：以原代培养的FRTL-5细胞为研究对象,采用CCK-8法筛选出甲亢宁抑制FRTL-5细胞增殖的最佳浓度,作为干预FRTL-5细胞的药物浓度。实验共设立对照组（Con）、甲亢宁组、甲亢宁+ERK1/2-siRNA组、siRNA阴性序列组（NO）、siRNA干扰组、过表达慢病毒组、甲亢宁+过表达慢病毒组、空病毒组（NC）等组别,分别采用CCK-8法检测甲亢宁对各组细胞增殖情况的影响、放免法测定各组细胞上清中的cAMP释放量、AV/PI双染法测定各组细胞凋亡率、Western Blot法以及RT-qPCR法观察ERK通路上增殖、凋亡相关基因（c-Raf、 p-ERK1/2、ERK1/2、Caspase-9、CyclinD1、Bcl-2、Bax）mRNA和蛋白表达的变化。以ERK1/2为切入点,利用RNAi技术阻断ERK信号传导通路,并应用慢病毒载体对ERK信号传导通路进行过度活化,从ERK1/2基因沉默和过表达两方面研究甲亢宁调控FRTL-5细胞ERK通路的机制。结果：（1）本实验采用原代培养出的FRTL-5细胞,冻存了足够的细胞,为后续的实验研究奠定了基础。（2）本实验采用CCK-8法检测法观察出不同甲亢宁浓度、不同干预时间的FRTL-5细胞增殖情况,经过重复实验,最终确定以5.438mg/ml的含甲亢宁的F12完全培养基干预的第24h作为FRTL-5细胞的干预浓度最为适宜。（3）采用CCK-8法证实了甲亢宁对FRTL-5细胞增殖具有抑制作用。（4）采用Annexin V/PI双染法检测了甲亢宁对转染ERK1/2-siRNA和感染ERKl/2过表达慢病毒的FRTL-5细胞凋亡的影响,结果显示,与对照组相比,甲亢宁组细胞发生凋亡（P<0.01）,经ERK1/2-siRNA干扰后FRTL-5细胞发生凋亡,甲亢宁协同组细胞凋亡更加显着（P<0.05）,ERK1/2-siRNA组、ERK1/ 2-siRNA阴性序列组的凋亡率与对照组相比增加但无统计学意义。与甲亢宁组相比,甲亢宁+ERK1/2-siRNA组、甲亢宁+ERK1/2慢病毒组的细胞凋亡率差异无统计学意义,其余各组的细胞凋亡率与甲亢宁组相比差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与ERK1/2-siRNA阴性序列组相比,甲亢宁+ERK1/2-siRNA组细胞的凋亡率明显升高（P<0.01）。与空病毒组相比,甲亢宁组、甲亢宁+ERK 1/2-siRNA组的凋亡率明显升高（P<0.01）。（5）采用放免法测定各组细胞上清中的cAMP释放量,与对照组相比,ERK1/2-siRNA组、ERK1/2-siRNA阴性序列组的cAMP释放量无显着差异,其余各组的cAMP释放量与对照组相比,均有所降低,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,其中甲亢宁组的cAMP释放量降低最为显着。与甲亢宁组相比,对照组、ERK1/2-siRNA组、ERK1/2-s iRNA阴性序列组的cAMP释放量差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。（6）RT-qPCR法检测结果显示,与对照组相比,甲亢宁组、ERK1/2-siRNA组、甲亢宁+ERK1/2-siRNA组的c-Raf、ERK1、ERK2、CyclinD1、Bc1-2 mRNA表达量均显着降低（P<0.01）；甲亢宁组的BaxmRNA、Caspase-9mRNA表达量增高但无统计学意义,ERK1/2-siRNA组、甲亢宁+ERK1/2-siRNA组的BaxmRNA、Ca spase-9mRNA表达量显着增高（P<0.01）；与对照组相比,过表达慢病毒组、甲亢宁+慢病毒组的c-Raf、ERK1、ERK2、Bax的]mRNA表达量明显增高（P<0.01）,CyclinD1mRNA、Bcl-2mRNA的表达量明显降低（P<0.01）。（7）Western Blot法检测结果显示,甲亢宁组、ERK1/2-siRNA组、甲亢宁协同组的c-Raf、p-ERK1/2、ERK1/2、CyclinD1、Bcl-2的蛋白表达均显着下调（P<0.01）；甲亢宁组的Caspase-9蛋白表达量增高（P<0.01）,ERKl/2-siRNA组、甲亢宁协同组Bax、Caspase-9的蛋白表达显着上调（P<0.01）；与对照组相比,过表达慢病毒组、甲亢宁+慢病毒组的c-Raf、p-ERK1/2、ERK1/2、Bax的蛋白表达明显上调（P<0.01）,CyclinD1mRNA、Bcl-2的蛋白表达明显下调（P<0.01）。结论：ERK1/2-siRNA可以协同甲亢宁所致的抑制FRTL-5细胞增殖、促其细胞凋亡的作用；ERK1/2的过表达使FRTL-5细胞获得更高的增殖与抗凋亡能力,对甲亢宁的抗药性显着增加；甲亢宁对ERK1/2的磷酸化起阻断作用,甲亢宁通过调控ERK1/2的表达从而调节FRTL-5细胞中c-AMP、c-Raf、Bax、Bcl-2. Caspase-9 及 CyclinD1的表达,而抑制FRTL-5细胞增殖、促进其凋亡,从而改善甲状腺细胞动力学平衡,调控甲状腺细胞生长。
付令利[9]（2014）在《功能亢进下斜肌IGF-1和AnnexinA1表达的研究》文中进行了进一步梳理目的本课题通过HE染色观察功能亢进下斜肌病理学改变,通过免疫组化观察功能亢进下斜肌中胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor1, IGF-1）和膜联蛋白A1（AnnexinAl, AnxAl）的表达变化,以探讨IGF-1和AnxAl表达变化与下斜肌功能亢进发病机制的相关性。方法随机收集原发性下斜肌功能亢进患者下斜肌16例为原发组,继发性下斜肌功能亢进患者下斜肌16例为继发组,正常下斜肌11例为正常对照组。下斜肌功能亢进患者斜视术后截取亢进下斜肌4-6mm,正常下斜肌取材于同期行眼球摘除或角膜移植供体取得的功能正常下斜肌,截取正常下斜肌3-4mm。