一、抗弓形虫表膜抗原 P30单克隆抗体的制备与鉴定(英文)（论文文献综述）
薛杨继[1]（2021）在《刚地弓形虫LAMP-LFD检测方法的建立、初步应用及抗弓形虫SAG1纳米抗体的制备、分析》文中研究说明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生原虫,可导致人畜共患病弓形虫病,又称弓体病。弓形虫病呈世界性分布,据报道全球约三分之一的人口血清弓形虫抗体阳性。一项分析显示,我国普通人群弓形虫抗体阳性率为8.20%。普通人感染弓形虫多为自限性,少部分出现亚临床症状,此后长期呈隐匿性感染状态。但免疫抑制患者如肿瘤、艾滋等病人可导致不良预后。孕妇感染后可经胎盘传给婴儿导致先天性弓形虫病,严重者可导致流产、死胎。现我国孕妇优生优育产前TORCH五项检测中已包含弓形虫抗体检测。但弓形虫抗体检测无法准确的判断现状感染情况,为疾病的诊断与干预治疗带来不便。因此,开发具有诊断价值的弓形虫循环DNA和循环抗原（Circulating antigen,CAg）的检测方法显得尤为重要。本研究分别从弓形虫的循环DNA分子检测和循环抗原的免疫检测两部分进行探究。弓形虫的分子检测,主要以B1、529-RE（Repeat element）等多拷贝基因为靶点。其中529-RE在弓形虫基因组中有200-300拷贝数而被认为是最优的检测靶点。新型的环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）可在1小时内将数个拷贝扩增至109,而被认为是一种可替代PCR扩增技术的高效分子扩增检测技术。本研究采用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）和侧流试纸条（Lateral-flow-dipstick）结合,设计成为LAMP-LFD一体化核酸扩增检测装置。LAMP-LFD装置将常规LAMP扩增产物与核酸探针杂交,使分子产物检测转化为胶体金免疫检测,同时具有良好的密闭性而有效避免气溶胶污染,探索一种更为简单、高效、特异的弓形虫分子检测方法。弓形虫的抗原检测,主要以免疫学方法筛选制备特异性抗体检测膜表面抗原等弓形虫中丰都较高的靶标。弓形虫膜表面抗原1（Surface antigen 1,SAG1）在弓形虫速殖子表面高表达,被认为是最有价值的检测靶标之一。本研究中,采用骆驼科动物血清中天然存在的单重链抗体（Heavy chain antibodies,HCAb）的重链可变区,即纳米抗体（Nanobody,Nb）,结合噬菌体展示技术,筛选并制备抗弓形虫SAG1纳米抗体,为弓形虫循环抗原检测方法的建立奠定基础。目的1.建立弓形虫LAMP-LFD分子检测方法,采用LAMP-LFD方法对浙江省五座城市流浪猫犬血液样本中弓形虫进行检测,统计浙江省五市流浪猫犬中弓形虫阳性率。2.原核表达弓形虫SAG1抗原,免疫骆驼,构建弓形虫SAG1纳米抗体文库,淘选获得高亲和力的弓形虫SAG1纳米抗体,并表达鉴定。方法1.结合LAMP和LFD方法,优化反应体系,设计LAMP-LFD分子检测装置,建立弓形虫LAMP-LFD分子检测方法,鉴定LAMP-LFD方法的特异性、灵敏度。2.利用建立的LAMP-LFD方法对浙江省五座城市流浪猫犬的318份血液样本中弓形虫循环DNA进行检测,统计分析浙江省流浪猫犬中弓形虫阳性率。3.构建pET-28a-Sag1载体,原核表达弓形虫SAG1抗原,纯化、复性、鉴定后免疫骆驼,利用巢式PCR技术扩增骆驼淋巴细胞中VHH序列,构建抗弓形虫SAG1纳米抗体文库。4.利用噬菌体展示技术,淘选抗弓形虫SAG1纳米抗体,并进行原核表达纯化,免疫杂交分析、鉴定。结果1.成功建立了LAMP-LFD方法检测弓形虫529-RE,通过LFD试纸条读取LAMP反应结果,可在1 h内最低检出1 fg弓形虫全基因组中的529-RE,且与猪隐孢子虫、利什曼原虫、间日疟原虫、溶组织内阿米巴、伊氏锥虫等寄生虫无交叉反应。建立的LAMP-LFD方法检测弓形虫529-RE序列的灵敏度是PCR是PCR方法的100倍。LAMP-LFD检测浙江省五座城市318例流浪猫犬血液样本中弓形虫,其中流浪猫血液样本105份,流浪犬血液样本213份,分别检出率为4.76%（5/105）、4.69%（10/213）。2.成功原核表达了弓形虫SAG1蛋白,并免疫骆驼,制备了3.2×108菌库库容的抗弓形虫SAG1纳米抗体文库。通过噬菌体展示技术,筛选得到8个阳性的Anti-SAG1-Nbs,Western Blot显示均能与重组的弓形虫SAG1抗原反应。其中一株Anti-SAG1-Nb-5能同时与重组的弓形虫r SAG1抗原、天然弓形虫抗原反应,测定其与重组r SAG1抗原之间的亲和常数为1.66×10-9 mol/L。结论1.成功构建了弓形虫循环DNA的LAMP-LFD的分子诊断方法,具有良好的特异性和较高的灵敏度。该检测装置具备良好的气密性和便携性,适用于弓形虫的简便、高效的分子检测。2.利用LAMP-LFD方法对浙江省五市流浪猫犬血液中弓形虫进行检测,弓形虫检出率高于常规PCR方法。3.成功制备了弓形虫SAG1纳米抗体文库,并筛选、表达出具有高亲和力的纳米抗体,为弓形虫的抗原检测方法的建立奠定了基础。
赵旭[2]（2019）在《弓形虫假定钙离子结合蛋白质（TGME49＿229480）功能的初步分析》文中研究指明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种可以感染有核细胞的顶复门类寄生原虫。人畜食入被弓形虫卵囊或包囊污染/感染的食物从而感染弓形虫疾病,在中间宿主体内以二分裂的方式进行繁殖。弓形虫病可以引起孕妇及妊娠母畜流产、死胎等症状。猪感染弓形虫可造成60%死亡率。近年来,随着弓形虫感染率的不断上升,筛选有效抗弓形虫药物靶标成为亟待解决的问题。钙离子作为第二信使参与多种途径的调控,前期研究发现弓形虫体内存在钙调蛋白家族、钙依赖性蛋白激酶和类钙调神经神经素B亚基蛋白,钙离子结合蛋白家族中的某些钙调蛋白质可以与弓形虫体内的Myosin H（Myo H）蛋白质相互作用,两者的作用参与了弓形虫的运动和入侵宿主细胞等生理活动。本课题首先对弓形虫基因组序列进行生物信息学分析和预测发现:Putative Calcium Binding Protein（TGME49＿229480）在不同毒力虫株间具有高度保守性,且含有多个钙离子结合结构域,与报道的钙调蛋白质在结构上有高度的相似性。由此提出科学问题:pCaBP是否能与弓形虫肌球蛋白质（Myosin H,Myos H）发生结合,该蛋白质在虫体入侵宿主细胞的过程中发挥了怎样的作用?就此,本课题对其功能进行了深入性研究。通过原核表达载体分别构建了含有HIS及GST标签的两种重组表达质粒,并诱导表达、纯化了相应的重组蛋白质。通过间接免疫荧光发现,pCaBP在RH株及ME49株虫体内表达,该蛋白质均分布在虫体的细胞浆内;通过Western-Blot及Real-Time PCR检测发现,该蛋白质在不同虫株中的转录和表达水平存在差异性,毒力较强的RH株的表达水平偏低;通过分子互作实验发现,弓形虫中Myo H蛋白质与虫体内pCaBP发生结合,以上实验为进一步研究pCaBP功能奠定基础。
赵旭,张婷,桑晓宇,杨娜,冯颖,王瑶,陈启军,姜宁[3]（2017）在《弓形虫表膜抗原SAG1的研究及应用进展》文中提出刚地弓形虫是一种原生动物,被其感染后引起一系列的病理变化和症状。刚地弓形虫表膜抗原SAG1是一类重要的膜蛋白,研究发现其表膜抗原SAG1在制备单克隆抗体、疫苗和临床快速诊断等方面都有着重要的作用。本文主要就弓形虫表膜抗原SAG1的分子生物学信息、SAG1在机体内的免疫应答和应用研究进行综述。
