一、检测NDV特异性IgG、IgM、IgA的间接ELISA方法的建立（论文文献综述）
林宝钗,付萍,李天成,刘曹毅,高阳,刘鱼[1]（2021）在《人戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体ELISA检测方法的建立与初步应用》文中研究表明目的建立用于检测戊型肝炎病毒（HEV）IgG、IgM及IgA抗体的间接ELISA方法。方法用重组HEV杆状病毒感染Tn-5细胞表达HEV病毒样颗粒（VLP）,用作包被抗原,建立间接ELISA检测方法,进行方法学评估,分析云南省西双版纳地区献血者HEV抗体流行率。结果收集纯化的VLP能具有HEV抗原性。西双版纳州献血人群抗-HEV IgG、IgM和IgA阳性率分别为18%（90/500）、5.6%（28/500）和2.6%（13/500）,HEV近期感染率为1.8%（9/500）,戊型肝炎血清流行率为19.8%（99/500）。13例抗-HEV IgA阳性标本中,有2例抗-HEV IgG和IgM双阴性。结论云南省西双版纳自治州献血者HEV抗体流行率较高,部分献血者为近期感染,对输血安全可能构成威胁。HEV IgA抗体间接ELISA方法联合HEV IgM抗体检测,能提高HEV近期感染者检出率。
林宝钗[2]（2021）在《戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体ELISA检测方法的建立与初步应用》文中认为目的建立HEV IgG抗体、IgM、IgA间接ELISA检测方法。评估所建立的HEV IgG抗体、IgM、IgA间接ELISA检测方法,并进行评估,检测西双版纳自治州献血者戊型肝炎病毒感染情况,初步探讨HEV IgA抗体检测在HEV筛查中的作用。方法培养Tn-5细胞培养并对其进行血清驯化,感染重组HEV杆状病毒,提取纯化HEV VLP（virus-like particles,病毒样颗粒）,并用 SDS-PAGE 和 Western-blot 进行验证。收集云南地区2364份献血者全血样本,离心后放-80℃保存;运用文献报道的方法及万泰HEV抗体试剂盒联合检测1864份献血者样本,分别筛选出HEV IgG抗体、IgM、IgA阴性和阳性样本,用于后续ELISA检测方法建立。优化间接ELISA方法的各项反应条件,建立戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体间接ELISA检测方法并进行性能评估。用本文建立的方法检测云南西双版纳自治州500份献血者血浆样本,统计HEV IgG抗体、HEV IgM抗体、HEV IgA抗体阳性率,计算HEV近期感染率（HEV IgM抗体/IgA任一阳性）和HEV血清流行率（HEV IgG抗体/IgM/IgA任一阳性）,初步评估HEV IgA抗体在HEV筛查中的作用。结果Tn-5细胞在无血清培养基中能良好繁殖,培养液中能检测出HEV VLP,经纯化后无杂蛋白,浓度为3.95mg/mL。建立的戊型肝炎病毒IgG及IgM抗体间接ELISA方法特异性和灵敏度均为100%,而戊型肝炎病毒IgA抗体间接ELISA方法特异性为95%,灵敏度为100%。在HEV IgG抗体、IgM和IgA检测时加入抗HCV、抗HIV、抗TP、抗HSV-2、HBsAb、HBeAb、HBcAb,脂血,溶血以及ALT后,样本阴阳性不被改变,且0D值变化无统计学差异（P>0.05）;批内及批间重复变异系数均<10%。本文建立的间接HEV抗体ELISA检测测得云南省西双版纳州献血人群HEV IgG抗体、IgM和IgA阳性率分别为 18%（90/500）、5.6%（28/500）和 2.6%（13/500）,HEV 近期感染率为 1.8%（9/500）,HEV血清流行率为19.8%（99/500）。如果仅以HEV IgM抗体单阳为HEV近期感染的判断标准,500例献血者里有7例近期感染,但如果联合HEV IgA抗体（IgG阴性且IgM/IgA任一阳性）作为HEV近期感染的判断标准,500例献血者里则有9例近期感染。在500例献血者样本中,有13例HEV IgA抗体阳性样本,其中2例HEV IgG抗体阴性,10例.HEV IgM抗体阴性,2例HEV IgG抗体和IgM双阴性。本文方法和万泰试剂盒对献血人群HEV IgG抗体检测结果的符合率为84.57%;对HEV IgM抗体检测结果符合率为96.28%,一致性均较好;本文方法和文献方法对献血人群HEV IgA抗体检测结果符合率为95.21%。结论本文使用昆虫杆状病毒表达系统表达HEV ORF2（Open Reading Frame 2,开放阅读框）区重组蛋白（aa112-608）作为包被抗原,建立了戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体间接ELISA检测方法,可分别用于检测人HEV IgG抗体、人HEV IgM抗体和人HEV IgA抗体。建立的三种HEV抗体间接ELISA方法与其他病原体抗体阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性,能抵抗脂血、溶血、高浓度ALT对检测结果的干扰。云南省西双版纳自治州献血者HEV抗体流行率较高,部分献血者为近期感染,对输血安全可能构成威胁。HEV IgA抗体间接ELISA方法联合HEV IgM抗体检测,能提高HEV近期感染者检出率,对HEV感染的临床诊断和流行病学筛查与防治十分重要,但后续仍需收集HEV急性感染确诊者的样本,进行临床验证。
孙兰[3]（2020）在《H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用》文中进行了进一步梳理H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）自首次分离至今,已在全世界各地造成了广泛的传播。在国内,H9N2亚型AIV呈地方性流行且传播范围广,不但给养殖业造成巨大的经济损失,也给公共卫生安全造成潜在的威胁。在免疫压力和抗原漂移作用下,AIV容易发生抗原变异,最终导致免疫失败。因此研发针对H9N2亚型AIV较为理想的单抗对H9亚型AIV监测和诊断有重要的意义。1.H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达选取 H9N2 AIV 流行株 A/Chicken/Taixing/10/2010（简称 rTX）和疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98（简称F98）作为研究对象,通过PCR分别扩增其HA基因和NP基因,将其克隆到真核表达载体PCAGGS上,成功构建出重组质粒PCAGGS-rTX-HA、PCAGGS-F98-HA 和 PCAGGS-rTX-NP。然后将其转染入 293T 细胞,通过间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和蛋白印迹试验（Western blot,WB）检测确定HA和NP蛋白均在体外正确表达,成功制备出用于制备单克隆抗体的免疫原。此外,通过将PCAGGS-rTX-NP进行双酶切获得的NP片段连接pET-32a上,构建原核重组质粒pET32a-rTX-NP,利用Roestta（DE3）进行优化表达,获得分子量约为73 KD的可溶性rNP,以作为下一步制备针对rTX毒株NP蛋白单克隆抗体的筛选原。2.H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用将重组质粒PCAGGS-rTX-HA和PCAGGS-F98-HA通过肌肉注射结合基因导入仪刺激的方式免疫6-8周龄BALB/c小鼠,三免后腹腔注射灭活病毒进行加强免疫,3天后取其脾细胞制备杂交瘤细胞。通过血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验和IFA对融合孔进行筛选,经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,其中有4株为针对rTX HA蛋白的单抗,分别命名为1B9、1C10、3E2和2D6;有2株为针对F98 HA蛋白的单抗,分别命名为1B2和1F10。抗体亚类鉴定结果显示,1B9、1C10和3E2的亚类均为IgM,2D6的亚类为IgG2a,1B2和1F10的亚类为IgG1;6株单抗腹水HI效价较高,均在210-215之间;IFA检测结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98产生特异性荧光,其余的单抗对毒株rTX产生特异性荧光;Western-blot试验结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98有特异性反应,其余的单抗都对毒株rTX有特异性反应,条带大小均为75KD;中和试验结果显示,单抗2D6、1B2和1F10都具有中和特性,其中1F10的中和效价最高;单抗特异性和广谱性鉴定结果显示,6株抗HA蛋白单抗只与H9亚型AIV有反应,而与其他亚型AIV和NDV无反应性,表明具有良好的特异性,其中有4株单抗对H9N2 AIV的反应谱较好;6株单抗对2017-2019年实验室分离株HI和IFA检测结果显示,有37.1%（10/27）的H9N2 AIV分离株与4株抗Y280-like代表株HA蛋白的单抗所识别的表位存在抗原差异性,有22.26%（6/27）的H9N2 AIV分离株获得了与抗F98毒株HA蛋白单抗识别表位类似的抗原位点。因此,这些单抗可用于流行株的抗原差异性分析,且近3年的流行株已发生了较大的抗原变异。3.H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备和鉴定将重组质粒PCAGGS-rTX-NP免疫小鼠进行单克隆抗体的制备。细胞融合10 d后,通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和EFA筛选阳性杂交瘤细胞。经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,分别命名为1B4、1E50、2E10、3A9、8F10和3E6。抗体亚类鉴定结果显示,2E10、3A9和1B4的亚类均为IgG2a,1E50的亚类为IgG1,3E6和8F10的亚类为IgM;采用ELISA试验对单抗腹水效价进行检测,效价在1:25600-1:204800之间;IFA试验结果表明6株单抗中只有3E6和8F10与rTX毒株有特异性的荧光反应;特异性试验结果表明单抗3E6、8F10、2E10和1B4这4株单抗不与NDV和IBV发生反应,具有良好的的特异性,单抗3A9和1E50的特异性不佳;广谱性鉴定结果表明单抗3E6、8F10和2E10的广谱性较好,除了不与H5N1亚型发生反应,与H9N2、H5N6和H7亚型的AIV都有很好的反应,而单抗1B4、3A9和1E50广谱性较差,只与部分H9N2亚型AIV和毒株W1-8（H7亚型）反应。综上所述,单抗3E6、8F10和2E10综合特性较好,在AIV流行病学调查等方面有一定的应用价值。