截取的肌组织固定切片后,行HE染色观察下斜肌病理学变化；行IGF-1和AnxAl免疫组织化学染色后测量IGF-1和AnxAl在下斜肌中的IOD值（integrated optic density, IOD）。使用SPSS17.0统计软件,各定量指标进行组间比较,各组间数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验进行统计学分析,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果原发组下斜肌肌纤维直径大小不等,走行不规则,可见部分肌纤维直径增粗,直径增粗的肌纤维与正常组相比所占比例更高,直径变异较大,少量肌纤维可见肌纤维内出现核内移现象,间质见少量胶原纤维增生；继发组下斜肌形态学改变与原发组下斜肌表现基本相似。各组下斜肌行免疫组织化学染色,观察IGF-1、AnxAl在下斜肌中IOD值。正常对照组下斜肌肌组织中IGF-1、AnxAl的IOD值分别为5.740±0.611,5.532±0.665；原发组下斜肌肌组织中IGF-1、AnxAl的IOD值分别为13.144±3.478,12.062±3.375；继发组下斜肌肌组织中IGF-1、AnxAl的IOD值分别为12.543±3.023,13.802±3.389。与正常对照组对比,原发组和继发组其IGF-1、AnxAl的1OD值的差异均具有显着性（P<0.01）；原发性组和继发组相比,其IGF-1、AnxAl的IOD值均未见明显统计学差异（P>0.05）。结论1、原发性功能亢进下斜肌存在不同程度肌纤维直径、排列及走形的异常,部分肌纤维增粗,部分肌纤维内出现核内移现象,间质见少量胶原纤维增生；原发组和继发组功能亢进下斜肌的形态学改变基本相似。这些形态学改变可能导致了下斜肌的肌力增强。2、原发组和继发组功能亢进下斜肌中IGF-1和AnxAl表达较正常对照组的下斜肌升高,提示下斜肌功能亢进产生机制可能与IGF-1和AnxAl的高表达有关。3、原发组和继发组中IGF-1、AnxAl的表达分别与下斜肌功能亢进程度呈正相关。原发组和继发组其下斜肌功能亢进程度越重,则IGF-1、AnxAl的表达相对越高,相反,如果下斜肌功能亢进程度越轻,则IGF-1、AnxAl的表达相对越低。这进一步说明了,下斜肌功能亢进产生机制可能与下斜肌中IGF-1、AnxAl的表达有关,IGF-1和AnxAl的表达越高,则促进下斜肌的修复再生的能力越强,使其组织结构和形态功能发生越大的变化,导致下斜肌肌力增强越明显,下斜肌功能亢进程度越重。
牟淑敏[10]（2012）在《薯蓣皂苷元通过激活caspase信号通路诱导IGF-1作用下的人原代甲状腺细胞凋亡》文中指出研究背景：Graves病（GD）是由甲状腺受体抗体（TRAb）所介导的一种自身免疫性疾病,临床表现为甲状腺机能亢进和弥漫性甲状腺肿大。GD甲状腺肿与其愈后密切相关,许多研究证实合并甲状腺肿大的GD患者比不合并甲状腺肿的患者在接受药物和I131治疗后,缓解率明显降低,复发率明显升高。研究表明GD患者甲状腺中抗凋亡蛋白BCL-2、FLIP等明显升高,而促凋亡蛋白FAS, FASL, Bax明显降低。说明在GD甲状腺中细胞增殖增加而细胞凋亡减少。胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1IGF-1）在GD甲状腺肿形成过程中起了重要作用。IGF-1是甲状腺细胞的生长必不可少的生长因子。研究发现在GD患者增生的甲状腺组织中IGF-1与IGF-1受体的表达同时升高；并且IGF-1与GD甲状腺肿的形成密切相关。我们的前期研究也证实：血浆IGF-1水平与GD患者甲状腺肿大的程度呈正相关。高水平的IGF-1一方面通过上调cyclin D促进甲状腺细胞从G0/G1期进入S期,导致甲状腺细胞增殖；另一方面通过PI3K细胞通路促进FLIP的表达,抑制甲状腺细胞的凋亡。传统GD治疗方法包括：抗甲状腺药物、I131和手术治疗。这三种治疗方法临床缓解率偏低,均有不同程度的复发,并且存在白细胞减低、肝功能损伤、甲状腺功能减退、喉返神经损伤等副作用。所以研究GD甲状腺肿的发病机理,并且探讨针对GD甲状腺肿治疗方法具有重要意义。薯蓣皂苷元是一种甾体皂苷,广泛存在于各种植物中比如：穿山龙、山药、葫芦巴种子等,在制药工业中作为原材料用于生产多种甾体类激素。薯蓣皂苷元的多种生物学活性通过体内或体外实验得到证实：薯蓣皂苷元通过促进胆道和肠道胆固醇的排泄降低血浆胆固醇水平；在卵巢切除的成年大鼠模型中可以模拟雌激素样作用。薯蓣皂苷元在多种肿瘤细胞株中,通过多途径发挥抗增殖促凋亡作用。例如：在人类HCT-116结肠癌细胞中薯蓣皂苷元通过降低HMG-CoA还原酶水平促进HCT-116凋亡；在人K562白血病细胞中通过调节Ca离子稳态和线粒体凋亡因子水平,促进K562细胞凋亡；在HER2过表达的人乳腺癌细胞中通过抑制脂肪酸合成酶的表达,调节Akt、mTOR和JNK蛋白的磷酸化,发挥促凋亡作用。薯蓣皂苷元的促凋亡作用不仅可以用于肿瘤细胞,而且可以用于增殖的正常细胞。例如：薯蓣皂苷元通过上调环氧化酶-2（COX-2）,产生过量的前列腺素E2（PGE-2）,促进人风湿性关节炎滑膜细胞凋亡。国内外文献检索未见薯蓣皂苷元治疗甲状腺疾病的报道。细胞凋亡是一种程序死亡过程,通常由内源性和外源性两条信号通路诱导发生。在外源性信号通路中,死亡配体与受体结合,传导死亡信号,并形成死亡诱导信号复合物（DISC）:包括死亡结构域（FADD）和其下游分子caspase8。DISC招募多个caspase8,并且通过自身降解激活caspase8,顺序激活下游的凋亡执行蛋白。FLIP竞争性地与FADD结合,阻止DISC形成,抑制caspase8的自身激活,发挥抗凋亡作用。在内源性信号通路中,促凋亡因子改变了线粒体膜电位（MMP）的通透性,细胞色素C由线粒体释放到胞浆中,与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和ATP相结合,然后结合caspase9形成凋亡体,凋亡体通过自身降解激活caspase9。