宋慧琦[4]（2016）在《检测犬弓形虫感染ELISA和胶体金试纸条方法的建立》文中研究说明弓形虫属于细胞内寄生原虫。弓形虫病是一类由弓形虫引起的对绝大多数脊椎动物包括人在内的具有严重危害的人兽共患疾病。弓形虫可以自然感染人、犬等是数百种动物。由于犬数量庞大,且与人的关系最为密切,所以犬弓形虫感染率与人的感染率息息相关。针对弓形虫病的研究技术众多,但因免疫学诊断方法敏感性高、特异性强、简便实用,所以应用广泛。本研究以犬作为研究对象,利用免疫学诊断技术建立检测犬弓形虫感染的方法。本试验成功建立了以SAG3重组蛋白为抗原用以检测犬血清弓形虫SAG3抗体的间接ELISA方法;和用42#抗弓形虫SAG3单抗为捕获抗体、29#抗弓形虫SAG3单抗作为检测抗体的检测犬弓形虫CAg的双抗体夹心ELISA的方法;以及用42#抗弓形虫SAG3单抗为捕获抗体、29#抗弓形虫SAG3单抗作为检测抗体用以检测犬弓形虫CAg的胶体金试纸条方法。3个试验得到的结果如下:1.犬弓形虫感染的间接ELISA检测方法的建立。借助于棋盘滴定法确定抗原的包被浓度和阳性血清稀释度;再对该方法的封闭剂以及封闭时间、犬弓形虫阳性血清孵育的时间、二抗的工作浓度以及显色液的孵育时间等各项条件进行优化;并采用优化后ELISA方法检验其敏感性;借助于犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清检测该ELISA方法的特异性;同时检验该ELISA方法的重复性;运用所建立的间接ELISA方法对87份样品血清进行检测。结果如下,该间接ELISA最佳优化条件分别是:抗原的包被浓度和阳性血清稀释度分别为0.82μg/孔,阳性血清稀释度1:20;封闭剂为10%胎牛血清的PBST溶液;最佳封闭时间和阳性血清作用时间分别为2 h和1.5 h;兔抗犬酶标二抗稀释度1:8000;底物最佳显色孵育时间为10 min。优化的ELISA敏感性为1:1280;与犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清之间均无交叉反应;批内批间重复性试验的变异系数均于15%以下。经该ELISA方法对所有样品血清检测可得血清阳性率为18.39%（16/87）。2.检测犬弓形虫感染双抗体夹心ELISA方法的建立。利用HRP标记试剂盒标记29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体即检测抗体并检测标记结果;借助于棋盘滴定法确定42#抗弓形虫SAG3单抗即捕获抗体的包被浓度和参考阳性血清的稀释度;再对该方法的封闭剂以及封闭剂的作用时间、犬弓形虫参考阳性血清孵育的时间、检测抗体的工作浓度以及显色液的孵育时间等各项条件进行优化;随后采用优化后ELISA方法检验其敏感性;采用犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清检测该ELISA方法的特异性;同时检验该ELISA方法的重复性,ELISA包被板保存4oC中,分别于15d、30d、60d以及90d后取出检测其稳定性;用所建立的双抗体夹心ELISA方法对76份样品血清进行检测。结果如下,本试验成功标记检测抗体;该方法最佳优化条件分别是:捕获抗体的包被浓度和参考阳性血清的稀释度分别为1∶800稀释（0.34μg/孔）和1∶12;封闭剂为10%胎牛血清的PBST溶液;最佳封闭时间和CAg血清作用时间均为2 h;检测抗体稀释度1∶3000。优化的ELISA敏感性为1∶48;与犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清及犬巴贝斯虫阳性血清之间均无交叉反应;批内批间重复性试验的变异系数均于15%以下;保存于4oC中的ELISA包被板稳定性至少可达到90 d以上;经该双抗体夹心ELISA方法对76样品血清检测可得检出率为5.26%（4/76）。3.犬弓形虫感染胶体金试纸条的研制。该试验主要对金标蛋白pH值、硝酸纤维膜的选择、弓形虫参考阳性血清稀释度以及试纸条检测线T线和质控线C线条件的等条件进行优化;并采用优化的胶体金试纸条方法检验其敏感性;采用犬的心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫阳性血清检测该胶体金试纸条方法的特异性;同时检验该方法的重复性;再用所建立的胶体金试纸条方法对76份样品血清进行检测,并与建立的双抗体夹心ELISA所检测样品结果进行比较。结果如下,该胶体金试纸条方法最佳优化条件分别为:0.02 M K2CO3 4μL;密理博135 NC膜为最佳选择且流速大约为40 mm/7 min;参考阳性血清工作浓度为1∶8;T线、C线抗体稀释度均为0.5μg/μL;优化的胶体金试纸条方法的敏感性为1∶64;与犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清及犬巴贝斯虫阳性血清与弓形虫参考阳性血清均无特异性反应;批内批间重复性较好。用胶体金试纸条方法检测76份样品血清样本,结果显示检出率为5.26%（4/76）。通过与双抗体夹心ELISA检测的检出率5.26%（4/76）相比较,结果显示两种试验方法对犬弓形虫血清CAg诊断相符率100%,说明该胶体金试纸条方法可靠性强,兼备简便、快速的优点,更适于在基层推广使用。
张雅岭[5]（2014）在《弓形虫病免疫胶体金诊断试纸条的研制》文中认为弓形虫（T.gondii）病是一种呈世界性分布的人畜共患病,人群感染普遍,对孕妇和免疫力低下者,危害很大;200多种动物都能感染该病,多数呈隐性感染,但猪暴发感染弓形虫后,可引起大批死亡。弓形虫病严重威胁着人类的健康,同时也给畜牧业造成了很大的损失。目前,临床上诊断弓形虫病,依赖于血清学诊断,主要包括间接血凝试验、间接荧光抗体试验、染色试验和酶联免疫吸附试验,但这些免疫检测技术费时、费力,还需要特殊仪器设备辅助,不适合大面积推广应用。胶体金技术是一种新型快速诊断技术,已经在弓形虫病的诊断上得到使用,临床检测时操作简便、快速,无需相关专业的技术人员和贵重的仪器设备,适合于基层大面积检测、普查等,从而得到了快速发展。临床上诊断弓形虫病时经常检测血清中的抗体,但是抗体可以在体内长期存在,不能区分现症感染或既往感染,而弓形虫循环抗原存在于急性感染弓形虫病的血清中,适合急性病的诊断。本研究利用胶体金标记技术,运用免疫学方法,根据层析原理,结合单克隆抗体制备和选用新材料等多种方法,建立了一种新的检测弓形虫循环抗原的试纸条诊断方法。利用本实验室制备和保存的D5和B6两株杂交瘤细胞株,分别制备、纯化抗弓形虫P30蛋白和速殖子的单克隆抗体,同时制备弓形虫可溶性速殖子抗原。制备胶体金并标记单抗D5,在NC膜的检测线（T线）和质控线（C线）上分别包被B6单抗和羊抗鼠IgG二抗,经过一系列条件的优化,研制出了弓形虫病免疫胶体金诊断试纸条。经试纸条敏感性检测,可检出1:1000倍稀释的弓形虫阳性血清。与伊氏锥虫VSG抗原、大片吸虫ES抗原、横川后殖吸虫分泌抗原、异尖线虫分泌抗原均无交叉反应。建立弓形虫感染小鼠的动物模型,分别用试纸条和已建立的双抗体夹心ELISA方法检测64份小鼠血清中循环抗原,符合率为93.8%;用这两种方法对在广西采集的80份猪血清分别检测,符合率为98.8%,两者比较一致,结果证明建立的试纸条诊断方法灵敏、特异,另外该方法具有简便、快速、适合现场检测、结果易于判定和基层普通人员即可使用等优点。这种新方法的建立为弓形虫病现症、现场的诊断提供了新的方法,对临床上更有效的防治弓形虫病具有重要的意义。