徐晓婷[4]（2020）在《小鹅瘟病毒流行病学调查及夹心ELISA检测方法的建立》文中进行了进一步梳理鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）感染又称为小鹅瘟,自1956年在江苏扬州被首次发现以来,该病对鹅、鸭等水禽养殖业造成严重危害。2015年,在我国北方地区的樱桃谷鸭首次分离到一种独特的GPV相关病毒,即新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus,NGPV）,与早期分离的经典GPV相比,宿主被NGPV感染后具有发病率高、死亡率低的特点。近年来,GPV广泛流行且病毒不断发生变异,与番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）等水禽细小病毒混合感染后发生的基因重组,如番鸭小鹅瘟病毒（Muscovy duck goose parvovirus,MDGPV）、鸭源鹅细小病毒（Duck goose parvovirus,DGPV）等多个流行分支。因此,掌握GPV的流行情况并建立合适的检测方法,对于小鹅瘟的防控具有重要意义。1小鹅瘟病毒流行病学调查及VP基因遗传进化分析2017～2019年,在江苏、安徽、广东及山东等省采集疑似GPV感染的水禽组织病料50份。经鹅胚进行病毒分离并通过PCR鉴定,成功获得了 14株GPV,包括11株经典GPV、2株MDGPV及1株NGPV。从宿主分布上看,经典GPV均分离自雏鹅;MDGPV均为番鸭来源,NGPV分离自雏鸭。从季节分布上看,GPV在春季和冬季呈现较高的分离率。14株GPVVP基因扩增后进行测序分析,并对结构蛋白VP1、VP2、VP3进行了分子进化与系统发生分析。结果显示,14株分离株在VP1、VP2、VP3基因进化树中均属于GPV分支,但又均呈现按宿主、地域差异分布于不同的亚分支,具有一定的遗传多样性。其中,江苏扬州及安徽地区的分离株均属于经典GPV亚分支,而2株广东分离株X1和X2属于MDGPV亚分支,1株山东分离株X7则属于NGPV亚分支。通过RDP4重组分析软件,X1和X2 GPV分离株在VP基因检测到重组事件,均以GPV-Yan-2为主要亲本,以MDPV-89384为次要亲本,均在VP基因1-702bp和1833-2199bp存在重组现象,GPV-Yan-2为中国经典GPV毒株,MDPV-89384是法国经典MDPV毒株,证实VP基因簇内的基因重组,对中国大陆GPV和MDPV株系VP基因的遗传多样性了解提供依据。2小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立从经典GPV、MDGPV、NGPV进化分支中各选取1株代表性分离株,纯化后免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,筛选出7株抗GPV的杂交瘤细胞,分别命名为 1H3、1D4、2C8、3G10、2F11、6F12、6H3,抗体亚类依次为 IgG2α、IgG2α、IgG2α、IgG2b、IgG2b、IgG2b、IgG2b。将杆状病毒表达的VP3抗原免疫进行浓缩纯化经甲醛灭活后免疫小鼠,筛选出4株抗GPVVP3的杂交瘤细胞分别命名为 1A5、1H5、4H5 及 5C7,抗体亚类依次为 IgM、IgM、IgM、IgG1。1H3 和5C7与GPV尿囊液western-blot上有阳性条带。选取效价高、稳定性好的2F11株和5C7株单抗,经ProteinG亲和层析柱纯化后浓度分别为1.2mg/ml和6mg/ml。以2F11作为捕获抗体,用兔抗GPV阳性血清作为检测抗体,建立了用于检测GPV抗原的夹心ELISA方法。以5C7作为捕获抗体,加入定量抗原后,再加入待检血清,建立了检测GPV抗体的夹心ELISA方法,本研究所建立的夹心ELISA方法阴性对照样品的OD值更低,显示出了更好的特异性。综上,本研究成功分离获得14株GPV,分属于经典GPV、MDGPV和NGPV进化分支;制备了 11株针对GPV的单抗,并分别建立了检测GPV抗原和VP3抗体的夹心ELISA方法,灵敏度高。
王迎迎[5]（2020）在《严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染患者抗体特征及检测方法研究》文中研究说明2020年1月30日,世界卫生组织宣布严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染引起的 2019 年冠状病毒疾病（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）成为继甲型 H1N1 流感（2009）、脊髓灰质炎（2014）、西非埃博拉病毒（2014）、寨卡病毒（2016）和刚果民主共和国埃博拉病毒（2019）之后第六次国际关注的突发公共卫生事件,严重威胁全球公共卫生安全,截至2020年6月1日已造成6,057,853人感染,导致371,166人死亡。SARS-CoV-2是一种有包膜的单股正链RNA病毒,属于β冠状病毒属。目前COVID-19 的诊断主要使用基于 RT-PCR 的方法或深度测序检测病毒基因组,但是这些检测方法依赖于采样部位存在足够数量的病毒基因组,错过病毒复制的窗口期可能造成假阴性,使得受感染的患者存在传播病毒的可能。提高检出率是提高疫情防控能力的关键。开发更快、更方便、与核酸检测互补的检测方法就尤为重要。血清学检测方法是病原检测的重要工具,因此构建检测SARS-CoV-2抗体或抗原的检测方法成为重要选择。目前对SARS-CoV-2体液反应的程度和时间动力学尚不清楚,虽然IgM抗体检测已用在COVID-19的诊断中,但IgM抗体检测的应用价值,与PCR相结合是否提高检测灵敏度和准确性,仍需进一步研究。病毒抗原是病毒的特异性标记,先于抗体在感染患者体内出现,可以达到早诊断的目的,但目前缺乏对于SARS-CoV-2抗原检测方法的研究。据此,我们建立了基于间接酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA）方法的抗体检测体系,该方法方法具有实验周期短、操作简单和价格便宜等优点,根据包被蛋白种类,可以检测抗体还可以检测抗原。在建立抗原检测体系上,我们采用了双抗体夹心ELISA方法,该方法已经应用在多种病毒抗原的检测中。首先利用原核表达系统表达SARS-CoV-2核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）并进行纯化,利用N蛋白构建了间接ELISA检测方法,分析了来自武汉、北京等地疑似和确诊病例抗体组成和特征。共检测了从82例确诊病例和58例疑似病例中收集的208份血浆样本。结果显示IgM和IgA抗体检测的中位时间为5天（IQR3-6）,而症状发生后14天（IQR 10-18）可检测到IgG,阳性率分别为85.4%,92.7%和77.9%。在确诊和疑似病例中,IgM抗体的阳性率分别为75.6%和93.1%。症状发生5.5天后,IgM ELISA的检测效率高于qPCR方法。将IgM ELISA检测与qPCR方法结合使用时,每位患者的阳性检出率显着提高（98.6%）,仅使用qPCR方法阳性检出率为51.9%。基于以上实验结果可证明SARS-CoV-2的体液免疫反应可用于COVID-19的诊断,与qPCR方法结合使用后可显着提高检出率。随后研究了双抗体夹心ELISA检测SARS-CoV-2N蛋白的方法,该方法的关键点是找到抗SARS-CoV-2的特异性单克隆抗体。通过前期发现SARS-CoV-2和SARS-CoV N蛋白氨基酸相似性为90.5%,且具有高度相似的抗原性,因此我们猜测抗SARS-CoVN单克隆抗体可与SARS-CoV-2N蛋白反应。基于课题组既往研究基础,复苏基于SARS-CoV N蛋白构建的杂交瘤细胞,筛选出了两株可与SARS-CoV-2N蛋白反应的单克隆抗体A1和A2,A1与SARS-CoV-2N蛋白反应性更强。以抗SARS-CoV-2N蛋白多克隆抗体、A1和辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）标记的抗鼠IgG抗体建立了双抗体夹心ELISA方法,利用SARS-CoV-2N蛋白和SARS-CoV-2病毒培养物作为模拟抗原来确定灵敏度,在未灭活条件下SARS-CoV-2N蛋白为0.1ng/μL时仍可检出,病毒培养物的最低检出量为20PFU。用双抗体夹心ELISA检测其他冠状病毒N蛋白、病毒培养物和咽拭子发现,此方法具有较高的特异性。对收集自不同发病时间的SARS-CoV-2感染患者的咽拭子、肛拭子和唾液样本进行抗原检测,发现此方法适用于对咽拭子样本的检测。双抗体夹心ELISA方法的灵敏度仍需进一步优化以提高阳性检出率。综上所述,本研究描述了感染SARS-CoV-2后宿主体液免疫的程度及时间动力学,且在208份血浆样本中证明将IgMELISA检测与qPCR方法结合使用显着提高阳性检出率。构建了双抗体夹心ELISA检测SARS-CoV-2N蛋白的方法,具有潜在的应用价值。