激活的caspase8和caspase9顺序性地激活死亡执行器caspase3,导致细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括：Bax、Bcl-2等,通过影响线粒体膜电位改变,调节内源性细胞凋亡。由以上研究可知甲状腺细胞增殖和凋亡之间的关系失衡是导致GD甲状腺肿大的重要因素,甲状腺细胞的增殖与IGF-1呈正相关。所以本研究将观察薯蓣皂苷元诱导IGF-1刺激下的人原代甲状腺细胞凋亡的分子机制。研究结果显示薯蓣皂苷元可以明显诱导IGF-1刺激下的人甲状腺原代细胞凋亡,其主要机制是通过激活caspase信号通路,其中外源性通路是通过抑制FLIP的表达激活caspase8;内源性通路是通过增加活性氧（ROS）产生、调节Bax,Bcl-2之间的平衡,激活caspase9实现的。这些研究表明薯蓣皂苷元是一种有前途的治疗GD甲状腺肿的药物。研究目的：1.通过MTT、细胞荧光染色、流式细胞技术观察薯蓣皂苷元对IGF-1刺激下的甲状腺原代细胞的促凋亡作用。2.通过免疫印迹技术证明薯蓣皂苷元的促凋亡作用是通过激活内源性和外源性caspase信号通路实现的。研究方法：1.人原代甲状腺细胞培养正常甲状腺组织来自山东省立医院甲状腺次全切手术中切除的结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤的远端组织,每个标本经病理专家鉴定为正常甲状腺组织。新鲜的甲状腺组织被切成1×1cm。大小,经D-Hanks’液反复冲洗后,在含有0.25%胶原酶Ⅰ（Sigma）和0.125%胰酶（Sigma）的消化液中,恒温（37℃）水浴震荡消化40-60分钟。消化液经200目滤网过滤去除胶原组织、并离心得到甲状腺细胞。甲状腺细胞培养于DMEM/F12K（1：1）培养基,含有10%新生牛血清,2mU/mL的TSH,和青链霉素双抗。细胞培养条件5%C02,37℃孵箱。2.细胞处理和实验分组甲状腺原代细胞经过3-5天生长,当细胞融合至70-80%,改为饥饿培养基（DMEM/F12K（1：1）含有0.2%新生牛血清,无TSH）饥饿24小时,然后用或者不用含有IGF-1（100ng/ml, sigma）的饥饿培养基预处理24小时后,加入不同浓度的薯蓣皂苷元作用相应的时间。3.实验方法（1）应用MTT法检测细胞增殖活性,Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞分析磷脂酰丝氨酸外翻检测细胞凋亡的发生。（2）蛋白印迹法检测细胞信号通路蛋白的表达。（3）流式细胞技术检测细胞内活性氧（ROS）产生。研究结果：1.薯蓣皂苷元抑制IGF-1诱导的甲状腺细胞增殖100ng/ml的IGF-1能显着地促进人原代甲状腺细胞增殖,促增殖作用1.6倍于无IGF-1作用组（p<0.05）。薯蓣皂苷元能明显抑制IGF-1诱导的甲状腺细胞增殖并且这种抑制作用呈现剂量和时间的依赖关系（p<0.05）。2.薯蓣皂苷元诱导IGF—1作用下的甲状腺细胞凋亡的细胞形态学的改变Hoechst33342/PI荧光染色显示：正常的甲状腺细胞核形态正常,被Hoechst33342轻度蓝染,很少部分凋亡细胞呈核浓集。IGF-1作用下的甲状腺细胞数目较正常对照组增多,并且呈现更少的核浓集细胞。20μ mol/1薯蓣皂苷元作用下的细胞,部分细胞呈现凋亡的形态学改变：细胞皱缩,核浓集。早期凋亡的细胞被Hoechst33342深度蓝染,晚期凋亡细胞被Hoechst33342和PI双染。40μ mol/1薯蓣皂苷元作用的甲状腺细胞,凋亡的甲状腺细胞明显增多,而且呈现PI单染的坏死的细胞。说明薯蓣皂苷元诱导细胞凋亡具有量效相关性。3.薯蓣皂苷元提高了IGF-1作用下的甲状腺细胞的凋亡比率流式细胞仪检测annexin V/PI染色显示：单IGF-1作用组总的凋亡细胞数为6.70%,明显低于无IGF-1作用的正常对照组7.53%（p<0.05）。20μ mol/1薯蓣皂苷元作用组,凋亡细胞比率升高至27.83%,明显高于单IGF-1作用组（p<0.05）。40μ mol/1薯蓣皂苷元作用组显示凋亡细胞比率为34.41%,明显高于20μ mol/1薯蓣皂苷元作用组（p<0.05）,说明薯蓣皂苷元的促凋亡作用呈量效关系。4.薯蓣皂苷元诱导IGF-1作用下的甲状腺细胞凋亡通过激活caspase级联免疫印迹法显示：正常甲状腺细胞表达全长的caspase3, caspase8, caspase9蛋白,并且微弱表达它们各自的终末活性片段。IGF-1作用后与正常组相比,caspase3, caspase8, caspase9蛋白的终末活性片段表达量减少,说明IGF-1抑制·caspase3, caspase8, caspase9蛋白激活。薯蓣皂苷元处理组显示：caspase3, caspase8, caspase9蛋白被完全裂解为它们的终末活性片段,呈量效关系。说明薯蓣皂苷元激活了caspase级联。5.薯蓣皂苷元通过P13K信号通路下调FLIP蛋白表达并激活caspase8为了阐明P13K细胞通路在薯蓣皂苷元促凋亡机制中的作用,我们应用P13K特异性阻断剂LY294002预处理甲状腺细胞1小时,然后用含有IGF-1（100ng/ml,s i gma）的培养基处理24小时,最后加入40μ mol/1的薯蓣皂苷元作用48小时。FLIP, caspase8蛋白水平通过免疫印迹法检测。我们发现IGF-1上调了FLIP的表达,并且抑制caspase8的激活。单用40μ mol/1的薯蓣皂苷元作用48小时后,IGF-1上调了FLIP的作用被明显抑制了,而caspase8被激活。薯蓣皂苷元下调FLIP和激活caspase8的程度与P13K阻断剂LY294002相似。LY294002预处理甲状腺细胞1小时,薯蓣皂苷元的上述作用被明显增强。6.薯蓣皂苷元重新调节Bcl-2,Bax之间的平衡关系,并激活Caspase9Caspase9,Bcl-2,Bax蛋白表达通过免疫印迹法进行测量。研究结果显示与正常甲状腺细胞相比IGF-1抑制Caspase9的自身激活,减少Caspase9活性终末片段的表达。而薯蓣皂苷元则激活了Caspase9使其裂解为最终的活性亚基（P17）。