刘明如[6]（2012）在《弓形虫单克隆抗体的制备及生物学活性的初步鉴定》文中认为刚地弓形虫（T.gondii）是一种全球性的人畜共患寄生虫,该种寄生虫病的流行与传播不仅严重地影响着畜牧业的可持续发展,同时也对人类的生命与健康造成严重的威胁及危害。本实验目的在于利用分子生物学中的蛋白表达技术及单克隆抗体的制备等分子及免疫学相关技术,选用弓形虫速殖子抗原及膜表面主要致病性抗原P30作为免疫原,制备出弓形虫单克隆抗体为接下来建立弓形虫病快速、简便诊断方法和进一步的研究打下基础。通过对弓形虫P30基因的PCR扩增、克隆、测序,成功的构建了原核表达重组质粒pET32a-P30,并成功的诱导表达了弓形虫P30重组蛋白抗原,经纯化制备出了可溶性弓形虫P30重组蛋白抗原。同时采用小鼠腹腔收集弓形虫速殖子方法,用胰蛋白酶法纯化制备了弓形虫速殖子抗原,为后续试验提供了免疫抗原。用弓形虫P30重组蛋白抗原和弓形虫速殖子抗原分别免疫小鼠、经细胞融合,利用建立的间接ELISA方法对融合胞融克隆进行检测筛选,成功的用表达的P30蛋白制备了2株单克隆抗体杂交瘤细胞分别命名为5D5、2A1；用速殖子抗原制备了2株单克隆抗体杂交瘤细胞,分别命名为5B6、2D2。对这4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的生物学特性进行了鉴定：经间接ELISA测定5B6、2D2、5D5、2A1四株杂交瘤细胞单克隆抗体上清的效价分别为：1：800、1：1600、1：3200、1：6400；腹水效价分别为：1：104、1：104、1：105、1：105；经单克隆抗体亚型鉴定,4株单克隆抗体5B6、2D2、5D5、2A1亚型分别为：Ig G1,Ig M,Ig G1和Ig M；染色体计数结果显示：4株杂交瘤细胞染色体计数为90-110条,均大于亲本细胞；经间接ELISA检测（?）SPSS统计软件进行方差分析,四株杂交瘤细胞第一代、第十代细胞培养上清OD450值差异不显着,均能稳定分泌单克隆抗体。广西地区是人畜弓形虫病流行的地区,本实验成功的制备了抗弓形虫速殖子抗原和弓形虫P30重组蛋白抗原的单克隆抗体,并对其生物学特性进行了鉴定,为进一步研究弓形虫病的快速灵敏的诊断检测方法以及弓形虫病的免疫防治奠定了基础。
陶勇[7]（2010）在《弓形虫SAG2基因的克隆、表达及其初步鉴定》文中研究表明弓形虫病是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种重要人兽共患寄生虫病。当孕妇感染弓形虫后,容易引起早产、流产、胎儿畸形等。因此孕妇弓形虫感染的产前诊断,在优生学上意义重大。弓形虫病诊断方法大致可分为病原学检查、免疫学方法、分子生物学技术三大类。传统的病原学检查方法费时、费力,且其特异性和敏感性不高,不能适应当前弓形虫病诊断及防治的需要；分子生物学诊断技术虽然具有较高的敏感性,但由于其操作复杂或实验条件要求较高,难以推广应用；免疫学诊断方法是弓形虫感染的实验诊断的常规方法,具有敏感性高、特异性强、操作简便等优点,所以,免疫学方法仍是目前弓形虫感染的主要诊断手段。由于目前常用全虫抗原作血清学检测,其结果有时会出现假阳性,给诊断带来许多不便。本实验利用基因重组技术,研制出重组抗原,以取代全虫抗原,大大提高弓形虫感染实验室诊断的精确度和敏感度。本文根据GenBank中已公布的弓形虫SAG2的基因序列用软件自行设计一对引物,用此引物对目的基因片段进行RT-PCR扩增,用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。利用质粒提取试剂盒在大肠杆菌的DH5α中提取PGEX-4T-1质粒。然后对纯化的PCR产物与pGEX-4T-1质粒用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切,利用琼脂糖凝胶回收PCR酶切产物和质粒的酶切产物。用大连宝生的连接试剂对PCR和pGEX-4T-1的回收产物进行连接,构建pGEX-4T-1/SAG2重组质粒。用PCR结合双酶切的方法鉴定,核酸测序验证。将pGEX-4T-1/SAG2重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,然后用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE电泳检测验证后,将重组菌表达产物溶于尿素中,通过精氨酸氧化/还原型谷胱苷肽系统进行复性。复性后的蛋白再进行超滤浓缩,将浓缩后的蛋白溶液过GST亲和层析柱。并用酶标技术（ELISA间接法）和金标技术（捕获法、双抗原夹心法）对纯化的GST-SAG2融合蛋白的抗原性进行鉴定,最终获得保留天然蛋白抗原性和特异性的重组蛋白。以此作抗原,检测人血清弓形虫抗体,证明具有高度的敏感性和特异性。
曹丽艳[8]（2009）在《弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆、表达及鉴定》文中研究表明弓形虫（Toxoplasma gondii）为专性细胞内寄生原虫,能引起人兽共患弓形虫病,严重危害人类健康和畜牧业发展。弓形虫表面抗原1 （surface antigen 1,SAG1）是位于弓形虫速殖子表面的特异性蛋白,也是最早被克隆测序的弓形虫表面蛋白,SAG1因为在诊断和免疫中具有双重价值而得到广泛研究。根据GenBank数据库中的弓形虫RH株表面抗原1（SAG1）基因序列设计1对引物,应用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增SAG1基因片段,克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-SAG1。测序结果表明获得1011 bp的SAG1基因片段,编码336个氨基酸,与已知的SAG1基因核苷酸序列（序列号S76248）及其编码氨基酸序列的同源性分别为98.9%、97.3%。重新设计一对从SAG1蛋白强抗原表位开始的引物,将SAG1基因片段定向亚克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒pET-SAG1转化至E. coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达。表达产物用SDS-PAGE进行鉴定,结果表明SAG1基因片段在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,分子量大小约为35 kD,Western-blot鉴定结果表明,表达产物可以被羊抗弓形虫阳性血清所识别。重组抗原经纯化和复性后免疫小鼠,间隔两周,免疫三次,最后一次免疫后1W对小鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染。对抗血清进行间接ELISA检测,结果小鼠免疫后产生了较高滴度的特异性抗体,虽然与对照组相比免疫组小鼠存活时间有一定的延长,但差异无显着性。为了获得与天然SAG1蛋白构型接近的重组蛋白,另外设计一对引物扩增SAG1的基因片段。PCR产物经纯化、酶切后定向插入pcDNA3.1真核表达载体,转化至大肠杆菌DH5α,经酶切及PCR鉴定后进行测序。结果表明,从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增出1008 bp的特异SAG1片段,大小与预测值相符。pcDNA-SAG1的成功构建,为进一步在细胞中的表达及弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。