宋丽[6]（2020）在《沙门菌鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应及其机制研究》文中认为2013年3月,中国出现首例人感染新型H7N9禽流感病毒的病例,至今引起了五波流行,共导致1567人感染,死亡率接近40%。在第五波流行中爆发的H7N9高致病性禽流感病毒,对中国家禽贸易和活禽市场构成严重威胁;同时感染人数也急剧增加,感染范围进一步扩大,引起了国内外广泛关注,这些病毒是最有可能导致下一次流感大流行的亚型。因此,针对H7N9禽流感开发一种安全有效的疫苗非常重要。与传统疫苗相比,亚单位疫苗具有更高的安全性,能减少疫苗生产时间。但是,亚单位疫苗的免疫原性较弱,需要添加佐剂来增强其免疫原性。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是细胞表面能够识别病原相关分子模式的一种受体家族,在天然免疫系统中发挥重要作用。鞭毛蛋白是一种TLR5配体,其佐剂活性不断在多种病原上得到验证,但其作为H7N9禽流感亚单位疫苗佐剂,能否诱导抗原特异性细胞免疫应答尚不完全清楚,而细胞免疫对于预防流感病毒这类胞内感染的病原亦十分重要。由于哺乳动物和家禽免疫系统的差异,鞭毛蛋白在家禽流感疫苗中的作用和机制,例如将鞭毛蛋白与抗原融合后,如何激活家禽天然免疫系统,诱导何种免疫应答类型偏向（Th1或Th2）,在家禽中能否诱导黏膜免疫应答,是否能促进抗原诱导的免疫保护效应等尚不完全清楚。鞭毛蛋白是一种强效的佐剂候选,但是它自身的抗原性很强,可能影响其佐剂活性;而且高剂量的鞭毛蛋白可诱导潜在的炎性损伤,引发一些副反应,可能限制其临床应用。因此,减弱鞭毛蛋白的副反应,并维持其佐剂活性,开发具有调节免疫功能的改良型鞭毛蛋白佐剂,应作为人用疫苗佐剂重点研究的方向,这也是一项重要的挑战。鞭毛蛋白发挥佐剂作用的分子机制,一是通过与细胞表面TLR5受体结合,激活MyD88依赖的通路,促进多种细胞因子表达;二是与细胞质中NLRC4受体结合,激活炎性小体,促进炎性因子的表达和分泌;从而激活免疫细胞和非免疫细胞。巨噬细胞是天然免疫系统的吞噬细胞,位于各种组织中,是生物体抗感染的第一道防线。转录组测序（RNA-Seq）是通过高通量测序平台,快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下几乎所有的转录本和基因序列,可从整体水平上反映出细胞中基因的表达情况及其调控规律,因此可作为研究鞭毛蛋白与巨噬细胞相互作用的重要手段,以期补充和完善其激活天然免疫应答的分子机制。1.小鼠模型中鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应本研究以H7N9禽流感亚单位疫苗血凝素（Hemagghutinin,HA）球状部HA1-2抗原为对照,评价其与沙门菌鞭毛蛋白（FliC）的融合蛋白HA1-2-FliC在体内外的佐剂活性。体外细胞实验结果显示,与HA1-2组相比,HA1-2-FliC刺激C3H/HeJ小鼠的BMDCs和脾脏淋巴细胞后,能显着上调细胞因子和趋化因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、CXCL2和CXCL10）的表达水平,表明鞭毛蛋白能促进小鼠免疫细胞的活化。通过腹腔免疫C3H/HeJ小鼠,研究鞭毛蛋白对H7N9禽流感HA1-2亚单位疫苗免疫原性的影响。结果显示,二免后12 d,相比于单独HA1-2免疫组,HA1-2-FliC可显着提高HA1-2特异性IgG和血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）抗体水平。同时,HA1-2-FliC诱导的IgG亚型（IgG1和IgG2a）水平均显着提高;ELISpot结果显示脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ和IL-4的细胞数量相当,均显着高于HA1-2组,这些结果表明HA1-2-FliC可诱导Th1/Th2混合型免疫应答。此外,HA1-2-FliC免疫组小鼠脾脏中T细胞表面CD69分子表达量显着增加,细胞增殖水平显着提高,进一步表明HA1-2-FliC能有效地诱导抗原特异性细胞免疫应答。综上所述,本研究结果表明候选疫苗HA1-2-FliC能够有效促进小鼠免疫细胞的活化,诱导高效的HA1-2特异性体液和细胞免疫应答,为研制H7N9禽流感病毒重组亚单位疫苗提供了重要的基础。2.家禽模型中鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应本研究在体外和离体条件下,检测了鞭毛蛋白作用不同类型禽免疫细胞后诱导的细胞因子和趋化因子的表达谱。结果显示,鞭毛蛋白刺激禽巨噬细胞系HD11后,显着提高了 CXCL炎性趋化因子（CXCLi1和CXCLi2）和CCL趋化因子（MIP-1β和MCP-3）的表达水平。此外,融合蛋白HA1-2-FliC体外刺激SPF鸡脾脏淋巴细胞和外周血单核细胞（PBMCs）后,显着上调细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18和IFN-γ）和趋化因子（CXCLi1、CXCLi2和MIP-1β）的表达,表明鞭毛蛋白能在体外激活禽细胞的免疫应答。本研究还评估了 HA1-2-FliC免疫SPF鸡后诱导的抗原特异性体液和细胞免疫应答,结果显示,肌肉注射HA1-2-FliC候选疫苗,可显着提高血清中HA1-2特异性IgG水平。此外,CD4+和CD8+T细胞显着增加,PBMCs增殖能力的显着提高均反映了HA1-2-FliC可诱导鸡体产生强效的细胞免疫应答。接种HA1-2-FliC后,鸡PBMCs中IFN-γ和IL-4的表达量均显着提高,表明鞭毛蛋白FliC在鸡模型中也可促进了Th1/Th2混合型免疫应答。通过鼻腔内免疫SPF鸡,评价鞭毛蛋白作为H7N9禽流感亚单位疫苗的黏膜佐剂,在鸡模型中诱导的免疫保护效应。结果显示,免疫HA1-2-FliC候选疫苗后,显着提高了血清中HA1-2特异性IgG,鼻腔和支气管肺泡灌洗液中HA1-2特异性IgA水平。此外,攻毒结果显示,与HA1-2免疫组相比,添加FliC佐剂能显着降低鸡喉头和泄殖腔中的病毒载量,提高机体清除病毒的能力。综上所述,鞭毛蛋白在体内和体外均能活化禽免疫细胞,促进多种细胞因子和趋化因子的表达;通过肌注和滴鼻免疫SPF鸡,HA1-2-FliC均能显着增强流感亚单位疫苗HA1-2的免疫原性和免疫保护效应,这些发现为在家禽中开发H7N9禽流感HA1-2亚单位疫苗提供了依据。3.改良型鞭毛蛋白FliCΔD2D3在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应本研究构建了一种改良的鞭毛蛋白佐剂FliCΔD2D3（缺失与鞭毛蛋白抗原性相关的高变区D2和D3）,将H7N9禽流感病毒HA1-2抗原融合到FliCΔD2D3的N端,得到改良型H7N9禽流感亚单位疫苗候选HA1-2-FliCΔD2D3。原核系统表达的HA1-2-FliCΔD2D3免疫反应性良好,保留了 TLR5配体活性,可以在体外和离体条件下激活小鼠巨噬细胞、脾脏和外周血单核淋巴细胞,促进各种细胞因子和趋化因子的表达。将 HA1-2、HA1-2-FliC 和 HA1-2-FliCΔD2D3 蛋白腹腔免疫 BALB/c 小鼠,在免疫早期,HA1-2-FliCΔD2D3 诱导产生炎性细胞因子（IL-6、IL-12p40、TNF-α 和 IL-23p19）的水平均显着低于HA1-2-FliC组。二免后12 d,与HA1-2-FliC组相比,HA1-2-FliCΔD2D3组显着降低了血清中鞭毛蛋白自身特异性抗体水平,但并不影响HA1-2特异性抗体和细胞免疫应答水平。IFN-γ/IL-4表达水平表明FliCΔD2D3仍可促进Th1/Th2混合型免疫应答。SPF鸡免疫和攻毒保护实验结果显示,添加FliCΔD2D3佐剂的疫苗比单独HA1-2疫苗诱导更高水平的抗体应答,与FliC佐剂组一致,均能显着减少鸡喉头和泄殖腔中病毒载量。综上所述,本研究构建的改良型H7N9禽流感候选亚单位疫苗HA1-2-FliCΔD2D3显着降低FliC的免疫原性,减弱由其引起的全身性炎性反应,但不影响其佐剂活性。改良后的鞭毛蛋白佐剂FliCΔD2D3为开发更安全有效的人用流感亚单位疫苗提供了基础。4.鞭毛蛋白诱导细胞表达IFN-β的初步探究本研究利用转录组测序（RNA-seq）技术对鞭毛蛋白刺激的RAW264.7细胞基因表达水平进行分析。测序结果显示,共筛选出2204个显着差异表达基因,其中上调表达基因1114个,下调表达基因1090个。KEGG Pathway分析中,富集到免疫相关途径的显着差异表达基因数量最多。GO功能分析中,生物过程分布的显着差异基因主要集中在代谢、正向调控、免疫、防御和应答等过程。其中,值得注意的是,鞭毛蛋白刺激RAW264.7细胞后,涉及多条通路的IFN-β基因显着上调表达。通过qRT-PCR和ELISA方法验证了 RNA-seq结果,发现鞭毛蛋白不仅可以刺激RAW264.7细胞,也可以刺激小鼠BMMs和BMDCs细胞上调表达IFN-β。为了进一步排除鞭毛蛋白FliC提取过程中其它因素对实验的影响,本研究在刺激RAW264.7细胞时,设置同步提取的FliC-FljB-和FliC+Trypsin组作为对照,结果显示,FliC-FljB-和Trypsin+FliC组均不能促进IFN-β上调表达,进一步证明了 FliC本身具有诱导细胞上调表达IFN-β的能力。根据鞭毛蛋白的结构特征,本研究构建并表达His标签融合蛋白FliC、N-FliC、C-FliC和FliCΔD2D3。结果显示,原核表达的全长FliC及其不同结构域片段均具有良好的免疫反应性,其中FliC和FliCΔD2D3具有良好的TLR5配体活性,与预期一致。用不同结构域鞭毛蛋白刺激RAW264.7细胞后,FliC、C-FliC和FliCΔD2D3蛋白均能显着提高IL-1β和IFN-β上调表达;而N-FliC与阴性对照一致,表明鞭毛蛋白刺激RAW264.7细胞上调表达IFN-β的关键结构域是与IL-1β一致,均是C-FliC。这些发现为鞭毛蛋白佐剂机制的进一步研究提供了新的科学线索。