Bcl-2和Bax是线粒体凋亡通路的一对作用相反的调控因子。IGF-1预处理显示,抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调,促凋亡蛋白Bax表达下调。相反的,40μm01/1的薯蓣皂苷元作用48小时后,与IGF-1预处理组相比,Bcl-2表达明显降低,而Bax表达明显升高。7.薯蓣皂苷元激活氧化应激流式细胞测定细胞内活性氧含量显示：与正常组相比IGF-1明显减少活性氧产生,薯蓣皂苷元能明显增加细胞内活性氧的含量。由此可见,薯蓣皂苷元可能通过产生过多的活性氧激活了线粒体凋亡通路。研究结论：1.薯蓣皂苷元诱导IGF-1作用下的人原代甲状腺细胞凋亡。2.薯蓣皂苷元激活凋亡执行蛋白caspase3。3.薯蓣皂苷元通过P13K通路阻断FLIP,激活caspase8。4.薯蓣皂苷元重新调节Bcl-2,Bax之间的平衡关系,并激活Caspase9。5.薯蓣皂苷元通过产生ROS激活线粒体信号通路。
二、IGF-1 mRNA expression of adult rat thyroid cell cultured in vitro（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IGF-1 mRNA expression of adult rat thyroid cell cultured in vitro（论文提纲范文）
（1）海藻玉壶汤特定剂量条件下的反药组合加减抗甲状腺肿的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 海藻反甘草的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 海藻玉壶汤中化学成分及药理作用研究概况 |
| 参考文献 |
| 综述三 海藻玉壶汤治疗甲状腺肿大的实验研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一节 海藻甘草反药组合加减应用对海藻玉壶汤中5种活性成分溶出含量的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减对甲状腺肿大大鼠甲状腺形态的影响 |
| 实验一 甲状腺肿大大鼠模型的复制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减对甲状腺肿大大鼠体征、甲状腺系数的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减对甲状腺肿大大鼠甲状腺组织病理形态的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三节 基于下丘脑-垂体-甲状腺轴探讨海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减对甲状腺肿大模型大鼠的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四节 基于凋亡信号通路探讨海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减对甲状腺肿大模型大鼠细胞凋亡的影响 |
| 实验一 电镜下观察甲状腺肿大模型大鼠细胞凋亡 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 TUNEL染色法计算凋亡指数 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减对大鼠甲状腺Caspase8、Caspase9蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验四 海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减对大鼠甲状腺Fas、Bc1-2 mRNA表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 在校期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（2）甲状腺相关眼病视网膜血管密度观察及眼眶成纤维细胞中NF-κB抑制剂的治疗作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分: 不同病程甲状腺相关眼病的视盘及黄斑区血管密度研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 对象和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二部分: 眼眶成纤维细胞中NF-κB抑制剂对甲状腺相关眼病的治疗作用 |
| 1. 前言 |
| 2. 对象和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 眼眶成纤维细胞在甲状腺相关眼病发病机制中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）转录组学揭示德保矮马体尺矮小的分子遗传机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 德保矮马和蒙古马简介 |
| 1.1.1 德保矮马简介 |
| 1.1.2 蒙古马简介 |
| 1.1.3 德保矮马和蒙古马的关系 |
| 1.2 体高相关研究 |
| 1.2.1 体高的定义 |
| 1.2.2 动物体高研究进展 |
| 1.2.3 人类身高及其相关疾病 |
| 1.2.4 长骨的生长与发育 |
| 1.3 调控体尺形成相关激素研究进展 |
| 1.3.1 GH与体尺的研究 |
| 1.3.2 IGF-1与体高的研究 |
| 1.3.3 TSH和PTH与骨发育的研究 |
| 1.4 骨发育调控相关信号通路的研究 |