安立刚[9]（2009）在《弓形虫重组SAG1可溶性表达、鉴定及单克隆抗体的制备》文中提出弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种机会性致病原虫,分布广泛,是严重危害的人畜共患病之一。因此,弓形虫病的诊断,尤其是弓形虫现症感染的及时诊断成为弓形虫病防治工作的重点。SAG1蛋白是弓形虫速殖子期特异性抗原,其约占速殖子总蛋白量的5%, SAG1对虫体侵入宿主细胞及其毒力具有重要性,并有高度免疫原性和免疫保护性,被用于弓形虫疫苗的研制和弓形虫感染的分子诊断。但SAG1蛋白是一个高度构象依赖的蛋白,其空间结构的形成主要依赖二硫键的正确连接。原核表达系统（如大肠杆菌）缺乏蛋白质翻译后的修饰功能,因此过去在大肠杆菌中获得的重组SAG1蛋白大都形成包涵体,表达产物由于错误折叠而不具有特异的免疫反应性,需经复杂的变性、复性过程才能恢复部分活性。本研究尝试在大肠杆菌中进一步以可溶性形式表达成熟SAG1蛋白片段,期待表达的重组蛋白无需复性即能具有良好的免疫活性,探讨重组蛋白作为新型诊断抗原的可能性;并且进一步研制针对重组SAG1蛋白的单克隆抗体,为建立一套弓形虫感染的新型诊断体系打基础。目的:1在大肠杆菌中高效表达及纯化获得可溶性、有免疫反应活性的弓形虫表面抗原SAG1（以截短型片段tSAG1表达）2制备抗重组tSAG1蛋白的单克隆抗体,为研发弓形虫ELISA诊断试剂盒奠定基础。方法:构建重组质粒pET-32a-tSAG1并将其转化大肠埃希菌BL21（DE3）表达菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达蛋白。通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物的表达形式,通过降低培养温度、降低摇床转数和升高LB液体培养基pH的方法,诱导目的蛋白在上清中表达,表达产物以His?Bind? Kit试剂盒对目的蛋白进行纯化,Western- blot和ELISA检测纯化蛋白的反应原性。在IPTG为1mmol/L、温度37℃条件下,tSAG1以融合蛋白（His-tSAG1）的形式在大肠埃希菌中高效表达,表达产物以包涵体形式存在。在22℃和LB培养基pH为7.7条件下,融合蛋白主要在上清中表达。Western-blot和ELISA分析纯化蛋白能被弓形虫的阳性血清所识别。tSAG1在大肠埃希菌中得到了可溶性蛋白表达,经纯化后能被弓形虫的阳性血清所识别,可用于制备检测弓形虫病的诊断试剂。以融合蛋白（His-tSAG1）蛋白免疫BALB/c小鼠,分离免疫小鼠的脾细胞,在聚乙二醇的作用下与骨髓瘤细胞SP2/0融合,融合后的细胞进行HAT选择培养,10～20天后筛选阳性克隆。用pET单体蛋白和重组tSAG1包被ELISA板,间接酶联免疫试验检测杂交瘤细胞培养上清,阳性克隆经亚克隆建株。降植烷预处理小鼠后,腹腔注射状态良好的杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备抗体,7～10天后即可收获腹水。对腹水中的McAb先用硫酸铵沉淀法进行粗提,然后用免疫亲和层析法进一步纯化。快速定性试纸法测定其亚类,ELISA法测定腹水和纯化后抗体的效价,进行IFA、SDS-PAGE和Western blotting分析。结果: 1.克隆了截短形式的tSAG1基因,构建了表达型重组质粒pET32a-tSAG1,测序结果显示读码框架正确。2.在大肠杆菌中以可溶性形式表达了SAG1基因截短片段,与弓形虫速殖子阳性血清Western-blot结果显示重组蛋白具有良好的反应原性。3.筛选了4株针对tSAG1蛋白的单克隆抗体,IFA、ELISA和Western-blot结果显示4株单克隆抗体与tSAG1抗原、弓形虫速殖子天然SAG1均具有良好的反应,它们所针对的表位分属于两个不同表位。结论:1.弓形虫表面抗原SAG1截短型片段（tSAG1）在大肠杆菌中得到可溶性表达,经免疫反应性鉴定和初步应用试验,表明重组SAG1蛋白具有良好的反应原性和应用前景。2.制备了抗截短形式重组tSAG1蛋白的单克隆抗体,经鉴定4株单抗均能识别天然SAG1蛋白,具有潜在的诊断价值。
张理航[10]（2008）在《刚地弓形虫NT株P30基因的克隆与表达及其ELISA检测方法的建立》文中提出弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生的医学原虫,能感染几乎所有恒温动物（包括人类）,引起弓形虫病。在免疫功能正常的宿主体内通常形成包囊,造成隐性感染;但当宿主免疫功能下降时（如肿瘤患者、器官移植者及AIDS患者等）,弓形虫可在宿主体内播散引起弓形虫病甚至导致宿主死亡。弓形虫感染也是家畜家禽流产、畸胎、死产的主要原因之一,对畜牧业生产危害严重。刚地弓形虫膜表面蛋白1（SAG1）是弓形虫速殖子期特异性抗原,能够诱导机体产生IgG、IgM、IgA抗体和CD8+T细胞杀伤弓形虫。已有研究表明,弓形虫的主要表面抗原1具有很强的免疫原性,是弓形虫诊断和疫苗研究的重要候选抗原分子。SAG1抗原在原虫含量较低,因此用基因工程技术在体外表达P30蛋白,然后利用该蛋白作抗原,建立刚地弓形虫ELISA抗体检测方法。本实验参考Genbank登录的刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）P30全基因序列,设计合成一对引物,通过PCR在刚地弓形虫的基因组DNA中扩增出P30的相应片段,然后构建T-A克隆,经PCR扩增和酶切鉴定后进行测序。再亚克隆到原核表达载体pET-32a（+）中,构建了重组质粒pET-32a（+）/P30并转化DH5α感受态细胞,于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆,再经PCR扩增和酶切鉴定重组质粒。然后将重组质粒pET-32a（+）/P30转化表达菌BL21（DE3）,用IPTG诱导成功表达出分子量为48.3kDa的融合蛋白,经Western-blotting鉴定目的蛋白具有良好的免疫学活性,为研究重组蛋白的免疫原性奠定了基础。重组T.gondii P30蛋白经过镍柱纯化后,作为抗原包被聚苯乙烯微量反应板,初步建立了猪弓形虫抗体的间接ELISA检测方法。对ELISA的最佳反应条件进行优化,结果表明T.gondii P30蛋白抗原的最适包被浓度为2.75μg/ml,最适封闭液为5%脱脂乳,检测血清稀释度为1:640,抗原和抗体的作用时间为1h,HRP-兔抗猪IgG的最适工作浓度为1:2000,最佳显色时间为15min,用2M H2SO4为终止液,确定阴阳性的临界值为0.384。包被的重组蛋白均不与猪瘟、猪蓝耳、猪圆环病的阳性血清发生交叉反应;用此建立的ELISA方法与IHA方法符合率达90.17%;表明建立的ELISA诊断方法具有良好的特异性和稳定性。本研究建立的间接ELISA方法,为试剂盒的研制与开发奠定了前期工作基础,并为我国进行猪弓形虫病的诊断与血清学监测和调查提供了一种技术手段。