王艳春[7]（2020）在《猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点杆状病毒表达及初步应用》文中研究指明猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是一种肠道冠状病毒,在世界范围内引起猪群的高发病率和高死亡率,侵害肠道和呼吸道,主要的症状表现为呕吐、严重腹泻、脱水,对养猪场造成重大经济损失,要控制该病的发生与流行,必须要有相应的诊断技术及疫苗免疫接种。S蛋白是TGEV的保护性抗原,有A、B、C、D 4个主要抗原位点,A位点位于TGEV的表面,是体外病毒中和的抗原区域,也是诱导机体产生中和抗体的主要诱导因子,并发挥着关键作用,此位点的缺失可导致S蛋白不能产生中和抗体,因此该位点为研究的主要对象。本研究针对TGEV S基因A位点（简写为Sa,下同）,构建了重组杆状病毒表达载体并成功表达了融合蛋白rBacmid-TGEV-Sa,制备了针对rBacmid-TGEV-Sa融合蛋白的单克隆抗体,并将rBacmid-TGEV-Sa融合蛋白作为包被抗原,建立了 TGEV抗体的ELISA诊断方法。具体研究内容如下:1表达猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点重组杆状病毒的构建与鉴定本研究使用实验室保存的猪传染性胃肠炎病毒TZ-10-2016为模板,根据猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列,参考王仙等研究设计并合成一对特异性引物,使用RT-PCR方法扩增出Sa基因序列,将TGEV-Sa基因克隆至pFast-bac-HTA杆状病毒表达载体中,再在DH1OBac感受态细胞中转座,通过蓝白斑筛选并进行三次纯化,最后得到了阳性重组穿梭载体质粒,然后质粒在脂质体LipofectamineTM 3000介导下,在Sf9昆虫细胞中进行转染,成功获得了重组杆状病毒rBacmid-TGEV-Sa。经过IFA鉴定表明该重组杆状病毒融合蛋白可被抗猪传染性胃肠炎病毒抗体特异性识别为胞浆荧光,SDS-PAGE、Western-blot结果表明获得了大约28 kDa的可溶性重组蛋白,并可被6×His单克隆抗体和猪多抗血清特异性识别,具有良好的反应原性,为应用于抗体筛选和建立血清学检测方法奠定了一定的基础。2猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点单克隆抗体的制备本研究使用的免疫原为第一章中制备的重组杆状病毒rBacmid-TGEV-Sa融合蛋白,免疫6周龄Balb/c小鼠,经过细胞融合后,使用间接免疫荧光（IFA）方法进行筛选方法,经过三次融合,成功获得了 5株能稳定分泌抗TGEV的单克隆抗体,分别命名为 Mab-TGEV-2B1、Mab-TGEV-2D1、Mab-TGEV-4E3、Mab-TGEV-5E3、Mab-TGEV-5G2。经亚类鉴定 Mab-TGEV-2B1、Mab-TGEV-2D1、Mab-TGEV-5G2 亚型为IgG1,其他两株亚型为IgM。经过ELISA、Western-blot验证所得单抗只识别TGEV,不与PEDV、PRoV发生交叉反应。将Mab-TGEV-2B1、Mab-TGEV-2D1两株单抗的腹水利用Protein G柱获得了纯化的抗体,为后续建立TGEV检测方法奠定了基础。3检测猪传染性胃肠炎病毒抗体间接ELISA方法的建立本研究以重组杆状病毒rBacmid-TGEV-Sa细胞病毒悬液经过超声波破碎的上清作为包被抗原,通过对ELISA各个反应条件的筛选,采用P/N值法进行判定,确定抗原浓度为100μg/mL,4℃包被过夜,5%山羊血清封闭2h,血清1:200稀释,37℃水浴孵育60 min,酶标二抗（HRP-羊抗鼠）37℃水浴孵育60 min,显色15min,作为最终的工作条件。检测22份猪阴性血清确定阳性临界值为0.476,阴性临界值为0.422,介于两者之间判定为可疑。通过特异性、敏感性、重复性试验证实本研究建立的ELISA方法特异性较好,和猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒等其他病毒无交叉反应,敏感性良好,批内、批间试验变异系数均小于10%。使用已建立好的间接ELISA方法与商品化ELISA检测试剂盒和IFA方法进行比较,分别对临床送检的96份猪血清进行检测,结果显示,总符合率都为92.7%。说明本研究建立的ELISA方法可应用于临床TGEV感染的检测,也为进一步开发TGEV商品化诊断试剂盒奠定了一定的物质基础。
郭浩然[8]（2019）在《表达禽腺病毒Fiber2基因重组新城疫病毒的拯救及免疫效果评价》文中认为自2015年以来,国内鸡群因禽腺病毒（Fowl adenoviruses,FAdV）感染引起的鸡肝炎-心包积液综合征（Hepatitis and Hydropericardium Syndrome,HHS）的病例呈逐年上升趋势。HHS主要多发于3～5周龄肉鸡,偶尔在10～20周龄蛋鸡中出现,给国内养禽业造成了严重的经济损失。流行病学调查显示,国内鸡群中FAdV的流行毒株主要是高致病性血清4型禽腺病毒（FAdV-4）。国外市场虽然已有部分商品化的FAdV灭活疫苗和弱毒活疫苗,但价格昂贵,难以在国内推广。目前,国内己有多项与FAdV-4相关的疫苗专利申请成功,包括各种灭活苗、基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗,但尚没有针对FAdV-4的商品化疫苗。本研究首先通过反向遗传学操作以改造后致弱的基因Ⅶ型新城疫病毒（NDV）毒株（MG7）为载体（其F蛋白裂解位点从原碱基序列突变为LaSota疫苗株F蛋白的裂解位点）,构建表达FAdV-4 Fiber2抗原基因的重组质粒并进行病毒拯救。接着通过检测鸡胚平均死亡时间（MDT）、1日龄SPF雏鸡颅内接种致病指数（ICPI）和6周龄SPF鸡静脉接种致病指数（IVPI）、鸡胚传代毒株测序验证和在BHK-21细胞上复制水平等方面,对成功拯救的病毒的毒力、遗传稳定性和生长特性等生物学活性进行探讨。同时利用原核表达的Fiber2蛋白作为包被抗原,建立检测FAdV抗体的间接ELISA方法。最后以成功拯救的病毒株、商品化弱毒LaSota疫苗株和亚单位Fiber2蛋白作为疫苗,免疫SPF鸡群并评价其免疫效果。结果显示,成功拯救出以NDV为载体表达FAdV-4 Fiber2抗原基因的重组毒株,命名为 rNDV-Fiber2。rNDV-Fiber2 的 MDT 大于 120 h,ICPI 和 IVPI 均为 0,为弱毒株,在鸡胚中传代无突变发生,且病毒在细胞上的复制水平和亲本毒一致。以Fiber2蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法具备良好的敏感性、特异性和重复性;当血清样品S/P值≥0.20时,判为FAdV抗体阳性,S/P值<0.20时则判为FAdV抗体阴性。免疫SPF鸡群后,rNDV-Fiber2组能诱导机体产生NDV特异性HI抗体、中和抗体及IgA黏膜免疫应答,但未能产生FAdV抗体,且免疫后3 d和5 d的外周血淋巴细胞（PBMCs）中CD8+与CD4+T淋巴细胞亚群比例呈显着上升趋势。免疫3周后以强毒株NDV97进行攻毒,rNDV-Fiber2组和LaSota组保护率均为100%,rNDV-Fiber2组未出现排毒且各脏器均无带毒,LaSota组部分鸡只出现排毒和脏器带毒的情况;以高致病性FAdV-4株进行攻毒,rNDV-Fiber2组保护率为0,出现排毒并呈现心包积液、肝肾肿大等现象,50 μg Fiber2和100 μg Fiber2疫苗组的保护率均为100%,且检测不到FAdV排毒和带毒情况,剖检脏器也无明显病变出现。结果表明,成功拯救出的rNDV-Fiber2与MG7株具有相似的生物学特性,都具备弱毒力特性,且能在后续的传代过程中稳定表达。以Fiber2蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法,检测灵敏性为96%、特异性为100%,且重复性良好,能为后续免疫鸡群FAdV抗体水平的检测提供一种可靠的方法。rNDV-Fiber2能有效诱导机体产生体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫应答,为NDV97的攻毒提供100%保护,且抑制NDV在体内的复制,虽未能诱导产生Fiber2抗体,对FAdV-4的攻毒保护率为0,但100μg和50 μg Fiber2蛋白均能获得100%保护。因此rNDV-Fiber2可否作为防控ND和HHS的基因工程二联苗亟待后期进一步试验研究。
毛赛[9]（2019）在《1型鸭肝炎强毒对成鸭致病、体内分布及免疫发生特性研究》文中指出1型鸭肝炎病毒（Duck Hepatitis A virus type 1,DHAV-1）是引起雏鸭病毒性肝炎的重要病原,对雏鸭致死率高,而对成年鸭感染无明显临床症状,但系统评估其对成年鸭致病性、体内分布及诱导免疫发生特性等数据较为缺乏,围绕这些科学问题开展系列研究,主要结果如下:1 1型鸭肝炎强毒感染诱发成年鸭急性和慢性肝炎DHAV-1强毒感染160日龄成年鸭,无临床症状。qRT-PCR检测血液病毒持续感染196 d,引起病毒血症的发生。DHAV-1感染后2-10 d,肝脏病毒RNA和3D蛋白阳性,病毒快速复制增殖含量达到107.18.18 copies/g;肝脏病理检测结果显示肝细胞嗜酸性变性并有炎性细胞浸润;血清肝功能指标检测显示ALT、AST和Tbil含量升高,具有急性肝炎的特征。肝脏内病毒持续感染252 d,且在10-252 d肝脏纤维组织增生且伴有肝细胞坏死、脂肪变性、空泡形成和大量炎性细胞浸润等病变;感染后140 d AST>ALT,且白蛋白和白球蛋白比持续降低,提示肝功能持续损伤,具有慢性肝炎的特征。血液和肝脏模式识别受体（PRRs）、白介素（ILs）、干扰素（IFNs）、趋化因子CCL等先天免疫相关因子转录水平的相对定量检测结果显示,DHAV-1感染诱导激活了肝脏和血液的先天免疫系统,且显示TLR-7是主要的PRRs,Th2型细胞因子（IL-4）的上调水平高于Th1型因子。血清抗体IgG、IgM和IgA1检测表明,DHAV-1感染诱导成年鸭有效的体液免疫应答,而肝脏T细胞流式分析结果显示DHAV-1感染诱导肝内间断且微弱的T细胞免疫应答。Pearson相关性分析结果显示IgG、IL-6和IFN-γ上调水平与DHAV-1滴度之间存在负相关性（P<0.01）,参与病毒的清除。2 1型鸭肝炎强毒肾脏分布特性与持续性感染的形成qRT-PCR、免疫组化检测结果显示,DHAV-1感染后在肾小球系膜细胞和血管内皮细胞可检测到病毒,且病毒拷贝数在1 d达到峰值（107.39.39 copies/g）;随后,病毒拷贝数下降,病毒逐渐向肾小管转移,在肾小管持续、分散的分布至224 d。免疫组化检测显示DHAV-1的感染导致肾细胞出现一系列病变,但没有检测到中性粒细胞浸润以及参与T细胞免疫应答的CD4+T细胞和CD8+T细胞的募集。相对荧光定量检测显示先天免疫应答被诱导激活,2-6 d可检测到TLR-7及其介导的抗病毒因子、炎性因子和趋化因子的显着转录上调,但MHC-I/MHC-II和CCL19的转录未见明显变化;Pearson相关性分析显示TLR-7和IL-6与DHAV-1间存在负相关性。