| 1.4.1 激素类信号通路 |
| 1.4.2 WNT信号通路 |
| 1.4.3 Hedgehog信号通路 |
| 1.4.4 RANKL信号通路 |
| 1.5 本研究的目的意义、主要内容及技术路线 |
| 1.5.1 研究的目的意义、主要内容 |
| 1.5.2 研究的主要技术路线 |
| 1.6 创新点 |
| 2 转录组数据的基础分析 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 提取各组织样本RNA |
| 2.2.3 文库制备和测序 |
| 2.2.4 生物信息分析流程 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 德保矮马与蒙古马采样信息 |
| 2.3.2 RNA提取检测结果 |
| 2.3.3 建库及测序结果 |
| 2.3.4 原始数据分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 动物组织的选择及转录组测序 |
| 2.4.2 测序数据初级分析 |
| 2.5 小结 |
| 3 调控德保矮马矮小性状形成候选基因的筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验数据 |
| 3.1.2 垂体GH差异表达 |
| 3.1.3 长骨GHR差异表达 |
| 3.1.4 骨骺相关因子的差异表达 |
| 3.1.5 基质矿化相关因子的差异表达 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 垂体GH差异表达情况 |
| 3.2.2 GHR基因分析 |
| 3.2.3 骨骺相关因子的差异表达 |
| 3.2.4 相关细胞信号通路因子的差异表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 德保矮马矮小性状调控信号通路的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物样品 |
| 4.1.2 主要实验耗材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 样品采集 |
| 4.2.2 总RNA提取 |
| 4.2.3 反转录cDNA检测 |
| 4.2.4 引物设计 |
| 4.2.5 引物退火温度 |
| 4.2.6 定量PCR实验 |
| 4.2.7 组织蛋白的提取 |
| 4.2.8 SNP检测 |
| 4.2.9 统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 肝脏样品中IGF-1基因的表达量 |
| 4.3.2 垂体TSHB和CGA表达 |
| 4.3.3 垂体中GH的表达 |
| 4.3.4 长骨骨骺GHR的表达 |
| 4.3.5 GH的Western Blot检测 |
| 4.3.6 GHR的SNP检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 调控德保矮马体尺矮小信号通路相关基因表达的验证 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物样品 |
| 5.1.2 细胞株 |
| 5.1.3 慢病毒载体 |
| 5.1.4 试剂耗材 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 马骨髓间充质干细胞的原代分离培养 |
| 5.2.2 马骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞 |
| 5.2.3 细胞茜素红和阿尔新蓝染色 |
| 5.2.4 细胞的MTT实验 |
| 5.2.5 慢病毒载体构建及ATDC5细胞病毒转染 |
| 5.2.6 总RNA提取 |
| 5.2.7 RNA转录为cDNA |
| 5.2.8 定量PCR检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 马骨髓间充质干细胞系的建立 |
| 5.3.2 马的骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化 |
| 5.3.3 成骨细胞鉴定 |
| 5.3.4 ATDC5细胞培养 |
| 5.3.5 细胞MTT检测 |
| 5.3.6 ATDC5细胞株信号通路基因定量PCR检测 |
| 5.3.7 诱导后细胞信号通路基因的检测 |
| 5.3.8 GHR病毒包装 |
| 5.3.9 慢病毒感染ATDC5细胞 |
| 5.3.10 慢病毒细胞株GHR信号通路基因的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 血液激素含量分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验动物样品 |
| 6.1.2 实验耗材 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 血液的采集及处理 |
| 6.2.2 放射免疫实验 |
| 6.2.3 统计分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 血浆中T3,T4和TSH浓度检测 |
| 6.3.2 血浆中GH和IGF-1浓度检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 全文总结 |
| 7.1 全文结论 |
| 7.2 研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（4）海藻玉壶汤中加减高剂量甘草及不同品种海藻的药效及机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述1 含海藻甘草反药组合的海藻玉壶汤治疗甲状腺肿大的实验及临床回顾 |