二、抗弓形虫表膜抗原 P30单克隆抗体的制备与鉴定(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗弓形虫表膜抗原 P30单克隆抗体的制备与鉴定(英文)（论文提纲范文）
（1）刚地弓形虫LAMP-LFD检测方法的建立、初步应用及抗弓形虫SAG1纳米抗体的制备、分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分:刚地弓形虫LAMP-LFD检测方法的建立、初步应用 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论与建议 |
| 第二部分:抗弓形虫SAG1 纳米抗体的制备、分析 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论与建议 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述及参考文献 弓形虫病分子诊断方法的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件1 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附件2 攻读学位期间参与的项目及学术交流 |
（2）弓形虫假定钙离子结合蛋白质（TGME49＿229480）功能的初步分析（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 弓形虫入侵宿主细胞 |
| 1.2 纳虫空泡的形成 |
| 1.3 钙离子结合蛋白对弓形虫入侵的作用 |
| 1.3.1 钙调蛋白家族(Calmodulin Family,CaMs) |
| 1.3.2 钙依赖蛋白激酶(Calcium Dependent Protein Kinase,CDPKs) |
| 1.3.3 类钙调神经素B亚基蛋白(CBL) |
| 1.3.4 总结 |
| 1.4 本课题研究的目的及意义 |
| 第二章 弓形虫pCaBP的生物信息学分析 |
| 2.1 生物信息学软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 查询目的基因 |
| 2.2.2 基因完整性预测 |
| 2.2.3 基因序列的下载 |
| 2.2.4 蛋白质保守性预测 |
| 2.2.5 蛋白质功能域的绘画 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 弓形虫pCaBP的生物信息学分析 |
| 2.3.2 不同寄生虫种间pCaBP氨基酸序列分析 |
| 2.3.3 弓形虫pCaBP功能域 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 弓形虫pCaBP基因的原核表达、重组蛋白质的纯化及多克隆抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞及虫株 |
| 3.1.2 质粒及菌种 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 主要试剂盒 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.1.7 溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 弓形虫体外培养及收集虫体 |
| 3.2.3 虫体RNA提取 |
| 3.2.4 甲醛变性电泳 |
| 3.2.5 RNA反转录成cDNA |
| 3.2.6 克隆载体的构建 |
| 3.2.7 原核表达载体的构建 |
| 3.2.8 pET-28a-pCaBP及 pGEX-4T-1-pCaBP重组质粒的表达及纯化 |
| 3.2.9 制备抗pCaBP特异性血清及多克隆抗体纯化 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 弓形虫pCaBP在虫体内表达、分布及体外蛋白质互作分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞及虫株 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 荧光定量引物 |
| 4.1.6 溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 弓形虫pCaBP在 RH株与ME49 株的转录水平差异分析 |
| 4.2.2 弓形虫pCaBP在 RH株与ME49 株表达水平差异分析 |
| 4.2.3 弓形虫pCaBP在虫体内的分布 |
| 4.2.4 弓形虫pCaBP与虫体Myosin H蛋白质互作的体外分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
（3）弓形虫表膜抗原SAG1的研究及应用进展（论文提纲范文）
| 1 SAG1 (P30) 结构特点 |
| 2 SAG1诱导的免疫应答机制 |
| 3 表膜抗原SAG1的应用 |
| 3.1 临床诊断方面 |
| 3.2 预防弓形虫方面 |
| 3.2.1 自杀性DNA疫苗 |
| 3.2.2 基因工程核酸疫苗 |
| 4 展望 |
（4）检测犬弓形虫感染ELISA和胶体金试纸条方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 弓形虫病的研究进展 |
| 1.2 弓形虫相关蛋白质的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 犬弓形虫感染间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 检测犬弓形虫感染双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 犬弓形虫感染胶体金试纸条的研制 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 常用缩略语中英文对照表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（5）弓形虫病免疫胶体金诊断试纸条的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 弓形虫病 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 致病作用 |
| 1.1.5 弓形虫病的诊断 |
| 1.2 免疫胶体金技术研究进展 |
| 1.2.1 胶体金的的特性 |
| 1.2.2 胶体金制备的方法 |
| 1.2.3 胶体金试纸条层析原理 |
| 1.2.4 胶体金诊断技术优势 |
| 1.2.5 胶体金技术的临床应用 |
| 1.2.6 胶体金技术在弓形虫病诊断上的应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 弓形虫可溶性速殖子抗原、抗弓形虫单克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 弓形虫虫株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.1.5 主要仪器及设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 弓形虫速殖子抗原的制备 |