3 1型鸭肝炎强毒对淋巴器官的组织嗜性qRT-PCR、免疫组化检测显示,淋巴器官是DHAV-1强毒感染重要靶器官,在脾脏、哈氏腺、胸腺和法氏囊检测到病毒RNA、衣壳蛋白和3D蛋白,且持续感染周期长,在224 d依然能检测到病毒。另外,Pearson相关性分析显示,淋巴器官的病毒含量与血液病毒含量间具有显着相关性。免疫相关因子相对转录量的检测显示,淋巴器官的PRRs、IFNs、ILs、MHC、CCL等先天免疫因子被诱导上调,但不同器官之间的免疫应答有明显的差异;趋化T淋巴细胞向外周迁移的CCL21在胸腺持续转录上调,水平高于次级淋巴器官和外周器官。Pearson相关性分析显示IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6与DHAV-1间具有直接负相关性;比较各因子的表达以及病毒的清除差异发现,IFN-γ是最有效的抗DHAV-1因子。4 1型鸭肝炎强毒感染消化系统特点及诱导黏膜免疫感染后0.5 d,胰腺、食管和肠道各段均能检测到病毒;12 d回肠病毒含量达到峰值（107.28.28 copies/g）,直肠在4 d达到峰值（107.71.71 copies/g）,胰腺、食管、十二指肠、空肠和盲肠的病毒含量均在1 d达到峰值,分别是106.77、107.37、106.97、107.10和107.15copies/g。比较肠道各部位病毒含量发现,回肠的病毒含量在感染后10-168 d高于其他部位,在其他感染时期直肠的病毒含量最高。食管的病毒含量居于第二位,胰腺的病毒含量最低且感染周期最短,感染后196 d未检测到病毒。间接ELISA检测到胆汁内产生抗DHAV-1特异性的IgG、IgM和IgA,IgG的最高效价高于IgM和IgA,高滴度的IgG出现在感染后21-56 d,而IgA抗体在1-112 d持续大量产生,是感染周期中的主要抗体;食管和肠道分泌液抗体的检测结果也显示IgA是主要的黏膜免疫抗体。免疫组化检测显示在食管和肠道各部位能检测到IgA+细胞。5 1型鸭肝炎强毒感染生殖系统特点及诱导黏膜免疫DHAV-1强毒感染后0.5 d,在种鸭的卵巢和输卵管各段检测到病毒,病毒含量呈现峰值(107.29和107.82.82 copies/g)的是漏斗部和膨大部;卵巢和子宫的病毒含量在4 d达到峰值(107.28和106.94.94 copies/g);峡部和阴道在感染后1 d达到峰值(106.91和107.14copies/g)。总的看,卵巢病毒含量低于输卵管,但在感染后280 d仍能检测到病毒;阴道病毒含量整体上高于其他部位,并且膨大部和阴道病毒持续感染到280 d,而输卵管其他部位在280 d未检测到病毒。生殖系统的黏膜免疫应答被激活,卵巢和输卵管分泌液内检测到特异性IgG、IgM和IgA抗体,IgG抗体滴度在各部位差异不显着（P>0.05）,IgM滴度在膨大部和阴道分泌液较高,IgA在膨大部分泌液较高且高于IgG和IgM;卵巢和输卵管检测到IgA和IgA+细胞,但不能完全清除病毒,诱发病毒持续性感染。。综上,DHAV-1强毒感染成年鸭无临床症状,致早期（2-10 d）急性肝炎、后转化为慢性肝炎（10-252 d）。病毒在肝脏、肾脏、血液、淋巴器官、消化系统和生殖系统的分布和感染刺激成年鸭先天性和适应性免疫系统激活,诱导干扰素和炎性因子的转录上调,诱导血清特异性抗体产生的能力强,而诱导胆汁、消化道和生殖道分泌液特异性抗体产生和肝、肾T细胞应答的能力弱。肾小管细胞免疫缺失是DHAV-1强毒不能完全被清除、导致持续性感染发生的重要原因。
唐娟[10]（2019）在《鸡细胞免疫应答检测方法的建立及其应用》文中指出细胞免疫应答在疾病控制过程中发挥重要作用,这在小鼠等模式动物中已经得到了确认,但由于缺少相关生物试剂、禽类免疫系统特殊性等因素,家禽中细胞免疫应答的研究受到较大的限制,严重制约了禽病相关疫苗的研发和应用。因此,建立禽类细胞免疫应答检测分析技术将进一步推动禽类相关生物制品的开发和疾病的有效控制。本研究以鸡为动物模型,利用现有的生物材料,建立一套评价鸡细胞免疫应答的分析技术体系,包括T细胞增殖检测方法、鸡T细胞亚群分析技术以及细胞毒性T细胞的杀伤能力测定方法等,为家禽细胞免疫应答的研究提供了新的手段和技术;分别以鸡白痢沙门菌候选疫苗株和鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗免疫雏鸡,利用所建立的细胞免疫技术平台评价上述疫苗诱导的细胞免疫应答特性,为禽病疫苗的研制和改进提供新的思路和指导。1.鸡细胞免疫应答检测方法的建立无菌采集鸡脾脏,制备脾脏单细胞悬液,分离淋巴细胞,以ConA刺激淋巴细胞,利用BrdU ELISA方法建立了鸡T细胞增殖检测技术;利用流式细胞术建立了鸡T细胞亚群分析、T细胞亚群分选和细胞凋亡检测技术;同时利用磁珠标记的抗体建立了鸡CD8+T细胞的磁分选技术。BrdU ELISA检测结果显示,与未刺激组相比,ConA刺激后能够明显地检测到T细胞增殖,且重复性较好。在流式细胞术分析和分选结果中,CD4+和CD8+T细胞亚群分群明显,分选后CD8+T细胞纯度达到97%以上,分选效果明显;通过磁珠分选技术获得的CD8+T细胞纯度可达94%以上,分选速度快,耗时短。此外,Annexin V-FITC/PI双标记法可有效地检测鸡细胞凋亡和死亡情况。以上建立的细胞免疫检测技术,为家禽细胞免疫应答的分析和评价提供了有效技术支撑。2.鸡白痢沙门菌疫苗候选株诱导细胞免疫应答的分析与评价将鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株S06004△spiC以肌肉注射的方式免疫3日龄雏鸡,同时以PBS注射组作为对照,以建立的鸡细胞免疫应答分析技术平台评价S06004AspiC诱导的免疫应答。细胞增殖检测结果显示,与PBS对照组相比,S06004△spiC免疫组淋巴细胞在鸡白痢沙门菌特异性抗原体外刺激后分别在免疫后14 d（P<0.001）和21 d（P<0.01）发生显着增殖。T细胞亚群分析结果显示,免疫后第14、28、35 d,CD8+T细胞亚群比例显着升高。在CTL杀伤实验中,以巨噬细胞为靶细胞,免疫组CTL细胞的杀伤能力明显高于未免疫组（P<0.05）。ELISA检测血清中细胞因子结果显示,血清中IFN-y含量在免疫后第5 d开始均高于对照组。血清抗体测定结果显示,S06004AspiC免疫后第7 d可以检测到IgG抗体,第21 dIgG抗体含量达到最高值。以上结果表明,本研究所建立的鸡细胞免疫应答分析技术平台可用于鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株S06004△spiC诱导细胞免疫应答的评价,S06004△spiC能够诱导较强的细胞免疫应答,为鸡白痢沙门菌疫苗的开发和研制提供了重要数据支撑。3.鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗诱导细胞免疫应答的分析与评价将鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗通过滴鼻滴眼方式免疫3日龄雏鸡,同时设置PBS免疫组作为对照,检测疫苗所诱导的免疫应答特性。与PBS对照组相比,疫苗免疫组在第7、21、28 d时T细胞发生显着增殖;免疫后第28 d,T细胞亚群均发生了显着性变化;以肾细胞为靶细胞,免疫组CTL细胞具有较强的杀伤能力,且高于未免疫组;细胞因子转录水平检测结果表明,免疫组脾脏中各细胞因子的表达量均高于对照组,其中IL-2、IL-4、IL-10的表达量在第14d差异显着。气管灌洗物中IgA抗体水平于免疫后第7 d即可检测到,且在第28 d达到峰值;免疫后第21 d血清中IgG抗体水平显着高于对照组,且第28 d差异最为显着。综上表明,鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗能够诱导较强的鸡细胞免疫应答、体液免疫应答和黏膜免疫应答。本研究利用所建立的鸡细胞免疫应答分析技术对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗诱导细胞免疫进行评价,为该疫苗的使用和改进提供了新的理论依据。
二、检测NDV特异性IgG、IgM、IgA的间接ELISA方法的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、检测NDV特异性IgG、IgM、IgA的间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
（1）人戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体ELISA检测方法的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 血浆标本 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.2.1 试剂 |
| 1.2.2 仪器 |
| 1.3 重组HEV VLP的制备及纯化 |
| 1.4 间接ELISA方法建立 |
| 1.4.1 阳性及阴性标本的筛选 |
| 1.4.2 间接ELISA方法反应条件的确定 |
| 1.4.3 临界值确定 |
| 1.5 间接ELISA方法性能评价 |
| 1.6 HEV抗体间接ELISA检测初步应用 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组HEV VLP纯度及浓度测定 |
| 2.2 间接ELISA方法的建立 |
| 2.3 间接ELISA方法性能评价 |
| 2.4 检测方法比较 |
| 2.5 HEV抗体间接ELISA检测初步应用 |
| 2.6 抗-HEV IgA检测的初步评价 |
| 3 讨论 |
（2）戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体ELISA检测方法的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体ELISA检测方法的建立 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1.样本来源 |