| 参考文献 |
| 综述2 甲状腺细胞凋亡的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一节 含高剂量药组合的海藻玉壶汤中海藻不同品种与甘草加减应用对甲状腺肿大大鼠的药效探讨 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 含高剂量药组合的海藻玉壶汤中海藻不同品种与甘草加减应用对甲状腺肿大大鼠药效机制的探讨 |
| 实验一 含高剂量药组合的海藻玉壶汤中海藻不同品种与甘草加减应用对甲状腺肿大大鼠甲状腺TPO、TgmRNA表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 含高剂量药组合的海藻玉壶汤中海藻不同品种与甘草加减应用对甲状腺肿大大鼠甲状腺Bax、Bcl-2mRNA表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（5）孕哺期大鼠母体邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯暴露影响子代小脑颗粒细胞增殖与凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :孕哺期大鼠母体邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯暴露抑制雄性仔鼠小脑颗粒细胞增殖的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 动物分组与DEHP暴露模型的建立 |
| 2.3 母鼠尿液中DEHP代谢产物的测定 |
| 2.4 仔鼠行为学指标的检测 |
| 2.5 免疫荧光实验检测小脑颗粒细胞外颗粒层的增殖相关蛋PCNA的表达 |
| 2.6 总RNA提取以及Realtime-PCR检测 |
| 2.6.1 总RNA提取 |
| 2.6.2 mRNA逆转录获得c DNA |
| 2.6.3 Realtime-PCR检测 |
| 2.7 蛋白定量以及Western blot检测 |
| 2.7.1 蛋白定量 |
| 2.7.2 Western blot检测 |
| 2.8 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 孕哺期DEHP暴露对仔鼠小脑体重以及小脑重的影响 |
| 3.2 母鼠尿液中DEHP主要五种代谢产物的浓度 |
| 3.3 孕哺期DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞增殖的影响 |
| 3.4 孕哺期DEHP暴露对仔鼠神经行为发育的影响 |
| 3.5 孕哺期DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞Shh蛋白以及m RNA表达的影响 |
| 3.6 孕哺期DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞Gli1 mRNA以及蛋白表达的影响。 |
| 3.7 孕哺期DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞N-myc mRNA以及蛋白表达的影响 |
| 3.8 孕哺期DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞Cyclind1 mRNA以及蛋白表达的影响 |
| 3.9 孕哺期DEHP暴露对仔鼠小脑雌激素水平以及芳香化酶表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 :孕哺期大鼠母体邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯暴露诱导仔鼠小脑颗粒细胞凋亡的研究 |
| 5 前言 |
| 6 材料和方法 |
| 6.1 主要仪器和试剂 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 主要试剂的配置 |
| 6.2 研究对象和分组 |
| 6.2.1 实验动物 |
| 6.2.2 动物分组与DEHP暴露模型的建立 |
| 6.3 原代小脑颗粒细胞的分离及培养 |
| 6.4 小脑颗粒细胞的纯度鉴定 |
| 6.5 原代小脑颗粒细胞MEHP暴露模型的建立 |
| 6.6 CCK8 细胞增殖检测 |
| 6.7 TUNEL法检测细胞凋亡水平 |
| 6.8 免疫荧光 |
| 6.9 蛋白定量以及Western blot检测 |
| 6.9.1 蛋白定量 |
| 6.9.2 Western blot检测 |
| 6.10 统计学分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 孕哺期母体DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞凋亡的影响 |
| 7.2 孕哺期母体DEHP暴露对仔鼠Total caspase3 以及Cleaved caspase3 蛋白表达的影响。 |
| 7.3 孕哺期母体DEHP暴露对仔鼠小脑PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 7.4 原代小脑颗粒神经元纯度的鉴定 |
| 7.5 MEHP对小脑颗粒神经元活力的影响 |
| 7.6 MEHP促进了小脑颗粒细胞的凋亡 |
| 7.7 MEHP干扰了PI3K/Akt信号通路蛋白分子的表达 |
| 7.8 IGF1 通过激活PI3K/Akt信号通路降低小脑颗粒细胞的凋亡 |
| 7.9 LY294002 通过抑制PI3K/Akt信号通路加重了MEHP诱导的小脑颗粒细胞的凋亡 |