| 2.2.2 抗弓形虫单克隆抗体的制备 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 腹水中速殖子镜检结果 |
| 2.3.2 速殖子可溶性抗原、纯化后的单抗D5、B6浓度 |
| 2.3.3 D5、B6单抗亚型鉴定 |
| 2.3.4 D5、B6单抗效价的测定 |
| 2.3.5 D5、B6单抗纯度的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 速殖子抗原与单抗的制备 |
| 2.4.2 弓形虫的复苏与冻存 |
| 2.4.3 超声破碎全虫抗原 |
| 2.4.4 杂交瘤细胞的复苏 |
| 2.4.5 两株单抗的纯化 |
| 第三章 弓形虫病免疫胶体金诊断试纸条的研制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要试剂配制 |
| 3.1.3 主要仪器及设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 玻璃试剂瓶的清洗 |
| 3.2.2 胶体金溶液的制备 |
| 3.2.3 胶体金质量鉴定 |
| 3.2.4 胶体金稳定性试验 |
| 3.2.5 单抗中盐离子和杂质的去除 |
| 3.2.6 胶体金标记最佳PH值的优化 |
| 3.2.7 胶体金标记最适蛋白用量的优化 |
| 3.2.8 单抗的标记与纯化 |
| 3.2.9 金标单抗活性的鉴定 |
| 3.2.10 试纸条制备 |
| 3.2.11 试纸条质量的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胶体金溶液的制备 |
| 3.3.2 胶体金溶液的质量鉴定 |
| 3.3.3 胶体金溶液保存稳定性结果 |
| 3.3.4 胶体金粒径选择结果 |
| 3.3.5 胶体金标记单抗的优化 |
| 3.3.6 金标单抗活性的鉴定 |
| 3.3.7 试纸条制备 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 免疫胶体金诊断试纸条的研制 |
| 3.4.2 金颗粒制备与鉴定 |
| 3.4.3 影响胶体金标记的因素 |
| 3.4.4 试纸条各部分材料的筛选 |
| 3.4.5 检测线与质控线的包被量 |
| 3.4.6 缓冲液的作用 |
| 3.4.7 免疫胶体金技术展望 |
| 第四章 检测弓形虫循环抗原双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 血清样品 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器及设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 兔多抗IgG的制备 |
| 4.2.2 检测弓形虫循环抗原双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立 |
| 4.2.3 双抗夹心ELISA方法建立条件的优化 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 兔多抗效价的测定 |
| 4.3.2 双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 4.4.2 单抗与循环抗原的反应性 |
| 4.4.3 双抗体夹心ELISA方法检测循环抗原的意义 |
| 第五章 弓形虫病免疫胶体金试纸条诊断效果的评估与初步应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 待测血清样本 |
| 5.1.3 主要仪器及设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 弓形虫循环抗原血清样本的采集 |
| 5.2.2 试纸条诊断效果的评估 |
| 5.2.3 试纸条的初步应用 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 试纸条诊断结果评估 |
| 5.3.2 试纸条的初步应用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 胶体金诊断试纸条的应用价值 |
| 5.4.2 检测感染弓形虫动物血清中循环抗原的意义 |
| 5.4.3 试纸条检测猪血清循环抗原的初步应用 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（6）弓形虫单克隆抗体的制备及生物学活性的初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 弓形虫病概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学及危害 |
| 1.1.3 检测方法 |
| 1.1.4 弓形虫病的防治 |
| 1.2 弓形虫主要抗原基因 |
| 1.3 弓形虫单克隆抗体 |
| 1.4 本实验的目的及意义 |
| 第二章 弓形虫P30蛋白的原核表达及弓形虫速殖子抗原的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 抗弓形虫P30重组蛋白及速殖子抗原单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 细胞株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 试验用试剂配制 |
| 3.1.5 主要仪器设备及耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 间接ELISA方法检测小鼠血清效价 |
| 3.2.2.1 间接ELISA方法反应条件的优化 |
| 3.2.2.2 间接ELISA方法检测小鼠血清效价 |
| 3.2.3 细胞融合 |
| 3.2.3.1 饲养细胞的制备 |
| 3.2.3.2 骨髓瘤细胞的准备 |
| 3.2.3.3 免疫脾细胞的制备 |
| 3.2.3.4 细胞融合 |
| 3.2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.5 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.6.1 杂交瘤细胞的冻存 |
| 2.2.6.2 杂交瘤细胞的复苏 |
| 3.2.7 单克隆抗体的制备 |
| 3.2.7.1 细胞培养上清的制备 |
| 3.2.7.2 单抗小鼠腹水的制备 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 间接ELISA方法检测小鼠血清效价 |
| 3.3.1.1 间接ELISA方法反应条件的优化 |
| 3.3.1.2 免疫小鼠血清效价的测定 |
| 3.3.2 细胞融合 |
| 3.3.2.1 饲养细胞的制备 |
| 3.3.2.2 骨髓瘤细胞的准备 |