| 2.2.实验试剂 |
| 2.3.实验试剂盒 |
| 2.4.溶液配置 |
| 2.5.实验耗材 |
| 2.6.实验仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1.Tn-5细胞培养及HEV VLP鉴定纯化 |
| 3.1.1.Tn-5昆虫细胞复苏及血清驯化 |
| 3.1.2.Tn-5细胞冻存 |
| 3.1.3.重组HEV VLP表达 |
| 3.1.4.重组HEV VLP验证 |
| 3.1.5.重组HEV杆状病毒收集及验证 |
| 3.1.6.重组HEV VLP纯化及纯度测定 |
| 3.1.7.重组HEV VLP浓度测定 |
| 3.1.8.HEV VLP抗原性验证 |
| 3.2.戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.1.阳性及阴性样本的筛选 |
| 3.2.2.最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 3.2.3.最佳封闭液的种类及条件的确定 |
| 3.2.4.最佳一抗反应条件的确定 |
| 3.2.5.最佳二抗品牌及稀释度的确定 |
| 3.2.6.最佳二抗反应条件的确定 |
| 3.2.7.最佳显色液品牌及反应条件的确定 |
| 3.2.8.临界值确定 |
| 4.结果 |
| 4.1.Tn-5细胞培养及HEV VLP鉴定纯化 |
| 4.1.1.Tn-5昆虫细胞复苏及血清驯化结果 |
| 4.1.2.重组HEV VLP表达结果 |
| 4.1.3.重组HEV杆状病毒的收集与验证 |
| 4.1.4.重组HEV VLP纯化及纯度测定结果 |
| 4.1.5.重组HEV VLP浓度测定结果 |
| 4.1.6.HEV VLP抗原性验证结果 |
| 4.2.间接ELISA方法的建立 |
| 4.2.1.抗原包被浓度和血清最释度 |
| 4.2.2.封闭液的种类及条件 |
| 4.2.3.一抗反应条件 |
| 4.2.4.二抗品牌及稀释度 |
| 4.2.5.二抗反应条件 |
| 4.2.6.显色液品牌及反应条件 |
| 4.2.7.临界值 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体ELISA检测方法的评估与初步应用 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1.样本来源 |
| 2.2.实验试剂 |
| 2.3.实验试剂盒 |
| 2.4.溶液配置 |
| 2.5.实验耗材 |
| 2.6.实验仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1.间接ELISA性能评价 |
| 3.1.1.特异性评估 |
| 3.1.2.灵敏度评估 |
| 3.1.3.重复性评价 |
| 3.1.4.抗干扰性试验 |
| 3.1.5.检测方法比较 |
| 3.1.6.统计学分析 |
| 3.2.间接ELISA检测方法的初步应用 |
| 3.2.1.云南西双版纳地区献血者戊型肝炎病毒抗体检测 |
| 4.结果 |
| 4.1.间接ELISA性能评价 |
| 4.1.1.特异性评估结果 |
| 4.1.2.灵敏度评估结果 |
| 4.1.3.重复性结果 |
| 4.1.4.干扰性试验结果 |
| 4.1.5.检测方法比较 |
| 4.2.间接ELISA检测方法的初步应用 |
| 4.2.1.云南西双版纳地区献血者戊型肝炎病毒抗体检测 |
| 4.2.2.HEV IgA抗体检测的初步应用 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 参考文献 |
| 综述 HEV抗体检测研究进展及献血者中HEV流行特征 |
| 1.前言 |
| 2.HEV结构特征 |
| 3.HEV检测方法及应用 |
| 3.1.核酸检测 |
| 3.2.抗原检测 |
| 3.3.抗体检测 |
| 4.献血者中HEV流行特征及输血传播现状 |
| 5.讨论 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（3）H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: 禽流感病毒及其单克隆抗体制备的研究进展 |
| 1 禽流感病毒的分子生物学特性 |
| 2 H9N2亚型禽流感的流行情况 |
| 3 禽流感主要检测方法 |
| 4 单克隆抗体技术 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（4）小鹅瘟病毒流行病学调查及夹心ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 水禽细小病毒的研究进展 |
| 1. 小鹅瘟病毒的研究进展 |
| 1.1 小鹅瘟病毒流行病学 |
| 1.2 小鹅瘟病毒病原学 |
| 1.3 VP基因遗传进化 |
| 2. 新型小鹅瘟病毒的研究概况 |
| 3. 番鸭细小病毒的研究概况 |
| 4. GPV和MDPV重组之间的的关系 |
| 5. 小鹅瘟病毒的血清学检测方法 |
| 6. 单克隆抗体的研究进展 |
| 7. 血清学检测方法 |
| 7.1 酶联免疫吸附实验 |
| 8. 小鹅瘟病毒的防治 |
| 9. 研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 小鹅瘟病毒流行病学调查及VP基因遗传进化分析 |
| 前言 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株、种胚、抗原与血清 |
| 1.2 病料采集 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 病毒的鉴定 |
| 2.3. 小鹅瘟病毒VP基因遗传进化分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 病毒分离与鉴定 |
| 3.2 VP基因遗传进化分析 |
| 4. VP基因重组分析 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立 |
| 前言 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株、实验动物、细胞株、抗体 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 GPV单克隆抗体的制备 |
| 3.2 针对GPV抗原夹心ELISA方法的建立 |
| 3.3 GPV VP3抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附表1 小鹅瘟病毒分离株背景信息 |
| 附表2 水禽细小病毒参考株背景信息 |
| 致谢 |
（5）严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染患者抗体特征及检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 SARS-CoV-2感染患者抗体特征研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 双抗体夹心ELISA检测SARS-CoV-2方法研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）沙门菌鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述一 H7N9流感疫苗研究进展 |
| 1 临床前阶段H7N9流感疫苗 |
| 2 临床阶段H7N9流感疫苗 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 鞭毛蛋白作为疫苗佐剂的分子机制及应用 |
| 1 鞭毛蛋白的结构特征 |
| 2 鞭毛蛋白佐剂的分子机制 |
| 3 鞭毛蛋白的佐剂活性 |
| 4 基于鞭毛蛋白佐剂疫苗的优点 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 小鼠模型中鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 家禽模型中鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 改良型鞭毛蛋白FliCΔD2D3在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鞭毛蛋白诱导细胞表达IFN-β的初步探究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点杆状病毒表达及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 病原学 |
| 1.1 猪传染性胃肠炎病毒分类地位 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒形态结构 |
| 1.3 TGEV理化特性及体外培养特性 |
| 2 分子生物学特征 |
| 2.1 TGEV基因组结构 |
| 2.2 蛋白结构和功能 |
| 3 流行病学 |
| 4 致病机理和病理变化 |
| 5 免疫保护机理 |
| 6 诊断 |
| 6.1 传统病原学检测 |
| 6.2 免疫学检测 |
| 6.3 分子生物学诊断 |
| 7 预防与治疗 |
| 8 研究目的和意义 |
| 第一章 表达猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点重组杆状病毒的构建与鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要生物材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PCR引物设计 |
| 2.2 PCR扩增TGEV-Sa目的基因与胶回收 |
| 2.3 重组质粒PGEM-T-TGEV-Sa的构建与鉴定 |
| 2.4 重组供体质粒pFastBacHTA-TGEV-Sa的构建和鉴定 |