| 8 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）中药甲亢宁胶囊干预Graves病细胞增殖的自噬机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 文献综述 |
| 综述一: 自噬与甲状腺细胞信号调控分子机制的研究进展 |
| 1. 自噬的分子调控机制 |
| 2. 自噬的功能作用 |
| 3. 自噬调控甲状腺疾病的分子机制 |
| 4. 小结与展望 |
| 综述二: 中药干预细胞自噬的研究状况 |
| 1. 中药的自噬调节作用 |
| 2. 中药自噬调节剂的临床应用前景与局限 |
| 3. 中药复方调节自噬研究存在的问题 |
| 4. 小结与展望 |
| 综述三: Graves病的中医学研究进展 |
| 1. 中医学认识 |
| 2. 治疗 |
| 3. 基础研究 |
| 4. 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 第一部分 中药甲亢宁干预Graves病自噬机制的体内实验研究 |
| 技术路线 |
| 实验一 Graves病小鼠甲状腺细胞增殖模型建立及甲亢宁干预作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 Graves病小鼠甲状腺细胞增殖中的自噬表达及甲亢宁干预作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 甲亢宁干预Graves病小鼠甲状腺细胞增殖的自噬机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 体外观察甲亢宁含药血清干预M22诱导甲状腺细胞增殖的自噬机制研究 |
| 技术路线 |
| 实验四 M22诱导甲状腺细胞增殖模型建立及甲亢宁干预作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 M22诱导甲状腺细胞增殖中的自噬表达及甲亢宁干预作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六 甲亢宁干预M22诱导甲状腺细胞增殖中的自噬机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 创新点与不足 |
| 附: 导师治疗Graves病经验总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（7）贝牡莪消中药复方对FRTL-5细胞增殖与凋亡影响的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1、甲状腺肿大的中医药研究进展 |
| 1.1 病名源流 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 治疗研究 |
| 2、甲状腺肿大的西医研究概况 |
| 2.1 病因与发病机制 |
| 2.2 诊断 |
| 3、中药调节甲状腺细胞增殖与调亡的作用机制研究进展 |
| 3.1 动物实验类 |
| 3.2 细胞实验类 |
| 材料与方法 |
| 1、实验材料和仪器 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要耗材 |
| 1.6 主要试剂的配制 |
| 2、实验方法 |
| 2.1 贝牡莪消培养液的配制 |
| 2.2 FRTL-5细胞的培养 |
| 2.3 CCK-8检测细胞增殖 |
| 2.4 实时荧光定量PCR法检测Bcl-2、Bax的mRNA的表达 |
| 2.5 统计学方法 |
| 结果 |
| 1、不同浓度贝牡莪消培养液对FRTL-5细胞增殖OD值比较((?)+s,n=6) |
| 2、RNA的质控 |
| 3、贝牡莪消中药复方对FRTL-5细胞Bax基因mRNA表达的影响 |
| 4、贝牡莪消中药复方对FRTL-5细胞Bcl-2基因mRNA表法的影响 |
| 讨论 |
| 1、贝牡莪消中药复方治疗甲状腺肿的立方依据 |
| 2、贝牡莪消中药复方方药分析 |
| 3、贝牡莪消中药复方现代药理分析 |
| 4、细胞增殖与甲状腺肿 |
| 5、贝牡莪消中药复方甲状腺细胞增殖抑制作用 |
| 6、细胞凋亡与甲状腺肿 |
| 7、贝牡莪消中药复方诱导甲状腺细胞凋亡的作用机制 |
| 8、问题与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 个人简历 |
（8）林兰教授治疗甲亢经验及甲亢宁胶囊调控FRTL-5细胞ERK通路的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 综述一 甲状腺功能亢进症的中医药研究进展 |
| 1 病名研究 |
| 2 病因病机研究 |
| 3 治疗研究 |
| 4 讨论 |
| 综述二 中药调节甲亢细胞增殖与凋亡的作用机制研究进展 |
| 1 GD发病机制与细胞增殖、凋亡的关系 |
| 2 中药对甲亢细胞凋亡的作用 |
| 3 中药对甲亢细胞增殖的作用 |
| 4 中药抑制甲状腺细胞增殖、促其凋亡的作用 |
| 5 讨论 |
| 第二章 林兰教授治疗甲亢的临床经验研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 林兰教授对甲亢病因病机的认识 |
| 4.2 林兰教授对甲亢的辨证论治分析 |
| 4.3 林兰教授治疗甲亢突眼经验 |
| 4.4 林兰教授治疗甲亢肝损害经验 |
| 4.5 林兰教授治疗甲亢伴白细胞减少经验 |
| 4.6 林兰教授治疗甲亢伴月经病经验 |
| 4.7 林兰教授治疗甲亢常用的药对举隅 |
| 4.8 含碘中药的应用 |
| 5 中药甲亢宁胶囊的组方依据 |
| 6 典型病案举隅 |
| 7 本研究的创新点和不足之处 |
| 第三章 甲亢宁调控FRTL-5细胞ERK信号通路的机制研究 |