| 3.3.2.3 细胞融合 |
| 3.3.3 杂交瘤细胞的形态观察 |
| 3.3.4 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 |
| 3.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 抗弓形虫单克隆抗体生物学特性的鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 试验用试剂配制 |
| 4.1.3 主要仪器设备及耗材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 单克隆抗体杂交瘤细胞及小鼠腹水效价的测定 |
| 4.2.2 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 4.2.3 单克隆抗体杂交瘤细胞的染色体分析 |
| 4.2.4 单克隆抗体杂交瘤细胞的稳定性鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水效价的测定 |
| 4.3.2 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 4.3.3 单克隆抗体杂交瘤细胞染色体分析 |
| 4.3.4 杂交瘤细胞的稳定性检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）弓形虫SAG2基因的克隆、表达及其初步鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 前言 |
| 第一部分 SAG2基因片段的克隆及重组质粒的鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料及来源 |
| 1.2 生化试剂及部分配制方法 |
| 1.3 仪器设备及生产厂家 |
| 1.4 试剂盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 弓形虫速殖子的提取以及纯化 |
| 2.2 弓形虫总RNA的提取 |
| 2.3 弓形虫cDNA的合成 |
| 2.4 引物设计与合成 |
| 2.5 PCR扩增反应 |
| 2.6 PCR产物的琼脂糖电泳 |
| 2.7 PCR产物的纯化 |
| 2.8 pGEX-4T-1载体质粒DNA的提取 |
| 2.9 PCR纯化产物与载体质粒DNA的双酶切及纯化回收 |
| 2.10 重组质粒的构建 |
| 2.11 pGEX-4T-1/SAG2重组质粒的转化 |
| 2.12 pGEX-4T-1/SAG2重组质粒的PCR筛 |
| 2.13 pGEX-4T-1/SAG2重组质粒的鉴定 |
| 2.14 pGEX-4T-1/SAG2重组质粒的保种 |
| 结果 |
| 1. 弓形虫速殖子的纯化 |
| 2. 弓形虫总RNA的分析和定量 |
| 3. PCR产物的琼脂糖电泳 |
| 4. PCR产物的纯化 |
| 5. pGEX-4T-1质粒载体DNA的提取 |
| 6. PCR纯化产物与质粒载体DNA的双酶切及纯化回收 |
| 7. 重组质粒的构建 |
| 8. pGEX-4T-1/SAG2重组质粒的PCR筛选 |
| 9. pGEX-4T-1/gG_1重组质粒的双酶切鉴定 |
| 10. pGEX-4T-1/gG_1重组质粒的DNA测序鉴定 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 GST/SAG2融合蛋白的表达、复性及纯化 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料及来源 |
| 1.2 生化试剂及部分配制方法 |
| 1.3 仪器设备及生产厂家 |
| 1.4 试剂盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 pGEX-4T-1/SAG2重组质粒转化入表达宿主菌 |
| 2.2 pGEX-4T-1/SAG2重组质粒的诱导表达 |
| 2.3 表达产物的SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.4 表达产物的定位 |
| 2.5 表达产物的洗涤 |
| 2.6 表达产物的复性以及超滤浓缩 |
| 2.7 表达产物的纯化 |
| 结果 |
| 1. 表达产物的SDS-PAGE电泳检测 |
| 2. 表达产物的纯化 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SAG2重组蛋白的初步鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料及来源 |
| 1.2 生化试剂及部分配制方法 |
| 1.3 仪器设备及生产厂家 |
| 2 方法 |
| 2.1 SAG2重组抗原包涵体的ELISA检测 |
| 2.2 GST/SAG2融合蛋白的ELISA检测 |
| 2.3 金标捕获法检测SAG2重组抗原 |
| 2.4 金标双夹心抗原法检测SAG2重组抗 |
| 2.5 弓形虫全抗原以及重组抗原检测人特异性IgG水平 |
| 结果 |
| 1. GST-SAG2包涵体蛋白的ELISA检测 |
| 2. SAG2重组蛋白的ELISA检测结果 |
| 3. 金标捕获法鉴定SAG2融合蛋白 |
| 4. 金标双抗原夹心法鉴定SAG2融合蛋白 |
| 5. 弓形虫全虫抗原或重组抗原检测人血清中特异性IgG水平 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆、表达及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 弓形虫表面抗原1(SAG1)的研究进展 |
| 1 SAG1(P30)基因和蛋白结构 |
| 2 SAG1(P30)与弓形虫侵入细胞的关系 |
| 3 SAG1(P30)蛋白诱导的免疫作用 |
| 4 SAG1(P30)在弓形虫病诊断方面的应用 |
| 5 SAG1(P30)在弓形虫疫苗研制中的应用 |
| 6 结语 |
| 第二章 弓形虫GJS 株表面蛋白1（SAG1）基因的克隆、表达 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 弓形虫GJS 株速殖子 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 质粒和菌株 |
| 1.4 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 弓形虫基因组 DNA 的提取 |
| 2.2 目的基因 SAG1 的扩增 |
| 2.3 克隆载体的构建 |
| 2.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 表达载体的构建 |
| 2.6 重组质粒的鉴定 |
| 2.7 重组质粒的诱导表达 |
| 2.8 表达产物的SDS－PAGE 电泳检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的片断的扩增 |
| 3.2 pMD-SAG1 重组质粒的鉴定 |
| 3.3 重组质粒的测序鉴定及序列分析 |