| 2.5 重组杆状病毒穿梭质粒的构建及鉴定 |
| 2.6 重组杆状病毒rBacmid-TGEV-Sa的制备 |
| 2.7 重组杆状病毒表达的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 TGEV-Sa基因的扩增 |
| 3.2 重组质粒PGEM-T-TGEV-Sa的酶切鉴定 |
| 3.3 重组转移载体的酶切鉴定 |
| 3.4 重组杆状病毒的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第二章 猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点单克隆抗体的制备 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞、病毒和实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 抗猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点单克隆抗体的制备 |
| 2.3 间接免疫荧光(IFA)方法的建立 |
| 2.4 间接免疫荧光(IFA)筛选阳性杂交瘤细胞 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 2.7 腹水的制备及纯化 |
| 2.8 单克隆抗体的生物学特性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 间接免疫荧光(IFA)方法的建立 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3 单克隆抗体的生物学特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 检测猪传染性胃肠炎病毒抗体间接ELISA方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要生物材料和试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 制备ELISA包被抗原 |
| 2.2 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.3 间接ELISA方法的特异性试验 |
| 2.4 间接ELISA方法的敏感性试验 |
| 2.5 间接ELISA方法的重复性试验 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 制备ELISA包被抗原 |
| 3.2 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.3 间接ELISA方法的特异性试验 |
| 3.4 间接ELISA方法的敏感性试验 |
| 3.5 间接ELISA方法的重复性试验 |
| 3.6 临床样品检测 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）表达禽腺病毒Fiber2基因重组新城疫病毒的拯救及免疫效果评价（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略语列表 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、细胞、毒株与血清 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组病毒rNDV-Fiber2的构建及拯救 |
| 1.2.2 rNDV-Fiber2的生物学特性研究 |
| 1.2.3 检测FAdV抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 1.2.4 rNDV-Fiber2对SPF鸡免疫效果的评价 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组病毒rNDV-Fiber2的构建及拯救 |
| 2.1.1 Fiber2目的基因的扩增 |
| 2.1.2 重组NDV基因组全长cDNA的构建 |
| 2.1.3 获救病毒的鉴定 |
| 2.2 rNDV-Fiber2的生物学特性研究 |
| 2.2.1 Western blotting检测Fiber2蛋白的表达 |
| 2.2.2 IFA试验 |
| 2.2.3 Fiber2基因的遗传稳定性 |
| 2.2.4 rNDV-Fiber2在BHK-21细胞上的生长特性 |
| 2.2.5 rNDV-Fiber2的毒力分析 |
| 2.3 检测FAdV抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 2.3.1 Fiber2基因的扩增与重组质粒的构建 |
| 2.3.2 重组质粒pCold-Fiber2表达产物的鉴定 |
| 2.3.3 重组Fiber2蛋白的纯化与检测 |
| 2.3.4 检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 2.3.5 阈值的确定 |
| 2.3.6 交叉反应性试验 |
| 2.3.7 敏感性和特异性检验 |
| 2.3.8 重复性试验 |
| 2.3.9 田间样品检测 |
| 2.4 rNDV-Fiber2对SPF鸡免疫效果的评价 |
| 2.4.1 FAdV-4对SPF鸡的LD_(50)测定 |
| 2.4.2 免疫后鸡外周血T淋巴细胞亚群比例检测 |
| 2.4.3 间接ELISA方法检测SPF鸡血清中Fiber2特异性的抗体 |
| 2.4.4 检测SPF鸡血清中NDV HI抗体水平 |
| 2.4.5 间接ELISA方法检测SPF鸡眼泪中IgA特异性的抗体 |
| 2.4.6 中和试验检测SPF鸡血清中NDV中和抗体 |
| 2.4.7 攻毒后保护率情况 |
| 2.4.8 攻毒后病理解剖图 |
| 2.4.9 攻毒后的鸡体外排毒测定 |
| 2.4.10 攻毒后各脏器带毒情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组病毒rNDV-Fiber2的构建及拯救 |
| 3.2 rNDV-Fiber2的生物学特性研究 |
| 3.3 检测FAdV抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 3.4 rNDV-Fiber2对SPF鸡免疫效果的评价 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）1型鸭肝炎强毒对成鸭致病、体内分布及免疫发生特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 1型鸭肝炎概述 |
| 1.1.1 病毒分类 |
| 1.1.2 病原学和基因组结构 |
| 1.1.3 流行特点 |
| 1.1.4 体内分布特点 |
| 1.1.5 致病特点 |
| 1.1.6 防治措施 |
| 1.2 鸭抗病毒免疫研究概述 |
| 1.2.1 鸭抗病毒先天性免疫 |
| 1.2.2 鸭抗病毒适应性免疫 |
| 1.2.3 DHAV-1 感染诱导鸭免疫应答研究进展 |
| 1.3 选题目的及意义 |
| 第二章 1型鸭肝炎强毒感染诱发成年鸭急性和慢性肝炎 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 试剂与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试验设计 |
| 2.2.2 样品采集和处理 |
| 2.2.3 RNA的提取 |
| 2.2.4 c DNA的制备 |
| 2.2.5 一步法实时荧光定量检测样品DHAV-1 RNA拷贝数 |
| 2.2.6 相对荧光定量检测肝脏和血液免疫相关因子的转录水平 |
| 2.2.7 DHAV-1 诱导血清特异性抗体IgG、IgM和 IgA1 产生规律 |
| 2.2.8 流式细胞术检测肝脏DHAV-1 特异性CD4+和CD8+T 细胞 |
| 2.2.9 组织病理学检测 |
| 2.2.10 免疫组织化学法检测肝脏内DHAV-13D蛋白的分布 |
| 2.2.11 数据统计和分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 DHAV-1 感染成年鸭的临床和剖检症状 |
| 2.3.2 DHAV-1 在肝脏和血液的感染和增殖规律 |
| 2.3.3 DHAV-1 感染诱发急性和慢性肝炎 |
| 2.3.4 DHAV-1 诱导血清特异性Ig G、Ig M和 Ig A1 抗体的产生规律 |
| 2.3.5 DHAV-1 诱导肝脏内特异性T淋巴细胞反应 |
| 2.3.6 DHAV-1 诱导血液和肝脏先天性免疫应答反应 |
| 2.3.7 DHAV-1 与血液和肝脏免疫应答的相互作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 1型鸭肝炎强毒肾脏分布特性与持续性感染的形成 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 试剂与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 样品采集和处理 |
| 3.2.3 RNA的提取 |
| 3.2.4 c DNA的制备 |
| 3.2.5 一步法实时荧光定量检测DHAV-1 RNA拷贝数 |
| 3.2.6 相对荧光定量检测肾脏免疫相关因子的转录水平 |
| 3.2.7 组织病理学检测 |
| 3.2.8 免疫组织化学法检测DHAV-1 在肾脏的分布特点 |
| 3.2.9 免疫组织化学法检测肾脏特异性CD4/CD8+T 细胞的动态分布 |
| 3.2.10 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 DHAV-1 在成年鸭肾脏的感染和分布特点 |
| 3.3.2 DHAV-1 感染引起肾脏的病理损伤 |
| 3.3.3 DHAV-1 诱导肾脏T细胞免疫应答特性 |
| 3.3.4 DHAV-1 诱导肾脏先天性免疫应答反应特性 |