| 实验一 FRTL-5细胞的培养 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 实验二 甲亢宁的药物敏感试验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 大鼠ERK1/2基因SIRNA片段的设计、合成与筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 实验四 RNAI和过表达效应对各组细胞增殖的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 AV/PI法检测RNAI和过表达效应对各组细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六 RNAI和过表达效应对各组细胞上清C-AMP含量的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 结论 |
| 实验七 RT-QPCR法检测RNAI和过表达效应对各组细胞ERK通路相关因子MRNA表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 SIRNA干扰实验结果 |
| 4 过表达实验结果 |
| 5 讨论 |
| 实验八 WESTERNBLOT法检测干扰和过表达效应对各组细胞ERK通路相关因子蛋白表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 SIRNA干扰实验结果 |
| 4 过表达实验结果 |
| 5 讨论 |
| 实验研究总结 |
| 课题的创新点与局限性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 简历 |
| 附录 |
（9）功能亢进下斜肌IGF-1和AnnexinA1表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 1.1 对象的选择和分组 |
| 1.1.1 实验对象的收集 |
| 1.1.2 标本的收集和保存 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.3 石蜡包埋及切片 |
| 1.4 HE染色步骤 |
| 1.5 免疫组织化学染色 |
| 1.5.1 免疫组织化学染色流程 |
| 1.5.2 对照组 |
| 1.5.3 判断标准 |
| 1.6 图像的采集和分析 |
| 1.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 功能亢进下斜肌形态学改变 |
| 2.2 功能亢进下斜肌IGF-1的表达 |
| 2.3 功能亢进下斜肌AnxA1的表达 |
| 2.4 功能亢进下斜肌IGF-1、AnxA1表达水平与下斜肌功能亢进程度的相关性 |
| 讨论 |
| 3.1 下斜肌功能亢进的判断和分级 |
| 3.2 眼外肌的形态学研究 |
| 3.2.1 正常眼外肌的形态学研究 |
| 3.2.2 斜视患者眼外肌形态学改变 |
| 3.2.3 功能亢进下斜肌的形态学改变 |
| 3.3 肌卫星细胞激活的调节因子IGF-1和AnxA1 |
| 3.4 缺陷与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）薯蓣皂苷元通过激活caspase信号通路诱导IGF-1作用下的人原代甲状腺细胞凋亡（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 薯蓣皂苷元对IGF-1作用下的人原代甲状腺细胞的促凋亡作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 薯蓣皂苷元通过激活caspase信号通路诱导IGF-1作用下的人原代甲状腺细胞凋亡 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点与局限性 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
四、IGF-1 mRNA expression of adult rat thyroid cell cultured in vitro（论文参考文献）
- [1]海藻玉壶汤特定剂量条件下的反药组合加减抗甲状腺肿的作用及机制[D]. 吕艳敏. 北京中医药大学, 2020
- [2]甲状腺相关眼病视网膜血管密度观察及眼眶成纤维细胞中NF-κB抑制剂的治疗作用研究[D]. 汪宇涵. 北京协和医学院, 2020(05)
- [3]转录组学揭示德保矮马体尺矮小的分子遗传机制[D]. 房君. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [4]海藻玉壶汤中加减高剂量甘草及不同品种海藻的药效及机制探讨[D]. 张晨. 北京中医药大学, 2019(07)
- [5]孕哺期大鼠母体邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯暴露影响子代小脑颗粒细胞增殖与凋亡的机制研究[D]. 符园园. 中国医科大学, 2019
- [6]中药甲亢宁胶囊干预Graves病细胞增殖的自噬机制研究[D]. 郑慧娟. 中国中医科学院, 2018(01)
- [7]贝牡莪消中药复方对FRTL-5细胞增殖与凋亡影响的实验研究[D]. 李楠. 黑龙江中医药大学, 2017(07)
- [8]林兰教授治疗甲亢经验及甲亢宁胶囊调控FRTL-5细胞ERK通路的机制研究[D]. 王秋虹. 中国中医科学院, 2016(01)
- [9]功能亢进下斜肌IGF-1和AnnexinA1表达的研究[D]. 付令利. 天津医科大学, 2014(01)
- [10]薯蓣皂苷元通过激活caspase信号通路诱导IGF-1作用下的人原代甲状腺细胞凋亡[D]. 牟淑敏. 山东大学, 2012(12)
标签：甲状腺论文; igf-1论文; 海藻玉壶汤论文; 甲状腺弥漫性病变论文; 细胞增殖论文;