| 3.4 物理化学特性分析 |
| 3.5 弓形虫SAG1 蛋白分子的结构预测 |
| 3.6 pET-SAG1 重组质粒的鉴定 |
| 3.7 SAG1 基因表达产物SDS-PAGE 分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 重组蛋白的纯化及功能分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 SAG1 基因的大量表达 |
| 2.2 包涵体的提取 |
| 2.3 包涵体的纯化 |
| 2.4 重组蛋白rSAG1 的Western Blot 鉴定 |
| 2.5 动物试验及攻击感染 |
| 2.6 ELISA 检测抗融合蛋白血清 |
| 3 结果 |
| 3.1 表达产物的定性分析 |
| 3.2 重组蛋白包涵体的纯化 |
| 3.3 重组蛋白rSAG1 抗原性分析 |
| 3.4 弓形虫GJS 株速殖子攻击感染后免疫小鼠存活时间 |
| 4 讨论 |
| 第四章 弓形虫GJS 株表面抗原1 基因的真核表达质粒的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 弓形虫GJS 株速殖子 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 质粒和菌株 |
| 1.4 酶和试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 弓形虫基因组DNA 的提取 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 目的片段的扩增 |
| 2.4 PCR 产物的回收与纯化 |
| 2.5 目的片段与pCDNA3.1 载体的酶切回收 |
| 2.6 目的片段与表达载体的连接转化 |
| 2.7 重组质粒的提取与鉴定 |
| 2.8 序列测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 SAG1 基因获得结果 |
| 3.2 pcDNA3.1- SAG1 重组质粒的PCR 及酶切鉴定 |
| 3.3 pcDNA3.1- SAG1 重组质粒的测序结果及分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）弓形虫重组SAG1可溶性表达、鉴定及单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 弓形虫病的危害的基本特征 |
| 1.2 弓形虫 SAG1 基因结构 |
| 1.3 弓形虫SAG1 的主要的生物学作用 |
| 1.4 弓形虫SAG1 抗原的运用性研究 |
| 1.5 SAG1 抗原相关的弓形虫病诊断方法的研究 |
| 1.6 本研究的意义 |
| 第二章 弓形虫表面抗原 SAG1 截短型片段(TSAG1)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 抗重组SAG1 蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简 历 |
（10）刚地弓形虫NT株P30基因的克隆与表达及其ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 1 弓形虫的发现史 |
| 2 弓形虫的病原学与生活史 |
| 3 弓形虫的P30 蛋白研究进展 |
| 3.1 P30 蛋白的鉴定及结构特点 |
| 3.2 P30 蛋白的免疫作用 |
| 3.3 P30 蛋白的免疫学特点 |
| 3.4 P30 抗原的分子生物学研究 |
| 3.5 P30 在弓形虫入侵宿主细胞过程中的作用 |
| 4 弓形虫病的诊断方法 |
| 4.1 病原学诊断 |
| 4.2 血清学诊断 |
| 4.3 分子生物学诊断研究进展 |
| 5 猪弓形虫NT 株与NTA 株 |
| 6 本研究的目的及意义 |
| 试验一 刚地弓形虫NT 株P30 基因的克隆与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 T.GONDII P30 基因片段PCR 扩增 |
| 2.2 T/A 克隆的鉴定 |
| 2.3 重组质粒PET-32A(+)/P30 的鉴定 |
| 2.4 重组蛋白的SDS-PAGE 结果 |
| 2.5 表达产物产量的扫描分析 |
| 2.6 重组蛋白的存在状态分析 |
| 2.7 重组蛋白的表达条件的优化 |
| 2.8 重组蛋白的纯化结果 |
| 2.9 重组蛋白的免疫印迹分析 |
| 3 讨论 |
| 试验二 刚地弓形虫抗体ELISA 检测方法的初步建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 间接ELISA 与间接血凝试验的比较 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白浓度的测定 |
| 2.2 ELISA 反应条件的优化 |
| 2.3 阴阳性临界值的判定 |
| 2.4 特异性试验 |
| 2.5 重复性试验 |
| 2.6 包被板的保存期测定 |
| 2.7 间接ELISA 检测程序 |
| 2.8 间接ELISA 与间接血凝试验的比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 间接ELISA |
| 3.2 间接ELISA 实验条件的摸索 |
| 3.3 用建立的间接ELISA 方法进行样品血清阴阳性的判定 |
| 3.4 ELISA 与IHA 两种检测方法符合率的比较 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
四、抗弓形虫表膜抗原 P30单克隆抗体的制备与鉴定(英文)（论文参考文献）
- [1]刚地弓形虫LAMP-LFD检测方法的建立、初步应用及抗弓形虫SAG1纳米抗体的制备、分析[D]. 薛杨继. 浙江省医学科学院, 2021
- [2]弓形虫假定钙离子结合蛋白质（TGME49＿229480）功能的初步分析[D]. 赵旭. 沈阳农业大学, 2019(03)
- [3]弓形虫表膜抗原SAG1的研究及应用进展[J]. 赵旭,张婷,桑晓宇,杨娜,冯颖,王瑶,陈启军,姜宁. 中国病原生物学杂志, 2017(07)
- [4]检测犬弓形虫感染ELISA和胶体金试纸条方法的建立[D]. 宋慧琦. 天津农学院, 2016(10)
- [5]弓形虫病免疫胶体金诊断试纸条的研制[D]. 张雅岭. 广西大学, 2014(01)
- [6]弓形虫单克隆抗体的制备及生物学活性的初步鉴定[D]. 刘明如. 广西大学, 2012(03)
- [7]弓形虫SAG2基因的克隆、表达及其初步鉴定[D]. 陶勇. 扬州大学, 2010(02)
- [8]弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆、表达及鉴定[D]. 曹丽艳. 甘肃农业大学, 2009(06)
- [9]弓形虫重组SAG1可溶性表达、鉴定及单克隆抗体的制备[D]. 安立刚. 中国农业科学院, 2009(10)
- [10]刚地弓形虫NT株P30基因的克隆与表达及其ELISA检测方法的建立[D]. 张理航. 扬州大学, 2008(02)