| 3.3.5 DHAV-1 与肾脏免疫相关因子的相互作用关系 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 1型鸭肝炎强毒对淋巴器官的组织嗜性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 试剂与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验设计 |
| 4.2.2 样品采集和处理 |
| 4.2.3 RNA的提取 |
| 4.2.4 c DNA的制备 |
| 4.2.5 实时荧光定量检测DHAV-1 RNA拷贝数 |
| 4.2.6 相对荧光定量检测淋巴器官免疫相关因子的转录水平 |
| 4.2.7 免疫组织化学法检测DHAV-1 在淋巴器官的分布 |
| 4.2.8 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 DHAV-1 在淋巴组织的感染特点 |
| 4.3.2 DHAV-1 诱导模式识别受体的转录变化 |
| 4.3.3 DHAV-1 诱导干扰素的转录变化 |
| 4.3.4 DHAV-1 诱导白介素的转录变化 |
| 4.3.5 DHAV-1 诱导MHC和 BAFF的转录变化 |
| 4.3.6 DHAV-1 诱导趋化因子和β-防御素的转录变化 |
| 4.3.7 DHAV-1 与淋巴器官免疫相关因子的相互作用关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 1型鸭肝炎强毒感染消化系统特点及诱导黏膜免疫 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 病毒 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 试剂与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实验设计 |
| 5.2.2 样品采集和处理 |
| 5.2.3 RNA的提取 |
| 5.2.4 荧光定量检测DHAV-1 RNA拷贝数 |
| 5.2.5 间接ELISA检测胆汁特异性IgG、IgM和 IgA |
| 5.2.6 间接ELISA检测分泌液特异性IgG、IgM和 IgA |
| 5.2.7 免疫组织化学法检测IgA+细胞 |
| 5.2.8 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 DHAV-1 在胰腺、食管和肠道的感染和分布规律 |
| 5.3.2 DHAV-1 诱导胆汁特异性抗体IgG、IgM和 IgA的产生规律 |
| 5.3.3 DHAV-1 诱导食管特异性抗体IgG、IgM和 IgA的分泌规律 |
| 5.3.4 DHAV-1 诱导肠道特异性抗体IgG、IgM和 IgA的分泌规律 |
| 5.3.5 DHAV-1 诱导食管IgA+细胞的分布 |
| 5.3.6 DHAV-1 诱导肠道IgA+细胞的分布 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 1型鸭肝炎强毒感染生殖系统特点及诱导黏膜免疫 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 病毒 |
| 6.1.2 实验动物 |
| 6.1.3 试剂与设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 实验设计 |
| 6.2.2 样品采集和处理 |
| 6.2.3 RNA的提取 |
| 6.2.4 荧光定量检测DHAV-1 RNA拷贝数 |
| 6.2.5 间接ELISA检测生殖系统分泌液特异性IgG、IgM和 IgA |
| 6.2.6 免疫组化法检测生殖道IgA+细胞 |
| 6.2.7 数据分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 DHAV-1 在生殖系统的感染和分布规律 |
| 6.3.2 DHAV-1 诱导生殖系统分泌液特异性IgG的产生 |
| 6.3.3 DHAV-1 诱导生殖系统分泌液特异性IgM的产生 |
| 6.3.4 DHAV-1 诱导生殖系统分泌液特异性IgA的产生 |
| 6.3.5 DHAV-1 诱导生殖道IgA+细胞的分布 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）鸡细胞免疫应答检测方法的建立及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 家禽抗沙门菌免疫应答的研究进展 |
| 1 家禽感染沙门菌的发病机制 |
| 2 沙门菌诱导的固有免疫应答 |
| 3 沙门菌诱导的适应性免疫应答 |
| 3.1 T细胞在免疫应答过程中的作用 |
| 3.2 B细胞在免疫应答过程中的作用 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡细胞免疫应答检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡脾脏淋巴细胞悬液的制备 |
| 2.2 BrdU ELISA法检测T淋巴细胞增殖 |
| 2.3 流式细胞术检测T细胞亚群 |
| 2.4 细胞分选 |
| 2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.6 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 T淋巴细胞增殖检测结果 |
| 3.2 T细胞亚群检测结果 |
| 3.3 脾脏中CD8~+T淋巴细胞流式细胞术分选结果 |
| 3.4 脾脏中CD8~+T淋巴细胞磁珠分选结果 |
| 3.5 细胞凋亡检测结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡白痢沙门菌疫苗候选株诱导细胞免疫应答的分析与评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌株及细胞株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌培养 |
| 2.2 鸡的免疫及采样 |
| 2.3 鸡脾脏淋巴细胞的制备 |
| 2.4 BrdU ELISA法分析脾脏T淋巴细胞增殖 |
| 2.5 流式细胞术分析T细胞亚群的变化 |
| 2.6 CTL活性分析 |
| 2.7 荧光定量PCR检测脾脏中细胞因子的表达 |
| 2.8 血清中IFN-γ含量分析 |
| 2.9 血清中IgG抗体的检测 |
| 2.10 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 T细胞增殖分析结果 |
| 3.2 T细胞亚群分析结果 |
| 3.3 CTL特异性杀伤巨噬细胞分析结果 |
| 3.4 荧光定量PCR检测脾脏中细胞因子分析结果 |
| 3.5 血清中IFN-γ含量分析结果 |
| 3.6 血清中IgG含量分析结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗诱导细胞免疫应答的分析与评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡的免疫与样品采集 |
| 2.2 鸡脾脏淋巴细胞悬液的制备 |
| 2.3 BrdU ELISA法分析脾脏T淋巴细胞的增殖 |
| 2.4 特异性CTL杀伤分析 |
| 2.5 荧光定量PCR检测脾脏细胞中细胞因子的表达 |
| 2.6 流式细胞术分析T细胞亚群 |
| 2.7 气管灌洗液中IgA含量分析 |
| 2.8 血清中IgG抗体分析 |
| 2.9 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 T细胞增殖分析结果 |
| 3.2 T细胞亚群分析结果 |
| 3.3 特异性CTL杀伤分析结果 |
| 3.4 脾脏中细胞因子分析结果 |
| 3.5 气管灌洗液中IgA含量分析结果 |
| 3.6 血清中IgG含量分析结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
四、检测NDV特异性IgG、IgM、IgA的间接ELISA方法的建立（论文参考文献）
- [1]人戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体ELISA检测方法的建立与初步应用[J]. 林宝钗,付萍,李天成,刘曹毅,高阳,刘鱼. 中国输血杂志, 2021(05)
- [2]戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体ELISA检测方法的建立与初步应用[D]. 林宝钗. 北京协和医学院, 2021
- [3]H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用[D]. 孙兰. 扬州大学, 2020(01)
- [4]小鹅瘟病毒流行病学调查及夹心ELISA检测方法的建立[D]. 徐晓婷. 扬州大学, 2020(01)
- [5]严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染患者抗体特征及检测方法研究[D]. 王迎迎. 北京协和医学院, 2020(05)
- [6]沙门菌鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应及其机制研究[D]. 宋丽. 扬州大学, 2020
- [7]猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点杆状病毒表达及初步应用[D]. 王艳春. 扬州大学, 2020
- [8]表达禽腺病毒Fiber2基因重组新城疫病毒的拯救及免疫效果评价[D]. 郭浩然. 安徽农业大学, 2019(05)
- [9]1型鸭肝炎强毒对成鸭致病、体内分布及免疫发生特性研究[D]. 毛赛. 四川农业大学, 2019(07)
- [10]鸡细胞免疫应答检测方法的建立及其应用[D]. 唐娟. 扬州大学, 2019(02)